Extracto
ya se ha informado que los pacientes con adenocarcinomas de pulmón con mutaciones del gen KRAS y la fuerte proliferación de la actividad tuvieron peores resultados, incluso en la etapa temprana de la enfermedad. El objetivo del presente estudio fue determinar la base molecular potencial de estos tumores pulmonares malignos altamente centrándose en proteínas S100 (S100A2, S100A7, y s100a11), que son objetivos de abajo KRAS oncogénicos y promotores de la progresión del tumor. La expresión inmunohistoquímica de las proteínas S100 se examinó en 179 adenocarcinomas de pulmón primarios, y se analizaron las relaciones potenciales entre sus niveles y los factores clínico-patológicos. Entre los tres subtipos, los niveles de s100a11 fueron significativamente mayores en adenocarcinomas con mutaciones KRAS y fuerte actividad de proliferación. También fueron más altos en los adenocarcinomas con tumores poco diferenciados. Además, los niveles más altos de s100a11 estaban asociados con la supervivencia libre de enfermedad más corto. Estos resultados sugieren que la sobre regulación de s100a11 juega un papel en la progresión tumoral, particularmente en los adenocarcinomas de pulmón KRAS mutado
Visto:. Woo T, Okudela K, Mitsui H, M Tajiri, Rino Y, Ohashi K , et al. (2015) sobre regulación de s100a11 en adenocarcinoma de pulmón - Su posible relación con la progresión del cáncer. PLoS ONE 10 (11): e0142642. doi: 10.1371 /journal.pone.0142642
Editor: William B. Coleman, Universidad de Carolina del Norte Facultad de Medicina, Estados Unidos |
Recibido: August 1, 2015; Aceptado: 23 de octubre de 2015; Publicado: 6 Noviembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Woo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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Financiación:. Este trabajo fue financiado por el Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y de las instalaciones del Japón (Tokio, Japón), y Yokohama médica (Yokohama, Japón) . Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es una de las causas más comunes de muerte por cáncer en el mundo desarrollado [1-2]. Una gran proporción de los pacientes, incluso aquellos con cáncer de pulmón en estadio precoz de células no pequeñas, mueren debido a la enfermedad recurrente [3-4]. Aunque algunos tumores pulmonares son sensibles a los agentes quimioterapéuticos convencionales o ciertos agentes de la orientación molecular, muchos no lo son [5-6]. Por lo tanto, es necesaria una comprensión más profunda de las bases moleculares de la carcinogénesis pulmonar con el fin de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas.
ya se ha informado que los pacientes con adenocarcinomas de pulmón con mutaciones del gen KRAS y la fuerte proliferación de la actividad tuvieron peores resultados, incluso en la etapa temprana de la enfermedad [6]. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue determinar la base molecular potencial de estos tumores de pulmón altamente malignos, centrándose en proteínas S100. La familia de proteínas S100 se une al calcio y modula la transmisión de varias señales celulares. Hemos demostrado anteriormente que S100A2, S100A7, y s100a11 eran objetivos de abajo KRAS oncogénicos (Tablas 1 y 2) [7-8]. La expresión de proteínas S100 también ha demostrado ser alterado en varios tipos de cáncer [9-20] (laríngea [10], de mama [11], pulmón [12-13], gástrico [14], de colon [15], hepatocelular [16 ], pancreáticas [17], de próstata [18], el riñón [19], y de la vejiga tipos de cáncer [20]), incluyendo los cánceres de pulmón [12-13], y han sugerido que estas proteínas para promover la progresión de la carcinogénesis mediante la modulación de la migración celular y la actividad proliferativa [21].
a continuación se examinaron 179 adenocarcinomas de pulmón primario resecado quirúrgicamente para la expresión inmunohistoquímica de las proteínas S100 (S100A2, S100A7, y s100a11), y se analizaron las posibles relaciones entre su niveles y factores clínico-patológicos.
Materiales y Métodos
cáncer de pulmón primario
las 179 cánceres de pulmón examinados fueron los casos de adenocarcinoma en estadio I que fueron sometidos a resección quirúrgica radical en el Cardiovascular y Kanagawa Centro respiratorio (Yokohama, Japón). El plan de investigación fue aprobado por los Comités de Ética de la Universidad de la Ciudad de Yokohama y Kanagawa Centro Cardiovascular y Respiratorio. consentimiento informado por escrito para el uso en investigación de materiales resecados se obtuvo de todos los sujetos que proporcionan materiales.
