Extracto
Antecedentes
microARN-21 está regulado en una variedad de cánceres como, mama, colorrectal , pulmón, cabeza y cuello, etc. sin embargo, la regulación de miR-21 en el carcinoma de células renales (RCC) todavía no se ha estudiado de forma sistemática.
Métodos y resultados
Se midió el miR-21 niveles en 54 pares de los cánceres de riñón y sus tejidos normales emparejados por PCR en tiempo real. El nivel de expresión de miR-21 se correlacionó con 5 años de supervivencia y el estadio patológico. Los estudios funcionales se realizaron después de la inhibición de miR-21 en líneas celulares de RCC. Estudiamos
in vitro
y
in vivo
efectos de la quimioterapia preventiva genisteína agente de miR-21 expresión. En 48 casos (90%), el miR-21 se incrementó. Todos los pacientes con baja expresión de miR-21 sobrevivieron 5 años, mientras que con una alta expresión de miR-21, sólo el 50% sobrevivió. De la expresión de miR-21 se asocia con un aumento en la etapa del cáncer renal. Los estudios funcionales después de la inhibición de los genes miARN-21 en líneas celulares de RCC muestran la detención del ciclo celular, la inducción de la apoptosis y capacidades invasivas y migratorias reducidos. El análisis de transferencia Western mostró un incremento en la expresión de p21 y p38 MAP quinasa genes y una reducción de la ciclina E2. La genisteína inhibe la expresión de miR-21 en células A-498 y en los tumores formados después de la inyección de células tratadas con genisteína A-498 en ratones desnudos además de inhibir la formación de tumores.
Conclusiones
El estudio actual muestra una clara correlación entre la expresión de miR-21 y las características clínicas de cáncer renal. Por lo tanto creemos que miR-21 se puede utilizar como un marcador de tumor y su inhibición puede demostrar ser útil en el control de los cánceres con hasta reguladas miR-21
Visto:. Zaman MS, Shahryari V, Deng G, Thamminana S, S Saini, Majid S, et al. (2012) sobre regulación de microARN-21 se correlaciona con la supervivencia del cáncer del riñón Baja. PLoS ONE 7 (2): e31060. doi: 10.1371 /journal.pone.0031060
Editor: G. Dean Tang, la Universidad de Texas M.D Anderson Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 1 Noviembre 2011; Aceptado: 1 Enero 2012; Publicado: 8 Febrero 2012
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuido, transmitido, modificado, construido sobre, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Asociación de Veteranos de Mérito de la opinión, el Programa de Premios Asociación de Veteranos de Mejoramiento de la Investigación y los Institutos Nacionales de Salud de subvención (RO1CA130860 al director el investigador, el Dr. R. Dahiya). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los microARN son pequeños ARN no codificantes que juegan un papel importante en numerosos procesos celulares, incluyendo el desarrollo, la proliferación y la apoptosis [1]. Desde miRNAs están involucrados en los procesos celulares críticos, estudios recientes han demostrado que también están involucrados en la patogénesis de varias enfermedades, incluyendo las del riñón. se ha informado de firmas miARN característicos para varios cánceres epiteliales, incluyendo mama, pulmón, pancreático, gástrico y cánceres renales, [2], [3], [4], [5]. La evidencia histológica muestra que hay varias variantes del carcinoma de células renales malignos,
a saber.
de células claras, papilar, cromófobo y carcinomas de conductos colectores [6], [7], [8], [9]. Varios estudios han demostrado la expresión diferencial de los genes miARN en estas variantes de carcinoma de células renales [10], [11], [12]. El microARN-21 está regulado en una variedad de tipos de cáncer, como el de mama, colorrectal, pulmón, cabeza y cuello, etc. Sin embargo, la regulación y el papel funcional de miR-21 en el cáncer de riñón todavía no se ha estudiado de forma sistemática. En este estudio se midió el miR-21 niveles en 54 pares de cánceres de riñón humano y sus tejidos normales emparejados por PCR en tiempo real. El nivel de expresión de miR-21 se correlacionó con la supervivencia de 5 años y la etapa de los pacientes. Con el fin de determinar el papel de miR-21 en ensayos funcionales carcinoma de células renales (CCR), tales como el ciclo celular, la apoptosis, la invasión y la migración, se realizaron después de eliminar a miR-21 expresión en células A-498. análisis de software y el análisis conjunto PCR mostraron un aumento en la expresión de p21 y p38 MAP quinasas después de la inhibición de miR-21 y la disminución de la expresión de las ciclinas y quinasas dependientes de ciclina. Estos resultados fueron confirmados por análisis de Western. Además, también se evaluó el efecto de un agente de la quimioprevención de la dieta, la genisteína (un producto de soja), en la expresión de miR-21 en tumores de ratones. La genisteína reduce la expresión de miR-21 en ratones inyectados con las células tratadas con genisteína en comparación con los controles del vehículo. Este es el primer estudio que muestra la correlación entre la expresión de miR-21 con parámetros clínicos y su papel funcional en el CCR. En conclusión, reguladas por el miR-21 en el cáncer de riñón puede ser un buen marcador tumoral para el diagnóstico de cáncer de riñón.
