Extracto
Helicobacter pylori (H. pylori)
es una bacteria gram-negativa, en forma de espiral que infecta a más de medio de la población del mundo y es una causa importante de adenocarcinoma gástrico. Los mecanismos que vinculan
H. pylori
infección a la carcinogénesis gástrica no se conocen bien. En el presente estudio, mostramos que la proteína inhibidora de la quinasa Raf-(RKIP) tiene un papel en la inducción de la apoptosis por
H. pylori
en las células epiteliales gástricas. ensayos de transferencia y la transcripción de la luciferasa reportero occidentales demuestran que la isla de patogenicidad de
H. pylori
fosforila rápidamente RKIP, que luego localiza al núcleo donde activa la transcripción de su propio e induce la apoptosis. sobreexpresión forzada de RKIP potencia la apoptosis en
H. pylori
células infectadas, mientras que la inhibición de ARN RKIP suprime la inducción de apoptosis por
H. pylori
infección. Mientras que induce la fosforilación de RKIP,
H. pylori
objetivos al mismo tiempo RKIP no fosforilada de la degradación mediada por el proteosoma. El aumento en la transcripción RKIP y la fosforilación se suprime mediante la mutación de la serina 153 RKIP a la valina, lo que demuestra que la regulación de la actividad RKIP por
H. pylori
depende de residuo S153 de RKIP. Además,
H. pylori
infección aumenta la expresión de Snail, un represor transcripcional de RKIP. Nuestros resultados sugieren que
H. pylori
utiliza una proteína supresora de tumores, RKIP, para promover la apoptosis en células de cáncer gástrico
Visto:. Moen EL, Wen S, T Anwar, Cruz-Knorr S, K Brillante, Birnbaum F, et al . (2012) Reglamento de la Función RKIP por
Helicobacter pylori Hoteles en cáncer gástrico. PLoS ONE 7 (5): e37819. doi: 10.1371 /journal.pone.0037819
Editor: Yoshio Yamaoka, Veterans Affairs Medical Center (111D), Estados Unidos de América
Recibido: 30 Diciembre, 2011; Aceptado: April 24, 2012; Publicado: 25 de mayo de 2012
Derechos de Autor © 2012 Moen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Ciencias médicas generales de los Institutos nacionales de Salud bajo el premio número P20GM103421 (DC); el segmento anterior de este proyecto fue apoyado por el Centro Nacional de Recursos de Investigación (CNRR) bajo P20 RR 017695 (DC), R01 CA111533 (SFM) y R21 CA133601 (JMS). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico es el cuarto cáncer más frecuentemente diagnosticado en el mundo. En 2007, aproximadamente un millón de nuevos casos de cáncer gástrico conduce a aproximadamente 800.000 muertes en todo el mundo se registraron, por lo que es la segunda causa más común de muerte por cáncer [1]. El cáncer gástrico es actualmente la séptima causa de muerte por cáncer en los EE.UU., con aproximadamente 21.500 nuevos casos diagnosticados en 2011 (http://www.cancer.gov/cancertopics/types/stomach). El, en forma de espiral bacteria gram-negativa
Helicobacter pylori (H. pylori)
infecta a más de la mitad de la población mundial y ha sido identificado como un factor de riesgo importante en la carcinogénesis gástrica [2]. La Organización Mundial de la Salud y la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer designados como un carcinógeno de clase I en 1994 [3]. Nuestra comprensión actual de
H. pylori
carcinogénesis inducida es que la bacteria y la respuesta inflamatoria crónica asociada promover la muerte celular epitelial gástrica por apoptosis [4], con la subsiguiente hiper-proliferación [5], y la producción de radicales libres [6] todo lo cual contribuye a una secuencia lenta y progresiva de los cambios en la mucosa gástrica que en última instancia favorecen la progresión hacia el cáncer. Este modelo es coherente con los informes de que los polimorfismos de genes de citoquinas pro-inflamatorias que aumentan la intensidad de la respuesta inflamatoria se relacionan con un mayor riesgo de cáncer gástrico [7].