Entre los subtipos histológicos fueron clasificados de acuerdo a la clasificación IASLC /ATS /ERS de adenocarcinoma de pulmón [22] de 2011, y se determinaron las fases del tumor de acuerdo con el sistema internacional de clasificación TNM (séptima edición de la UICC) [23].
Western blotting
lisados de tejido se sometieron a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, y se transfirieron a membranas de PVDF (Amersham, Piscataway, NJ). Las membranas se incubaron con leche descremada en polvo en solución salina tamponada con Tris que contenía Tween-20 (TBS-T) con el fin de bloquear proteína no la unión inmunoespecífica, y luego con un anticuerpo primario contra S100 A11 (Santa Cruz, Santa Cruz, CA ), y beta-actina (Sigma, St. Louis, MO). Después de lavar con TBS-T, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP-emparejado animales (Amersham). La inmunorreactividad se visualizó con un sistema de quimioluminiscencia (Amersham).
La inmunohistoquímica
Tumor secciones fueron cortadas de los bloques, tejidos embebidos en parafina fijados con formalina. Las secciones se desparafinaron, se rehidrataron y se incubaron con peróxido de hidrógeno al 3%, seguido por suero de cabra al 5% para bloquear las actividades de peroxidasa endógena y proteína no unión inmunoespecífica. Las secciones se hirvieron en tampón de citrato (0,01 M, pH 6,0) durante 15 minutos para recuperar los epítopos enmascarados y después se incubaron con anticuerpos primarios contra S100A2, S100A7, y s100a11 (Santa Cruz), así como Ki-67 (DAKO, Ely, Reino Unido ). La inmunorreactividad se visualizó usando un sistema de detección Envision (DAKO), y los núcleos se contratiñeron con hematoxilina. Los inmunohistoquímicos niveles de expresión de proteínas S100 se evaluaron mediante un sistema de puntuación tal como se describe en la sección Resultados. El índice de etiquetado de Ki-67 se calculó como la proporción de células con núcleos positivos entre 500-1000 células cancerosas. Ki-67 índices de rotulación de & lt; 10% y & gt; = 10% se clasificaron como bajo y alto nivel basadas en los resultados de nuestro estudio anterior [6].
Análisis estadístico
Las diferencias en las puntuaciones entre los grupos clasificados sobre la base de los sujetos fueron analizadas por clinicopatológicas la prueba de Mann-Whitney o Kruskal-Wallis. Las relaciones entre las puntuaciones de los sujetos y clínico-patológicas se analizaron mediante un modelo de regresión lineal múltiple. El período de post-operatorio libre de enfermedad se define como el período que va desde la fecha de la cirugía a la fecha en que se diagnostica la recurrencia. Una observación fue censurado en la última visita de seguimiento si el paciente estaba vivo o había muerto por una causa distinta al cáncer de pulmón. curvas de recurrencia se representaron usando el método de Kaplan-Meier, y el riesgo absoluto de recurrencia a cinco años se estimó a partir de estas curvas. Las diferencias en los tramos de supervivencia libre de enfermedad se analizaron mediante la prueba de log-rank. Valores de p inferior a 0,05 se consideraron significativos. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS (SPSS para Windows, versión 10.0; SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.).
Resultados
Expresión inmunohistoquímica de las proteínas S100
El s100a11 proteína se expresó en los núcleos y citoplasma de las células epiteliales normales de los bronquiolos (Fig 1A), mientras que la proteína S100A2 se expresa predominantemente en el lado apical del citoplasma en una forma granular (Fig 1E).
Representante fotografías de los bronquiolos normal (a, e) y tumores, en los que la expresión de S100A2 s100a11 y fue negativo (B, F), débil (C, G) y fuerte (D, H), se muestran.
niveles de proteína S100 variaron en células neoplásicas, e incluso en los tumores individuales. La expresión de estas proteínas fue mayor en algunas células neoplásicas que en las células del epitelio bronquiolar (Fig 1D y 1H), mientras que otras células ellos débilmente (Fig 1C y 1G) o en un nivel no detectable (Fig 1B y 1E) expresadas. Por otro lado, la proteína S100A7 solamente se expresó en unas pocas células de adenocarcinoma. Se expresa con fuerza en las células queratinizantes de carcinomas de células escamosas (S1) Fig. De este modo, la proteína S100A7 se excluyó del análisis siguiente.