Resultados
miR-21 es regulado hasta en muestras de tejido de carcinoma renal y cáncer renal líneas celulares
Para comprender la relevancia clínica de miR-21 en el cáncer de riñón que mide los niveles de miR-21 en 54 pares de los cánceres de riñón y sus tejidos normales emparejados por PCR en tiempo real. En 48 casos (89%), se encontró que miR-21 que aumentarse (T /N [Tumor /Normal] fue mayor que 1,2). La expresión de miR-21 también se mide en líneas celulares de cáncer renal, A-498, Caki-1, Caki-2 y células normales HK-2. miR-21 expresión en células A-498 era aproximadamente 7,3 × la de las células HK-2, mientras que la de Caki-1 fue de 1,6 ×, y Caki-2, 3 ×.
correlación de la expresión de miR-21 con escenario y la supervivencia en cáncer renal
El nivel de expresión de miR-21 se correlacionó con la supervivencia de 5 años y la etapa de los pacientes. Para los pacientes con baja expresión de miR-21 (Figura S1), todos sobrevivieron 5 años después de la cirugía, mientras que para aquellos con alta expresión de miR-21 (Figura S2), sólo el 50% sobrevivió (Figura 1). La curva de supervivencia se basa en el número de pacientes (36) para los que teníamos información de supervivencia de un total de 54 pacientes. En grupos de pacientes que tienen una baja expresión de miR-21 (T /N & lt; 1,2), alta expresión (T /N = 1,2 a 10) y muy alta expresión (T /N & gt; 10), el porcentaje de los que están en etapa temprana (etapa I) disminuyó en un 80%, 51,5% y 37,5%, respectivamente. Esto implica que el aumento de expresión de miR-21 se correlaciona con un aumento de la etapa del cáncer renal. Esta información se basa en el número de pacientes en los que hemos tenido la información de fase (46 de 54 pacientes). No se observó ninguna correlación entre el grado del tumor y los niveles de miARN-21.
La expresión de miR-21 en diferentes formas de cáncer de células renales
La expresión de miR-21 se calificó como baja (T /N & lt; 1,2), alta (T /N = 1,2 a 10) y muy alta (T /N & gt; 10). Las diferentes formas de cánceres en los que se analizó la expresión de miR-21 fueron el carcinoma de células claras, carcinoma papilar y carcinoma tubular. De un total de 54 muestras, 45 muestras fueron carcinoma de células claras, 8 eran papilar y 1 fue el carcinoma tubular. Tanto en células claras (71,1%) y el carcinoma papilar (75%) la mayoría de las muestras tenía una alta expresión de miR-21 (N /T = 1,2-10). El 17,7% de carcinoma de células claras tenía muy alta expresión. La única muestra de carcinoma de células renales tubulares tenía muy alta expresión de miR-21.
Papel funcional de miR-21 en células A-498
Para dilucidar el papel funcional de miR-21 en el cáncer renal que inhibió la expresión de miR-21 en las células de cáncer renal a-498 con un inhibidor disponible en el mercado de miR-21. Control anti-miR-Negativo#1 se utilizó como control negativo estándar para estos experimentos. El nivel de miR-21 se redujo en más de un 99%, en comparación con el control negativo (Figura S3). En el caso de anti-miR-21 transfección en células Caki-2 el mismo nivel de reducción de la expresión de miR-21 se observó (Figura S4).