H. pylori
se adhiere estrechamente a las células epiteliales gástricas y puede inducir la apoptosis directamente [8]. La isla cag (gen citotóxico-asociado) patogenicidad (cagPAI) de
H. pylori
es un segmento de 40 kb de ADN que contiene genes que codifican para los componentes de un sistema de secreción de tipo IV bacteriana [9]. Dentro de esta región es el
cagA
gen que codifica CagA, una proteína inmunodominante de 121-145 kDa [9].
H. pylori
cepas que poseen y expresan el cag PAI son más a menudo asociados con la enfermedad de úlcera péptica y cáncer gástrico en la población occidental que las cepas que no [9]. Tras su inyección a través del sistema de secreción de tipo IV en las células epiteliales gástricas anfitrionas, CagA podrían llegar a ser fosforilado por las tirosina quinasas de la familia Src en su extremo C-terminal [10], CagA conduce a unirse y activar SHP2 y señal a través de ERK [11]. Es importante destacar que, CagA también es responsable de activar el transductor de señal y activador de la transcripción 3 (STAT3)
vitro
y en
in vivo
[12], aunque esto puede no ser necesariamente dependiente de la fosforilación CagA [11]
proteínas STAT se expresan constitutivamente en varias neoplasias, incluyendo gástrico, de mama, cabeza y cuello, y cánceres de próstata [13] -. [16]. Tras la fosforilación de la tirosina 705 de residuos y la acetilación en la lisina 685, dimeriza STAT3 y entra en el núcleo donde funciona para regular transcripcionalmente una amplia gama de genes [17], [18]. La activación constitutiva de la proteína STAT3 se ha demostrado para prevenir la apoptosis y aumentar la proliferación celular y la metástasis en un número de cánceres, incluyendo el cáncer gástrico [19], [20].
Una de las características de la progresión de tumor gástrico es la adquisición de fenotipos más invasivas y migratorias durante la transición epitelio-mesenquimal (EMT). Durante EMT, las células epiteliales gástricas experimentan cambios fenotípicos caracterizados por la pérdida de moléculas de adhesión celular, particularmente la cadherina epitelial (E-cadherina) [21]. El caracol factor de transcripción, una proteína con dedo de zinc, se ha caracterizado previamente como un importante regulador de la EMT debido a su activación a través del factor nuclear kappa beta (NF-kB) [22] y la posterior represión de la E-cadherina en las células epiteliales del tumor [ ,,,0],23], [24]. Además, los estudios utilizando la ganancia de función y pérdida de función de los enfoques han identificado Caracol como un represor de la transcripción RKIP en las células de cáncer de próstata metastásico [25].
RKIP es un miembro de la proteína de unión-fosfatidiletanolamina familia y un regulador negativo de la (quinasa regulada-señal extracelular) ERK1 /2 [26], NF-kB [27] y GRK (G receptor acoplado a proteína quinasa) [28] vías. así RKIP juega un papel importante en la regulación de la supervivencia celular y la apoptosis, además de potenciar la eficacia de los agentes quimioterapéuticos [29]. RKIP también ha sido identificado como una proteína de metástasis supresor de [30], y en pacientes con adenocarcinoma gástrico, existe una correlación positiva entre la expresión RKIP y la supervivencia del paciente y una correlación inversa entre la expresión de RKIP y STAT3 [19]. expresión y función RKIP pueden ser reguladas por modificaciones post-traduccionales. Por ejemplo, la fosforilación de RKIP por la proteína quinasa C en la serina-153 impide la capacidad del RKIP para unirse a su molécula diana, inactivando así la función RKIP [31]. Además, la represión RKIP a través de la metilación del promotor puede ser superado por los inhibidores de la deacetilasa de histonas metilación y [25]
.
Debido a las importantes funciones de RKIP, STAT3 y
H. pylori
en la patogénesis del cáncer gástrico, se investigó si
H. pylori
señales a través RKIP. Nuestros estudios sugieren que una interacción compleja entre los
H. pylori cagPAI de
, RKIP, STAT3, y Caracol actúa para dysregulate apoptosis de las células epiteliales gástricas mediante la modulación de la función RKIP, un mecanismo que define un papel central para RKIP en
H. pylori
carcinogénesis gástrica -asociado.
