Extracto
Muchos estudios han demostrado que la expresión de microARN en el cáncer puede ser regulado por eventos epigenéticos. Recientemente, se encontró que en el cáncer de pulmón de miR-212 fue fuertemente regulada hacia abajo. Sin embargo, los mecanismos implicados en la regulación de la expresión de miR-212 son desconocidos. Por lo tanto, hemos abordado este punto mediante la investigación de los mecanismos moleculares de miR-212 en el silenciamiento de cáncer de pulmón. Se identificaron modificaciones de las histonas en lugar de la hipermetilación del ADN como eventos epigenéticos que regulan los niveles de miR-212 en NSCLC. Por otra parte, se encontró que el miR-212 silenciamiento in vivo está estrechamente asociada con la gravedad de la enfermedad
Visto:. Incoronato M, L Urso, Portela A, Laukkanen MO, Soini Y, Quintavalle C, et al. (2011) regulación epigenética de la expresión de miR-212 en el cáncer de pulmón. PLoS ONE 6 (11): e27722. doi: 10.1371 /journal.pone.0027722
Editor: Tobias Eckle, Universidad de Colorado en Denver, Estados Unidos de América
Recibido: 25 Julio, 2011; Aceptado: 24 Octubre 2011; Publicado: 15 Noviembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Incoronato et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue parcialmente apoyado por fondos de: Fondazione IRCCS SDN www.sdn-napoli.it, 5 x 1000 a Istituto di Ricerca e Diagnostica Nucleare Fondazione IRCCS SDN, Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC) (donación n.ro 10620) www.airc .it y MERIT (RBNE08E8CZ_002) www.miur.it de GC. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
a nivel mundial, el cáncer de pulmón es el cáncer más común en términos de la incidencia y la mortalidad (1,35 millones de nuevos casos por año y 1,18 millones de muertes), con las tasas más altas de Europa y América del Norte. Los tipos principales de cáncer de pulmón son
carcinoma de pulmón de células pequeñas gratis (SCLC) y
no pequeñas carcinoma pulmonar de células gratis (NSCLC). Los no pequeñas carcinomas de pulmón de células incluyen adenocarcinomas, carcinomas de pulmón de células escamosas, y grandes carcinomas de pulmón de células. Estos tumores tienen solamente una respuesta clínica positiva 20-30%, sin embargo la causa de la resistencia al tratamiento sigue siendo desconocido.
microRNAs (miRNAs) son conservadas evolutivamente, endógeno ARN no codificante de aproximadamente 22 nucleótidos (nt) de longitud involucrado en la regulación de proteínas expresión a nivel postranscripcional [1]. Con la llegada de miARN perfiles de expresión, se ha hecho un esfuerzo importante para correlacionar la expresión de miRNA con el pronóstico del tumor [2], [3]. Hasta la fecha, un número de miRNAs reguladas por los que se encuentran en el cáncer de pulmón se correlaciona con la supervivencia del paciente [4], [5], [6] y con la respuesta terapéutica [7]. Este hallazgo llevó a muchos grupos de investigación para identificar los mecanismos moleculares responsables de la desregulación de estos miRNAs en los cánceres humanos.
La epigenética se refiere a los cambios en la expresión génica que se producen sin alteración en la secuencia de ADN. Existen dos mecanismos epigenéticos primarios e interconectados: la metilación del ADN de las islas CpG en las regiones promotoras y modificación posterior a la traducción de las colas de las histonas como acetilación, fosforilación, metilación y ubiquitilation [8], [9], [10]. Además de las mutaciones genéticas conocidas que intervienen en la transformación neoplásica, muchas evidencias sugieren que las células cancerosas tienen un mecanismo epigenético alterado ya sea de metilación del ADN o modificaciones de las histonas son modificados en comparación con las células normales [11].
Recientemente, hemos encontrado tanto
in vivo
y
in vitro
que el miR-212 fue fuertemente regulado por disminución en el cáncer de pulmón y que su aumento de la expresión ectópica (factor de necrosis tumoral relacionados ligando inductor de apoptosis) TRAIL sensibilidad de las células de cáncer de pulmón [ ,,,0],12]. Dado que muchos microRNAs regulados negativamente en el cáncer han sido fuertemente relacionada con la hipermetilación isla CpG y /o alteración de las marcas de modificaciones de las histonas [13], [14], [15] que se preguntaban si las mismas modificaciones podrían estar involucrados en el miR-212 silenciamiento en el cáncer de pulmón . Por lo tanto, en este manuscrito se investigó ambos patrones de metilación de ADN y modificaciones de las histonas de miR-212 en la región promotora Calu-1 (NSCLC) y MRC5 (fibroblastos humanos normales derivados de fibroblastos de pulmón fetal) las células que llevan diferentes miR-212 perfiles de expresión. Nuestros resultados muestran que, aunque el sitio de inicio transcripcional de miR-212 se incorpora en una isla CpG, su inactivación transcripcional en cáncer de pulmón no está asociado al estado de hipermetilación del ADN sino a un cambio en el estado de metilación de la histona colas ligado a la región promotora de este microARN. Por otra parte, mediante el uso de muestras de tejido de cáncer de pulmón en diferentes estadificación TNM se analizaron los niveles de expresión de miR-212 y encontramos que su silenciamiento está estrechamente relacionado con la severidad de la enfermedad.