Efecto en la A-498 del ciclo celular y la apoptosis.
los efectos de la inhibición miR-21 en el ciclo celular y la apoptosis se analizaron por citometría de flujo. El ciclo celular mostró un aumento significativo (9,1%) en la fase G0 /G1, con una reducción concomitante (6,8%) en el /fase G2 M, lo que indica que la reducción de miR-21 expresión en células A-498 inhibe la célula crecimiento y causado G0 /G1 detención (Figura 2a). ensayo de apoptosis mediante citometría de flujo mostró un aumento marginal en el número de células totales apoptóticos (temprano de apoptosis más apoptóticas) (5,17%) en el miR-21 anti-miARN inhibidor de las células transfectadas en comparación con el control negativo (1,79%) y mock ( 2,49%) (Figura 2b). En caso de Caki-2 células la inhibición de miR-21 dio como resultado un aumento significativo en la apoptosis, sin cambio en el ciclo celular (datos no mostrados)
(a) Efecto sobre el ciclo celular:. Citometría de flujo análisis de la ciclo celular mostró un aumento significativo en la fase G0 /G1 (9,1%), con una reducción concomitante en la fase G2 /M (6,8%), lo que indica que la reducción forzada de miR-21 expresión en células a-498 podría inhibir la célula el crecimiento y la causa G0 /G1 detención (valor p 0,010). (B) Efecto sobre la apoptosis: La apoptosis ensayo mostró un aumento marginal en el número de células totales apoptóticos (5,17%) en el miR-21 anti-miARN inhibidor de las células transfectadas en comparación con el control negativo (1,79%) y mock (2,49% ) (valor p 0,017).
Efecto sobre las propiedades de invasión celular y la migración.
Para determinar si el miR-21 afecta a la migración celular y la invasión del cáncer renal una migración celular cytoselect de 24 pocillos y se utilizó kit invasión. células A-498 se transfectaron con inhibidor anti-miR-21 y el control anti-miR-Negativo. Tanto la invasión de células A-498 y la migración se redujeron en comparación con el control negativo. se observó menos la absorbancia a 560 nm con-miR-21 anti-células transfectadas que el control negativo tanto en la invasión y ensayos de migración (Figuras 3a y 3b). La inhibición de la expresión de miR-21 tenía un efecto más pronunciado sobre la invasión en comparación con la migración, (reducción de 50% vs 25%). Se observaron efectos similares en el caso de las células Caki-2 en ambos ensayos de invasión y migración (datos no mostrados)
(a) Efecto sobre la invasión de células:. propiedades invasivas de las células A-498 se redujeron después de la inhibición de miR-21 en comparación con el control negativo, las células teñidas a-498 (Aumento a 40 ×); Absorbancia a 560 nm (valor p 0,026). (B) Efecto sobre la migración celular: propiedades migratorias de células A-498 también disminuyeron tras la inhibición de miR-21 en comparación con el control negativo, las células teñidas A-498 (Aumento a 40 ×); Absorbancia a 560 nm (valor p 0,016).
miR-21 aumenta la expresión de la ciclina dependiente de CDKN1A inhibidor de quinasa (p21).
Para ver el efecto de la expresión de miR-21 en diferentes genes implicados en el ciclo celular y la apoptosis se utilizó arrays de PCR. Desde que vimos un efecto significativo en el ciclo celular por la inhibición de miR-21 en las células A-498, que primero decidimos utilizar matrices de PCR relacionados con los genes del ciclo celular. ciclo celular arrays PCR basados mostraron cambios en la expresión de un número de genes. Uno de los genes regulados hacia arriba en la matriz de PCR después de la inhibición de miR-21 fue el inhibidor de quinasa dependiente de ciclina, CDKN1A también conocido como Cip1 o p21. Otras matrices de PCR mostraron un cambio en la expresión de la MAP quinasa gen p38. Posteriormente, se verificó este resultado usando MAP quinasa matrices basadas en PCR y se obtuvo el mismo resultado (datos no mostrados). Ambos resultados fueron validados por Western Blot (Figura 4). experimentos de transferencia Western muestran claramente hasta la regulación de ambos p21 y p38 MAP quinasa genes con miR-21 inhibición en comparación con el control negativo. También se comprobó la expresión de otros genes relacionados con el ciclo celular y la apoptosis y encontramos regulación a la baja de la ciclina E2. También nos fijamos en la expresión del ARNm de la quinasa dependiente de ciclina, CDK2, CDK4, CDKE1 y CDKE2 y encontramos que su expresión se redujo significativamente después de la inhibición de miR-21 (datos no mostrados). En experimentos de Western blot nos registramos CDK4, E1 y E2 como CDK2 ya se sabe que es afectada por el gen p21 [13], [14]. Se observó un cambio en la expresión de la proteína por sólo CDKE2.