Materiales y Métodos
Reactivos
Todos los reactivos y productos químicos fueron adquiridos de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), a menos se indique lo contrario. MG-132 se adquirió de Calbiochem (Gibbstown, NJ) disuelto en DMSO y se utiliza a una concentración de 10 mM. La interleucina-6 (IL-6) se adquirió de BD Biosciences (San Diego, CA). reactivos de cuantificación de proteínas se obtuvieron de Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA). reactivos de quimioluminiscencia potenciada y secundario del ratón y conejo peroxidasa de rábano picante conjugada para el análisis de Western blot fueron de GE Healthcare (Piscataway, NJ). La actina-HRP, fosforilada-RKIP (pRKIP) y anticuerpos STAT3 se adquirieron de Santa Cruz Biothechnology (Santa Cruz, CA). Los anticuerpos a STAT3 pS727 y pY705 y PARP se adquirieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA) y el anticuerpo para RKIP de Millipore, Billerica, MA. El anticuerpo de Caracol fue adquirido de Abcam (Cambridge, MA).
Las células y los plásmidos
La línea celular de carcinoma gástrico humano AGS (CRL-1739) se adquirió de American Type Culture Collection (Manasas , VA). MKN28 células fueron donadas por el Dr. Richard Peek, Universidad de Vanderbilt, Nashville, TN y se adquirieron originalmente de Riken Cell Bank, Ibaraki, Japón. Los plásmidos de expresión para pcDNA3, c-myc STAT3, CMV-HA-RKIP (HA-RKIP) y CMV-HA vector vacío (EV) se han descrito [18], [26]. El plásmido RKIP S153V fue proporcionada por el Dr. Marsha Rosner, Universidad de Chicago, Chicago, IL.
H. pylori
Cepas y condiciones de cultivo
tipo salvaje
H. pylori
cepas isogénicas o
H. pylori
mutantes fueron co-cultivadas con los AGS o líneas celulares gástrico MKN como se describe anteriormente [32] a una multiplicidad de infección (MOI) de 100:1 en todo experimento a no ser que se indique lo contrario.
Transfección de las células AGS
células AGS se transfectaron transitoriamente utilizando el reactivo de transfección del plásmido GenJet (Signagen Laboratories, Gaithersburg, MD) de acuerdo con el protocolo del fabricante para un formato de placa de 6 pocillos. Cantidades totales de ADN de entre 1 y 2 g fueron transfectadas por muestra. condiciones de transfección fueron evaluados y optimizados mediante el análisis de las células transfectadas con una proteína verde fluorescente (GFP) expresando plásmido RKIP. Las eficacias de transfección fueron consistentemente en el rango de 75-85%.
extracción de proteínas y Western blot
extractos de células totales y fraccionamientos subcelulares se prepararon y se sometieron a inmunotransferencia como [29], [32 descrito previamente ]. Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando el ensayo de proteínas BCA (Thermo Scientific). Densitometría de las transferencias Western se realizó de acuerdo con el protocolo que aparece en el siguiente sitio:. Http://lukemiller.org/journal/2007/
PCR en tiempo real
Dos g de ARN se convirtió en cDNA utilizando primer capítulo de síntesis de cDNA Kit RevertAid (Thermo Scientific). Cuantitativa en tiempo real PCR se realizó usando 2 × QIAgen QuantiFast SYBR Green I (Roche). Los cebadores para Caracol fueron hacia adelante: AGCTCTCTGAGGCCAAGGATCT, revés: TGTGGCTTCGGATGTGCAT y beta-actina: hacia adelante: CTGGCACCACACCTTCTACAA, revés: CAGCCTGGATAGCAACGTACA. Los siguientes tiempos perfil típico utilizados fueron durante 40 ciclos: un paso inicial a 95 ° C durante 10 min, seguido de 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 1 min. El nivel de expresión relativa se calculó utilizando el método 2-ΔΔCT como se describe anteriormente [33].
STAT3 y RKIP informador de luciferasa Ensayos
Las células (2 × 10
5 células /pocillo en placas de 6 pocillos) fueron transfectadas transitoriamente con 0,1 g (STAT3, RKIP) o 0,05 g (NF-kB) de un plásmido indicador que contiene o bien la unión STAT3 SIE-fragmento de la región promotora del gen IRF1 ratón (p2xSIE-Luc) o la región del promotor RKIP más los plásmidos indicados como se describió previamente [18]. Aproximadamente 24 h después de la transfección, las células fueron tratadas con el fármaco indicado o infectados con
H. pylori
durante la noche o se deja sin tratamiento. La actividad de la luciferasa en el sobrenadante citosólico se evaluó mediante el reportero de ensayo de luciferasa (Promega) y se midió utilizando un luminómetro para estimar la actividad transcripcional [18].