Resultados
La expresión de miR-212 en diferentes etapas de cáncer de pulmón
Recientemente hemos demostrado tanto
in vitro
y
in vivo
que el miR-212 expresión en el cáncer de pulmón es el regulado en comparación con pulmonar normal [12]. Para probar si o no su silenciamiento se correlaciona con el estadio del tumor, las muestras de tejido se obtuvieron de 34 pacientes con CPNM afectadas en diferentes estadificación TNM (características clínicas se resumen en la Tabla 1). A continuación, analizó la expresión de miR-212 de QRT-PCR (Figura 1A). Como se muestra, en las muestras T1 /T2, la expresión de miR-212 es principalmente heterogéneo. Por el contrario, en las muestras de T3 /T4, miR-212 expresión era homogéneamente las reguladas. La Figura 1B muestra la media de las muestras T1 /T2 en comparación con T3 /T4. Estos datos indican que el silenciamiento de miR-212 está estrechamente relacionado con la gravedad de la enfermedad.
(A) RNA total extraído de muestras de tejido recogidas de 34 individuos de NSCLC afectadas en diferente estadificación TNM (T1-T2 -T3-T4) se utilizó para analizar la expresión de miR-212 mediante PCR en tiempo real. (B) Media ± SD de expresión de miR-212 de la piscina T1 /T2 vs T3 /T4. Las barras de error indican SD. * P & lt; 0,05, por test t. Como se muestra, en el T1 /T2 puesta en escena de la expresión de miR-212 es claramente heterogénea, mientras que en el T3 /T4 puesta en escena de la expresión de miR-212 es silenciado fuertemente y se correlaciona con la severidad de la enfermedad.
el papel de la epigenética en el miR-212 expresión- Utilizando el programa CpG Island Buscador (http://www.cpgislands.com/), se encontró que el miR-212 locus se inserta dentro de una isla CpG. Se sabe que varios miRNAs son silenciados epigenetically en asociación con la isla CpG hipermetilación en células de cáncer [16], [17]. por tanto, se investigó si la pérdida de la expresión de miR-212 en el CPNM se asoció con la hipermetilación del ADN. Se analizaron por secuenciación genómica de bisulfito el estado de metilación del ADN de los sitios predichos inicio de la transcripción (DST) de pri-miR-212 [18], [19] en las líneas celulares que expresan diferentes cantidades de miR-212 Calu-1 y MRC5 (Figura 2A). Como se muestra en la figura 2B, en Calu-1 se analizó la región en gran parte bajo-metilado. Para confirmar que el silenciamiento transcripcional de miR-212 en el cáncer de pulmón no se asoció con CpG metilación, las células Calu-1 se trataron con dos concentraciones diferentes de la DNA inhibidor de la metilación 5-aza-2 'desoxicitidina (5'Aza) como se indica . la expresión de miR-212 se evaluó entonces por Q-RT-PCR (Fig. 2C-D). Como se muestra en la Figura 2C-D, tras el tratamiento 5'Aza, miR-212 niveles de expresión se mantuvieron sin cambios. Tomados en conjunto estos resultados indican que la metilación no está relacionado con el miR-212 silenciamiento en el CPNM.
(A) Análisis de la expresión de miR-212 en el CPNM (Calu-1) y fibroblastos humanos normales derivados de los pulmones del feto (MRC5 ) por Real-Time PCR. análisis (B) bisulfito de secuenciación genómica de la isla de miR-212 CpG en células Calu-1 y MRC5. Ocho clones individuales se representan para cada muestra. cuadrados blancos y negros representan CpG metilado y no metilado, respectivamente, y cada barra vertical ilustra un solo CpG. (C) Análisis de la expresión de miR-212 madura por PCR en tiempo real en las células Calu-1 en ausencia (control) o en presencia de 1 mM (panel izquierdo) y 5 M (panel derecho) de inhibidor de la metilación del ADN 5-aza- 2 'desoxicitidina (5-Aza-2dC), como se indica. En CPNM, la hipermetilación del ADN de la isla CpG no se detecta lo que sugiere que esta modificación epigenética no se hace responsable de miR-212 silenciamiento. Medias ± SD se dan de cuatro experimentos independientes por triplicado.