La expresión niveles de S100A2 y s100a11 se clasificaron en negativo (nivel 0), débil (nivel 1), y fuertes (nivel 2). El nivel débil se define como el nivel casi equivalente a la de las células del epitelio bronquiolar. El nivel fuerte se define como un nivel de manera inequívoca más fuerte que en las células epiteliales bronquiolares. La puntuación expresión inmunohistoquímica se determinó como el nivel medio en una sección máxima del tumor (si 30%, 10% y 60% de las células neoplásicas en la sección máxima del tumor fueron negativos, débiles y fuertes niveles, respectivamente, se calculó el nivel promedio como "0.3x0 + 0.1x1 + 0.6x2 = 1,3"). Los niveles de expresión de S100A2 y s100a11 en todos los tumores examinados se muestra en la figura 2A y 2B.
La mediana de las puntuaciones de expresión eran 1,30 en s100a11 (A) y 0,10 en S100A2 (B). S100a11 no se expresó en 8 casos (A), mientras que S100A2 no se expresa en casi la mitad de los casos examinados (83 casos) (B). ADC, adenocarcinoma.
La validez de la evaluación inmunohistoquímica fue apoyada por el análisis de transferencia de Western debido a que los niveles de proteína S100 evaluados mediante técnicas de inmunohistoquímica y aquellos por Western Blot fueron más o menos paralelo (El resultado de una transferencia Western para s100a11 se muestra en la figura S2).
niveles de proteína S100 y los factores clínico-
s100a11 niveles fueron significativamente mayores en los adenocarcinomas con mutaciones KRAS y proliferación de la actividad fuerte (p = 0,038 en la prueba de Kruskal-Wallis , Fig 3). También fueron significativamente mayores en los adenocarcinomas con tumores poco diferenciados (p = 0,021 en la prueba de Kruskal-Wallis, Tabla 3) y linfática o afectación vascular (p = 0,026 en la prueba de Mann-Whitney, Tabla 3). Un análisis de regresión lineal múltiple mostró que los tumores pobremente diferenciados se correlacionaron con los niveles más altos s100a11 (P = 0,039, Tabla 4). Por otro lado, los niveles S100A2 no estaban asociados con mutaciones KRAS, la proliferación de la actividad, o cualquiera de los otros factores clínico-patológicas (datos no mostrados).
Las líneas más gruesas indican la puntuación mediana de expresión S100 A11, que se 1.00 en KRAS de tipo salvaje /Ki-67 casos bajos (n = 94), 1.50 en KRAS de tipo salvaje /Ki-67 casos de alto (n = 62), 1.20 en KRAS de tipo mutado /Ki-67 casos bajos (n = 11) y 1,80 en KRAS de tipo /Ki-67 casos de alto (n = 11). S100a11 niveles de expresión fueron significativamente mayores en los adenocarcinomas con mutaciones KRAS y proliferación de la actividad fuerte (p = 0,038 en la prueba de Kruskal-Wallis). En peso, de tipo salvaje; Mt, de tipo mutado.
s100a11 los niveles de proteína y la supervivencia libre de enfermedad
Dado que los resultados obtenidos sugieren que la sobre regulación de s100a11 participó en la progresión tumoral, particularmente en los adenocarcinomas de pulmón KRAS mutado, su valor pronóstico se verificó posteriormente. Ciento setenta y nueve pacientes con adenocarcinomas de pulmón en estadio I fueron examinados. S100a11 expresión decenas de & lt; 1,65 y & gt; = 1.65 fueron clasificados como de bajo y alto en base a una curva de eficacia diagnóstica (área bajo la curva de 0,629, 95% intervalo confidencial 0,501-0.757). Ciento dieciocho pacientes eran bajos expresadores, mientras que 61 eran altos expresadores. las tasas de supervivencia libre de enfermedad a cinco años fueron del 90,1% y del 76,3% en expresadores baja y de alta s100a11, respectivamente. La fuerte expresión de s100a11 correlaciona con menor supervivencia libre de enfermedad en los adenocarcinomas de pulmón postoperatorias (p = 0,0182 en la prueba de log-rank, la figura 4). Por otro lado, no se encontró una correlación entre los niveles de expresión s100a11 y el sitio de la enfermedad recurrente (datos no mostrados).
Cinco años las tasas de supervivencia libre de enfermedad fueron 76,3% en expresadores alta s100a11 (n = 61) y 90,1% en expresadores de baja s100a11 (n = 118). La fuerte expresión de s100a11 correlaciona con menor supervivencia libre de enfermedad en los adenocarcinomas de pulmón postoperatorias (p = 0,0182 en la prueba de log-rank).