Apoptosis ensayos
La apoptosis se cuantificó en los ensayos por separado por citometría de flujo y la fragmentación del ADN ELISA. Para citometría de flujo, el porcentaje de células apoptóticas (sub-G
O) se determinó mediante análisis de citometría de flujo de yoduro de propidio manchado células [29]. Citoplasmática fragmentación del ADN histona asociada se midió con la muerte celular de detección de ELISA Plus kit (Roche, Indianapolis, IN) según las instrucciones del fabricante.
citoplasmática fragmentación del ADN histona asociada se midió con la muerte celular de detección de ELISA Plus kit (Roche, Indianapolis, IN) según las instrucciones del fabricante. Los experimentos se repitieron 3 veces y se realizaron por duplicado.
Derribo Lentivirus mediada de RKIP
Lentivirus construye.
pLKO.1 Puro-lentiviral construir la resistencia y RHS3979-97070798 RHS3979-98492779 fueron adquiridos de Applied abierto (Huntsville, AL). Las construcciones contienen un marcador de selección de puromicina y se cultivaron en caldo Luria que contiene ampicilina a 37 ° C. El caldo se centrifugó a 10.000 ×
g
durante 10 minutos. y el sobrenadante descartado. ADN de los pellets se purificó usando el kit QIAGEN plásmido Plus Maxi.
producción Lentivirus.
células de empaquetamiento 293T se sembraron en medios de baja antibiótico de crecimiento (DMEM, 10% FBS inactivado por calor, 0,1 × penicilina /Strepomycin /glutamina). Las células se incubaron durante 24 h (37 ° C, 5% de CO
2), o hasta que fueron de aproximadamente ~ 70% de confluencia. Los medios de comunicación en las células de empaquetamiento 293T fue reemplazado con medio DMEM que contiene un alto crecimiento. Una mezcla de los plásmidos de transfección se prepararon como sigue:. Embalaje plásmido (ΔVpr.89), plásmido de la cubierta (VSV-G), horquilla-pLKO.1 y vector vacío
reactivo de transfección FUGENE se preparó en DMEM según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se añadieron los 3 plásmidos gota a gota a la FUGENE y DMEM y se mezcla. Después se dejó que la mezcla se incuba durante 20 a 30 min. a temperatura ambiente. A continuación, la mezcla de transfección se añadió cuidadosamente a las células de empaquetamiento. Las células se incubaron durante aproximadamente 18 h. El medio de transfección se desechó luego la mañana siguiente y se reemplazó con medio de alto crecimiento. Las células se incubaron durante 24 h. containingand lentivirus medios que contienen se cosechó añade medio de alto crecimiento adicional. Las células se incubaron durante 24 h y los medios de comunicación cosechadas. colección típica fue de 2-3 puntos de tiempo. Se agruparon todas las cosechas virales.
infección por lentivirus de células AGS.
p>
Métodos Estadísticos
Todos los experimentos de cultivo de células se repitieron al menos 3 veces, a menos que se indique lo contrario, y emparejados t- se utilizaron pruebas para determinar la significación estadística.
resultados
H. pylori
infección aumenta la fosforilación de RKIP
RKIP inhibe varias vías de supervivencia celular, incluyendo las mediadas a través de NF-kB y Jak /STAT [22]. Para dilucidar el efecto de
H. pylori
infección en RKIP en las células gástricas, las células AGS estaban infectados con
H. pylori
y se cosecha 2 h y 6 h más tarde. Como se muestra en la Fig. 1A, los niveles de RKIP fosforilada (pRKIP) fueron elevados después de 2 h (3.126 veces) y 6 h (2,9 veces) después de
H. pylori
la infección mientras que la expresión de proteínas totales RKIP aumentó 1,4 veces después de 2 horas y 1,75 veces después de 6 h de
H. pylori
infección. Resultados similares se obtuvieron con células de cáncer gástrico MKN (véase la figura S1).