Expresión de p21, p38MAP quinasa y ciclina E2 después de la inhibición de miR-21 en las células A-498, en comparación con el control negativo. GAPDH se utilizó como un control de normalización. p21 y p38 MAP quinasa fueron hasta reguladas, mientras que no se encontró expresión de ciclina E2 ser regulada hacia abajo.
in vitro
y
En vivo
efectos de la genisteína en las células de cáncer renal
la genisteína reduce la expresión de miR-21 en tumores de ratón.
Como se mencionó anteriormente nos registramos el efecto de un agente de quimioprevención, la genisteína (un producto de soja), sobre la expresión de miR-21 en tumores de ratón nude. En primer lugar se comprobó A-498 células de cáncer renal fueron tratados con 25 mM genisteína durante 4 días y después de la extracción de ARN de miR-21 expresión. Se observó la expresión que se reduce en un 30% en las células tratadas genisteína en comparación con los no tratados (Figura 5a). Para ver el efecto del tratamiento genisteína sobre los tumores de ratones y células de expresión de miR-21 A-498 fueron tratados de nuevo con genisteína (25 mM) y después de 96 horas de tratamiento se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos. Se utilizaron dos grupos de tres ratones cada uno. En los tumores de control DMSO los tres ratones desarrollaron significativamente grandes tumores de tamaño, aproximadamente 800 mm
3 en el volumen (Figura 5b, panel izquierdo), mientras que con las células tratadas con genisteína se observó un tumor pequeño tamaño en uno de cada tres ratones, aproximadamente 25 mm
3 en volumen (Figura 5b panel de la derecha,). En los otros dos ratones uno de ellos tenía un tumor muy pequeño en el lugar de la inyección (Figura 5b panel derecho), mientras que el tercero ratón tenía ningún tumor. Después de la formación de tumores palpables con las células de control, extirpados los tumores y se midió la expresión de miR-21 después de la homogeneización tumor con Qiazol y extracción de RNA. Se encontró que la expresión de miR-21 se reduzca en ~ 40% en las muestras tratadas de genisteína en comparación con los no tratados (datos no mostrados).
(a) Efecto de la genisteína (25 mM) sobre la expresión de miR-21 en células a-498: se encontró que la expresión de miR-21 se reduzca en ~ 30% en las células tratadas con genisteína a-498 en comparación con las células no tratadas. (B)
En vivo
efecto de la genisteína en el tamaño del tumor en ratones desnudos:. La genisteína fue capaz de reducir significativamente la formación de tumores (flechas negras, panel derecho)
Discusión
en el presente estudio se aportan pruebas de que hasta la regulación de miR-21 en el carcinoma de células renales se relaciona con una menor supervivencia de pacientes con cáncer de riñón. Se encontró que la expresión de miR-21 en las dos líneas celulares de cáncer de riñón y muestras de tejidos de cáncer de riñón humano a ser más alta en comparación a la normalidad, que está de acuerdo con estudios anteriores sobre el carcinoma de células renales y también otros tipos de cáncer [15]. Nuestro estudio demuestra por primera vez que los pacientes con una mayor expresión de miR-21 en el cáncer renal tienen una menor probabilidad de supervivencia. Además, una menor expresión de miR-21 conduce a una mayor tasa de supervivencia. También hemos correlacionado la expresión de miR-21 con la etapa del cáncer para aquellos pacientes que tenían información completa con respecto a la etapa (34/39). Nuestro análisis mostró que muy alta expresión de miR-21 en muestras de pacientes condujo a un aumento en la etapa de la enfermedad. Para dilucidar la importancia de miR-21 en ensayos funcionales carcinoma de células renales se realizaron. Ensayos de viabilidad celular mostraron un efecto contra la proliferación de células A-498 después de la inhibición de miR-21. El cambio más significativo se observó en el ciclo celular en la fase G0 /G1 se aumentó drásticamente (9,1%) con una reducción concomitante en la fase G2 /M (6,8%). Esto nos llevó a buscar posibles genes del ciclo celular afectadas por la inhibición de miR-21 en células A-498. del ciclo celular PCR serie de experimentos mostraron que Cdkn1a (p21) fue regulada hasta después de la inhibición de miR-21 en células A-498. Estudios anteriores utilizando microarrays sugieren que la expresión de p21 se correlaciona positivamente con la supresión de genes que son importantes para la progresión