Discusión
Entre las proteínas S100 (S100A2, S100A7, y s100a11) examinados en el presente estudio, los niveles de s100a11 fueron significativamente mayores en los adenocarcinomas con mutaciones KRAS y proliferación de la actividad fuerte (figura 3). También fueron más altos en los adenocarcinomas con tumores poco diferenciados (Tablas 3 y 4). Además, la fuerte expresión de s100a11 correlaciona con menor supervivencia libre de enfermedad (Fig 4). Estos resultados sugieren que las alteraciones en la expresión de s100a11 jugaron un papel en la progresión tumoral, particularmente en los adenocarcinomas de pulmón KRAS mutado.
s100a11, también llamado S100C o calgizzarin, pertenece a la familia de calcio S100 multi-gen proteínas de unión. Se encuentra en 1q21 con 15 otros miembros de la familia S100 y tiene un peso molecular de 11.7kDa [24]. miembros de la familia S100 regulan importantes eventos intracelulares tales como las actividades enzimáticas, la dinámica de los componentes del citoesqueleto, y Ca
concentraciones de + 2, con el fin de modular el crecimiento celular y la motilidad, así como la diferenciación [9]. La sobre regulación de s100a11 se ha informado en varios tipos de cáncer [9], tales como la laringe [10], de mama [11], pulmón [12-13], gástrico [14], de colon [15], de páncreas [16], y los cánceres de próstata [17], y con frecuencia se ha asociado con la progresión del cáncer, lo que implica su papel oncogénico [10-17]. Tian T et al. previamente demostró que s100a11 fue hasta reguladas en una línea celular de cáncer de pulmón metastásico altamente a través de un análisis proteómicos [13]. Wang et al. También informaron de que los niveles de s100a11 aumentaron con la progresión de la fase de la enfermedad en el cáncer de colon [15]. Nuestros resultados son consistentes con estos hallazgos.
Sin embargo, los estudios anteriores demostraron que los niveles de expresión s100a11 se redujeron en los tumores con mayor actividad maligno en el riñón [19] y los cánceres de vejiga [20]. Memon AA et al. mostró que s100a11 se había reducido regulado en una línea celular clasificado más alto de cáncer de vejiga mediante un análisis del proteoma, y la expresión débil de s100a11 se asocia a peor supervivencia [20]. Esta discrepancia implica la complejidad de la progresión del cáncer. Por ejemplo, varias proteínas relacionadas con el cáncer, tales como factor de crecimiento transformante beta, tienen funciones opuestas como inhibidores o promotores en diferentes etapas de la progresión del cáncer [25]. Por lo tanto, el papel potencial de la expresión aberrante de s100a11 en la carcinogénesis puede diferir entre los distintos tipos de tumores malignos.
En resumen, los resultados del presente estudio sugieren que la sobre regulación de s100a11 jugó un papel en la progresión tumoral , en particular en adenocarcinomas de pulmón KRAS mutado. La función biológica de s100a11 sigue siendo poco clara. Otras investigaciones están garantizados con el fin de dilucidar los mecanismos por los cuales s100a11 promueve la progresión del cáncer de pulmón.
Apoyo a la Información
S1 Fig. El examen inmunohistoquímico de S100A7 niveles de expresión de proteínas en los tumores y el epitelio no tumoral de pacientes con cáncer de pulmón sometidos a resección quirúrgica.
fotografías representativas de los bronquiolos normales (A), el adenocarcinoma (B) y el carcinoma de células escamosas (C) se muestran. S100A7 no se expresó en las células epiteliales normales de los bronquiolos (A), y sólo se expresó en algunos adenocarcinoma (ADC) células (B). Por otra parte, se expresa fuertemente en las células queratinizantes de carcinomas de células escamosas (CCE) (C)
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S2 Fig.
lisados de proteínas de tumores (T) y los tejidos no tumorales (N) de tejidos de adenocarcinoma de pulmón de pacientes sometidos a resección quirúrgica se sometieron a un análisis de transferencia de Western para s100a11 y β-actina (ACTB) en los casos representativos (A) . Las intensidades de señal de las bandas fueron evaluados por imágenes NIH. niveles s100a11 se normalizaron a los de ACTB. se muestran los niveles normalizados (B). La expresión inmunohistoquímica de S100A1 en los mismos tumores se muestra (C). los niveles de proteína S100 evaluados por inmunohistoquímica y las de Western blot fueron más o menos paralelo. . Cs, Caso
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Reconocimientos
Agradecemos especialmente a Emi Honda y Misa Otara (Departamento de Patología, Kanagawa Centro Cardiovascular y respiratoria) por su asistencia técnica.