(A) Western blot de células AGS co-cultivadas con
H. pylori gratis (HP) a una MOI de 100:1 para 2 y 6 horas y se examinaron para pRKIP, RKIP, y la expresión de actina. Densitometría se realizó en tres experimentos independientes y las intensidades de banda normalizados en comparación a la actina para cada punto de tiempo. Nuestros resultados indican un aumento de 3.126 veces (intensidad media de 0,44 vs 1,376) de pRKIP después de 2 horas y 1.384 veces mayor (intensidad media de 0,6774 vs 0,938) de RKIP después de 2 h de
H. pylori
infección. (B) células AGS co-cultivaron durante 6 h en presencia o ausencia del inhibidor de PKC bisindolylmaleimide (Bis), se examinaron para la expresión de pRKIP, tratamientos RKIP y actin.All se realizaron en 1% de DMSO como un control del vehículo ( bis).
H. pylori
inducida por fosforilación de RKIP es dependiente de PKC
La fosforilación de la serina 153 en RKIP por la proteína quinasa C (PKC) abroga su capacidad para unirse a Raf e inhibir aguas abajo MAP quinasa de señalización [31]. Hemos examinado si la fosforilación de RKIP por
H. pylori
era dependiente de PKC. células AGS fueron infectados con
H. pylori
durante 6 h, en presencia o ausencia de 40 bisindolylmaleimide mu M (Bis, un inhibidor de PKC). Nuestros resultados indican que los niveles de RKIP fosforilados se inhibió 3,9 veces y RKIP 1,36 veces después de
H. pylori
infección en presencia del inhibidor de la PKC, lo que sugiere que la fosforilación RKIP por
H. pylori
implica, pero puede no ser totalmente dependiente de la PKC-regulada (fig. 1B).
IL-6 induce la fosforilación de RKIP y
H. pylori
se activa STAT3
Dado que existe una relación inversa entre RKIP y expresión de STAT3 en muestras de cáncer gástrico [19], se evaluó si STAT3 y su clave regulador de la IL-6 [17] afecta a la expresión pRKIP. tratamiento con IL-6 a una dosis de 25 o 50 ng /ml aumentó los niveles de proteína pRKIP 1,8 y 1,35 veces, respectivamente y la expresión de proteína total RKIP disminución de 0,8 y aumentó 1,05 veces, respectivamente (Fig. 2A). La fosforilación de RKIP en respuesta a IL-6 fue dependiente de PKC (datos no mostrados). Estos datos indican que la IL-6 también puede inducir la fosforilación de RKIP en las células gástricas que pueden ocurrir, en parte, a una vía dependiente de PKC.
(A) análisis de transferencia Western de las células AGS tratados con las concentraciones indicadas de IL-6 y durante 6 horas. Densitometría se realizó y para la expresión pRKIP, nuestros resultados indican un incerase pliegue 1.8 de pRKIP (intensidad media de 0,59 vs 1,051) en las células tratadas con 25 ng /ml de IL-6 y un 1,35 veces mayor (intensidad media de 0,59 vs 0,772) en las células tratadas con 50 ng /ml de IL-6. Para la expresión RKIP, nuestros resultados indican un incerase 0,8 veces de pRKIP (intensidad media de 0,69 vs 0,563) en las células tratadas con 25 ng /ml de IL-6 y un 1,05 veces mayor (intensidad media de 0,69 vs 0,745) en las células tratadas con 50 ng /ml de IL-6 cuando se normaliza a la actina en cada punto de tiempo. (B) Análisis de transferencia Western de co-cultivadas con
H AGS. pylori
y se examinaron para pY705 STAT3 durante los tiempos indicados; (C) STAT3 indicador de luciferasa ensayo de transcripción de las células AGS co-cultivadas con
H. pylori Restaurant at Ministerio del Interior se indica; reportero de ensayo (D) STAT3 luciferasa de las células AGS transfectadas transitoriamente con STAT3 durante 24 h y co-cultivadas con
H. pylori
y /o tratadas con IL-6 durante 6 h. Se realizó una prueba t pareada para analizar el aumento o disminución de la transcripción STAT3 de las muestras experimentales en comparación con el vector vacío (EV): * IL-6, p & lt; 0,0003; ** STAT3, p & lt; 0,009; ***
H. pylori
p & lt; 0,0005; **** STAT3 y
H. pylori
p. & lt; 0.0000023
Los macrófagos liberan citocinas, incluyendo IL-6 durante la
H. pylori
la infección [34] conduce a la activación STAT3 [17]. Para investigar los efectos de
H. pylori