del ciclo celular [16]. p21 responde a una variedad de estímulos que promueve actividades inhibidoras del crecimiento en función de su capacidad para inhibir la actividad de quinasa dependiente de ciclina, CDK2. Numerosos estudios han informado de que el gen p21 tiene funciones adicionales en la regulación del ciclo celular que son independientes de CDK2. Algunos ejemplos son su asociación con el factor de transcripción E2F1 y la supresión de su actividad transcripcional [17]. Además, p21 también suprime factores de transcripción STAT3 [18] y MYC [19]. Además p21 también promueve la inhibición del ciclo celular a través de la mediación de la represión dependiente de p53 de genes tales como Cdc25C, CDC2, CCNB1 y BIRC5 también conocido como survivina [20], [21], [22]. Aunque p21 suprime genes implicados en la progresión del ciclo celular también inhibe la apoptosis [23]. Cuando las células se enfrentan a lesiones genotóxicas o agentes desestabilizadores de microtúbulos, p21 les protege de la apoptosis ya que se requiere un ciclo de celda activa para detectar estos agentes y desencadenar la apoptosis. Esto puede explicar el aumento no tan dramática en el número de células que sufren apoptosis después de la inhibición de miR-21 en las células A-498 en comparación con los cambios en la progresión del ciclo celular La Figura 2b. Sin embargo, el efecto de p21 se contrarresta por varios mecanismos que implica la conmutación de la detención del ciclo celular a la apoptosis por la represión de la transcripción selectiva de p21, la activación selectiva de genes o defectos pro-apoptóticas en la expresión de p21 aguas abajo de p53 [24], [25 ], [26]. En ciertos casos p21 también promueve la apoptosis a través de ambos mecanismos dependientes de p53 e independientes bajo estrés celular, pero el mecanismo de acción sigue siendo desconocido [27]. De esta manera tratamos de ver si p21 era un objetivo directo de miR-21 usando el ensayo de luciferasa 3 ', pero no hemos podido encontrar una interacción directa. De este modo se comprobó la expresión de la proteína quinasas dependientes de ciclina CDK4 diferente, E1 y E2 y se encontró una diferencia en la única cyclinE2 (Figura 4).
La genisteína, una de las principales isoflavonas de soja, tiene una amplia gama de quimiopreventivo comportamiento. Los efectos contra el cáncer de la genisteína se han atribuido a varias vías de señalización y mecanismos que afectan a la detención del ciclo celular, apoptosis, invasión, metástasis y la angiogénesis, atributos que podría prevenir potencialmente la iniciación del tumor y la progresión [28], [29]. La genisteína (40,5,7- trihidroxiflavona) es abundante en los productos de soja y se ha identificado como un inhibidor de la proteína tirosina quinasas y por lo tanto puede jugar un papel clave en el crecimiento celular y la apoptosis [30], [31]. Se ha informado de que tienen propiedades estrogénicas y la actividad anti-neoplásica en múltiples tipos de tumores [32]. También se ha encontrado que tienen efectos epigenéticos en la próstata de ratón [33]. En un estudio previo Hillman
et. al.
han demostrado que la combinación de la genisteína con actos primarios de irradiación del tumor más eficazmente como un enfoque terapéutico, en tumores renales establecidos, debido al crecimiento del tumor se inhibió tanto en sitios primarios y metastásicos. En su estudio genisteína sola demostrado una tendencia a estimular el crecimiento de tumor renal primaria y aumentar la metástasis [34]. En nuestro estudio tomamos un enfoque más simple y hemos demostrado que las células A-498 tratadas con genisteína sólo los tumores formados reducidos en comparación con los controles del vehículo.
miRNAs regulan la expresión génica mediante la orientación genes que contienen secuencias de ARNm complementarios [35]. Muchas vías celulares se ven afectados por la función reguladora de miRNAs y el más prominente de estas vías de control de procesos de desarrollo y oncogénicos [36]. miR-21 fue uno de los primeros miRNAs detectado en el genoma humano [37] y se ha encontrado que se sobreexpresa en una variedad de tipos de cáncer [38]. Hay unos pocos estudios que documentan la relevancia funcional de miR-21, mostrando la relación causa y efecto entre el miR-21 y la transformación neoplásica. Estos estudios se han realizado sobre el cáncer de mama [40], carcinoma hepatocelular [41], el cáncer colorrectal [