infección en la activación de STAT3, las células AGS se transfectaron transitoriamente con un IRF-1 reportero construir [18] y co-cultivadas con
H. pylori
en el rango indicado de multiplicidad de infección (MOI) de 24 h. Nuestros resultados mostraron que a una MOI entre 10-200:1, H
. pylori
fue capaz de inducir la transcripción STAT3 (Fig. 2C) y la fosforilación de STAT3 pY705 (Fig. 2B) dentro de 6 h de la infección. A continuación se determinó si la IL-6 también podría estimular la transcripción STAT3 en células AGS. células AGS se transfectaron transitoriamente con IRF-1 y con EV y etiquetado o-c-myc STAT3 y luego después de 24 h las células tratadas con IL-6 (50 ng /ml) o co-cultivadas con
H. pylori Restaurant at MOI de 100:1. Los resultados, representados en la figura. 2D, demuestran que la IL-6 (p & lt; 0,0003) y
H. pylori
(p & lt; 0,0005) fueron cada uno capaz de estimular significativamente la transcripción STAT3, un efecto que fue mayor cuando las células AGS se transfectaron con STAT3 y se infectaron con
H. pylori gratis (p & lt; 0,0000023). La mejora de la activación de STAT3 se incrementó significativamente cuando las células AGS se co-tratados con IL-6 y
H. pylori
cuando se compara con el tratamiento con IL-6 (p & lt; 0,000028) o
H. pylori gratis (p & lt; 0,0003).
solos
Fosforilados RKIP induce su propia transcripción
Se utilizó un ensayo indicador de luciferasa RKIP para investigar los efectos de
H. pylori
infección sobre la actividad transcripcional RKIP.
H. pylori
aumentado significativamente la transcripción RKIP (p & lt; 0,002) con un aumento mayor de 10 veces que ocurre con la sobreexpresión RKIP y un aumento mayor que 16 veces con la combinación de
H. pylori
y RKIP (p & lt; 0,0003) (Fig 3A.) en comparación con las células no tratadas AGS transfectadas con el vector vacío. Hubo un aumento significativo (p & lt; 0,0001) en la transcripción RKIP con
H. infección y RKIP pylori
sobreexpresión, en comparación con las células transfectadas con RKIP sin infección (Fig. 3A). Repetimos estos experimentos en presencia de Bis para inhibir la actividad PKC para determinar el aumento de la transcripción RKIP fue debido a la fosforilación. En presencia del inhibidor de PKC,
H. pylori
aumentó la transcripción y la sobreexpresión RKIP RKIP también resultó en la mejora de la actividad promotora RKIP. Bis disminuye la transcripción inducida por la sobreexpresión RKIP RKIP y
H. pylori
infección mayor que 4 veces, en comparación con las células de sobreexpresión con RKIP y sugiere que estos efectos fueron dependientes de la fosforilación RKIP (Fig. 3A). Se examinó la localización de RKIP después de
H. pylori
infección. Immunoblotting subcelulares AGS células fracciones demostraron que pRKIP se localiza en el núcleo, mientras que RKIP permanece principalmente en el citosol después de la infección, (Fig. 3B). En conjunto, estos datos implican que
H. pylori
puede promover la translocación de pRKIP en el núcleo, donde puede activar la transcripción RKIP.
(A) RKIP transcripción reportero de ensayo de las células AGS transfectadas transitoriamente con la construcción de RKIP luciferasa y HA-RKIP durante 24 h, a continuación, co-cultivadas con
H. pylori
durante 12 h en presencia o ausencia del inhibidor de la PKC. En comparación con los controles de vectores vacíos, la actividad transcripcional relativa, fue significativamente superior a *
H. pylori
, p & lt; 0,002; y **
H. pylori
+ RKIP, P & lt; 0,0003. La comparación de la pérdida de la actividad de luciferasa relativa de
H. pylori Opiniones y RKIP cuando se comparan con
H. pylori
, RKIP y Bis, p & lt; 0,0004. Los datos representan la desviación media +/- estándar (SD) de la veces de incremento respecto a los controles de vectores vacíos en 2 experimentos independientes realizados por duplicado. (B) Análisis de transferencia Western de las fracciones nucleares y citosólicas de células AGS co-cultivadas con
H. pylori
durante 4 horas para la expresión de pRKIP y RKIP total. La actina y la lámina proporcionan la verificación de la separación exitosa fracción citoplasmática y nuclear.
H. pylori
inducida por fosforilación RKIP Depende de
H. cag de
pylori isla de patogenicidad y RKIP serina 153
Para evaluar el papel de la específica
H. pylori
factores en la fosforilación de RKIP, de tipo salvaje
H. pylori Opiniones y mutantes isogénicas que carecen de toda la cag
PAI o Francia El
oipA
gen fueron co-cultivadas con células AGS durante 6 h. El
H. pylori
mutante que carece de la cag
PAI
era incapaz de inducir la fosforilación RKIP, mientras que la tinción de tipo salvaje y el
oipA
mutante fuertemente inducida por la fosforilación RKIP (Fig. 4A). Se observó la misma tendencia en STAT3 pY705. Estos resultados sugieren que los genes dentro de
H.
cagPAI de pylori son necesarios para la inducción de la fosforilación de STAT3 RKIP y.
Western blot de células AGS (A) co-cultivadas con
H. pylori
cepas durante 6 horas y se examinaron para las proteínas indicadas. C = control (no infectadas), WT = células AGS infectadas con el tipo salvaje
H. pylori
durante 6 h,
PAI Network - y
oipA CD - representan mutantes isogénicas que carecen de estos genes. (B) células AGS transfectadas transitoriamente por 24 h con RKIP S153 cDNA o 24 h y co-cultivadas con
H. pylori
durante 6 h. reportero de ensayo (C) RKIP luciferasa de las células AGS transfectadas transitoriamente con S153V RKIP en presencia o ausencia de
H. pylori
infección. En comparación con los controles de vector vacío, la actividad relativa de la transcripción RKIP se aumentó por: *
H. pylori
, p & lt; 0,002; ** RKIP, p & lt; 0,002; *** S153V, p & lt; 0,03, ****
H. pylori Opiniones y RKIP, p & lt; 0,0005; *****
H. pylori Opiniones y S153V, p & lt; 0,003. **, La actividad transcripcional RKIP se redujo significativamente por la S153V en comparación con el tipo salvaje RKIP construir en respuesta a
H. pylori,#
, p & lt; 0,0003. Los datos representan la media +/- SD de 2 experimentos independientes realizados por duplicado.
Para investigar si la mutación de la serina 153 afecta a
H. pylori
fosforilación mediada RKIP y activación de la transcripción, las células AGS se transfectaron de forma transitoria con un RKIP construcción en la que la serina se sustituye con valina en la posición 153 (S153V) y luego co-cultivadas con
H. pylori
. Una vez más, se observó un mayor aumento después de 16 veces en la actividad promotora RKIP en células con sobreexpresión RKIP y
H. pylori
infección (p & lt; 0,0005). Sin embargo, en las células transfectadas con RKIP S153V antes
H. pylori
infección, hubo una reducción de 2,5 veces en la actividad transcripcional (p & lt; 0,0003) en comparación con el
H. pylori Hoteles en RKIP tipo salvaje que sobreexpresan las células (Fig. 4C). Además, la sobreexpresión de S153V RKIP inhibida
H. pylori
fosforilación mediada RKIP (Fig. 4B). Tomados en conjunto, estos resultados indican que la fosforilación y la activación transcripcional de RKIP depende de
H.
de cagPAI pylori y también sobre la fosforilación de RKIP a S153.
H. pylori
infección como resultado la degradación RKIP y la inducción de Snail
Debido aumento de la transcripción RKIP inducidos por
H. pylori
la infección no se asoció con un aumento de la expresión de la proteína total RKIP estado estacionario, se examinó si
H. pylori
podría aumentar simultáneamente la velocidad de degradación de la proteína RKIP través de la degradación mediada por proteasoma, como se sugirió anteriormente [35]. MG132 aumentó los niveles de proteína RKIP en presencia o ausencia de
H. pylori
la infección, de acuerdo con
H. pylori
aumento de la degradación proteasomal RKIP (Fig. 5A).
células AGS fueron (A) tratado con MG132 y se examina para las proteínas que se indican a través de Western blot. V representa el control del vehículo (DMSO). (B, C) Las células fueron co-cultivadas con
H. pylori Opiniones de los tiempos indicados y se examinó la expresión de Snail o (D) medida por Caracol ARNm mediante PCR en tiempo real en los tiempos indicados después de
H. pylori
infección.
Otro mecanismo que podría explicar la falta de cambio en la proteína RKIP o expresión de ARNm sería la represión transcripcional de RKIP después de
H. pylori
infección. Snail es un factor de transcripción que juega un papel importante en la EMT [23], además de ser un represor transcripcional conocido de RKIP en células de cáncer de próstata [25]. Para investigar los efectos de
H. pylori
infección en la expresión de Snail y RKIP, las células AGS fueron co-cultivadas con
H. pylori
a una MOI de expresión 100. Caracol mRNA fue inducida con fuerza después de 2-4 h de la infección (Fig. 5D) Western blot indicó que
H. pylori
infección resultó en un incremento dependiente del tiempo y de la dosis en los niveles de proteína Snail (Fig. 5B /C). Este resultado no es consistente con nuestros datos sobre la transcripción RKIP después de
H. pylori
infección (Fig. 3) y sugiere que
H. pylori infección puede
en la inducción de la proteína (s) que derogar el efecto de Caracol en la transcripción RKIP. Actualmente estamos investigando esta posibilidad mediante análisis de Espectrometría de Masas utilizando células de los padres y RKIP desmontables (Fig. 6).
(A) Western blot de AGS transfectadas transitoriamente con RKIP durante 24 h, después infectados con
H . pylori
durante 6 h. análisis de densitometría para la media de 2 experimentos independientes indica un aumento de 1,53 veces en la apoptosis (intensidad media de 0,19 vs 0,295) en
H. pylori
células infectadas; 2,1 veces mayor (intensidad media de 0,19 vs 0,403) en las células transfectadas con RKIP; un 2,6 veces mayor (intensidad media de 0,19 vs 0,495) en células infectadas con
H. pylori
y transfectadas transitoriamente con RKIP cuando se normalizaron a la actina. En paralelo apoptosis se midió por (B) citometría de flujo. ensayo de fragmentación de DNA basado C) Se utilizó ELISA para medir la apoptosis. En comparación con el control de vector vacío en la apoptosis (B) se incrementó en un
* H. pylori
, p & lt; 0,0008; ** RKIP, p & lt; 0,003; ***
H. pylori Opiniones y RKIP, p & lt; 0,0005. En (C) en comparación con los controles de vectores vacíos, la apoptosis se incrementó significativamente por: *
H. pylori
, p & lt; 0.000063; ** RKIP, p & lt; 0,006;
*** H. pylori Opiniones y RKIP, p & lt; 0,0007. Los datos para B y C representa la media +/- SD de 2 experimentos independientes realizados por duplicado. (D) Análisis de transferencia Western de las células AGS infectadas con lentivirus que derribar la expresión RKIP antes de las 6 h infección por
H. pylori
. CTR = células no infectadas, células AGS AGS HP = infectados con
H. pylori
, KD = células AGS infectadas con lentivirus para derribar RKIP, células KD + RKIP AGS infectado con lentivirus para derribar RKIP y se infectó con
H. pylori
durante 16 h. (E) La apoptosis (fragmentación del ADN mediante ELISA) se midió después de 16 h de
H. pylori
infección. La apoptosis se incrementó significativamente por
H. pylori Hoteles en células AGS * P & lt; 0,0007; y en células AGS con caída RKIP, ** p & lt; 0,003 y se redujo la comparación de
H. pylori
RKIP infectado con desmontables células AGS con
H. pylori
células infectadas parentales AGS,#P & lt; 0,0006. Los datos mostrados representan la media +/- SD de 2 experimentos realizados por triplicado.
RKIP Mejora
H. pylori
mediada por apoptosis
H. pylori
induce apoptosis de las células epiteliales gástricas [8]. Desde RKIP puede promover la apoptosis [29], se analizó si la inducción de pRKIP después de
H. Como se muestra en la Fig.