La metilación y acetilación de las histonas análisis asociados a la SAT de miR-212
A continuación, investigado si las modificaciones en las proteínas histonas podría dar cuenta de miR-212 regulación a la baja en el CPNM. Se realizó el análisis chip usando cuatro anticuerpos contra modificaciones específicas de las histonas: H3K4me3 y H3K9ac, normalmente asociada a la cromatina activa la transcripción, y H3K27me3 /H3K9me2 generalmente asociados con la cromatina inactiva la transcripción. Posteriormente, se comparó la histona marca patrón de la predicho miR-212 SST tanto en Calu-1 y células MRC5. Como era de esperar, encontramos diferencias significativas en el estado de metilación de H3K9 y H3K27 y en el estado de acetilación H3K9 (Figura 3). En concreto, en las células Calu-1 que expresan niveles bajos de miR-212, miR-SST de 212 se enriquece con la presencia de las proteínas histonas con modificaciones covalentes que participan en el silenciamiento de genes (H3K27me3 y H3K9me2). Por el contrario, de alta miR-212 que expresan células MRC5 exhibió un aumento de modificaciones de las histonas asociadas con la activación de genes (H3K9ac) en comparación con las células Calu-1. Nuestros datos sugieren que las modificaciones epigenéticas de las histonas en el miR-212 SST contribuyen a su silenciamiento epigenético en el CPNM.
chip y PCR en tiempo real fueron utilizados para estudiar, en Calu-1 y células MRC5, modificaciones de las histonas en el región promotora de miR-212 utilizando anticuerpos dirigidos contra H3K4me3, H3K27me3, H3K9me2 y H3K9ac. Un anticuerpo de control negativo (IgG) se incluyó en el chip de ensayo. Medias ± DE de cuatro experimentos independientes por triplicado, se les da.
alterada la expresión de miR-212 en el CPNM se asocia con cambios en las modificaciones de las histonas
La histona metil transferasa EZH2, un H3K27 específica metil transferasa, es con frecuencia sobre-expresa en cáncer humano [20]. Por otra parte, inmunohistoquímica análisis revelaron que G9a, una metiltransferasa H3K9 específicos, fue altamente expresado en las muestras de tejido de cáncer de pulmón en comparación con las muestras pulmonares normales [21].
Sobre la base de estos hallazgos, se analizaron por Q-RT-PCR la los niveles de expresión de las enzimas EZH2 y G9a en las células Calu-1 y MRC5. Como se muestra en la Figura 4, las células Calu-1 mostró cantidades de EZH2 (A) y G9a (B) en comparación con células MRC5 aumentaron. Por el contrario, los niveles de expresión de H3K9 de-acetylase HDAC no diferían en las dos células de tipo Figura 4C.
(A) Análisis de la expresión de EZH2, (B) G9a y (C) las enzimas de HDAC por Real- Time PCR en las células Calu-1 y MRC5. (D) Análisis de la expresión de miR-212 madura en las células Calu-1 sin tratar (-) o tratadas (+) con siEZH2 y TSA inhibidor o (E) con inhibidores de BIX01294 (BIX) TSA y. las células (D) Calu-1 se transfectaron con específica EZH2-siRNA durante 24 horas. A continuación, las células se incubaron con se evaluó mediante qRT-PCR de 100 ng /ml de TSA durante 24 horas y miR-212 expresión. Se evaluó la baja regulación de la expresión EZH2 después de la transfección siEZH2 por Western Blot utilizando anticuerpos anti-EZH2. Para confirmar la igualdad de carga de la membrana se inmunotransferencia con anticuerpo anti-β-actina. las células (E) Calu-1 se trataron con 100 ng /ml de TSA durante 16 o 24 horas en presencia o en ausencia de 10 mM de BIX durante 16 horas y miR-212 expresión se evaluó mediante PCR en tiempo real. Estos resultados sugieren que en las células Calu-1 la regulación al alza de las enzimas EZH2 y G9a contribuye a aumentar la metilación de las histonas y por lo tanto para disminuir miR-212 niveles de expresión. Medias ± DE de cuatro experimentos independientes por triplicado, se les da.
Los mismos resultados se obtuvieron en otra línea celular de NSCLC, A549. Como se muestra en la figura S2, las células A549 muestran bajos niveles de miR-212 (A), la regulación positiva de la EZH2 (B) y G9a (C) y niveles similares de HDAC (D), en comparación con MRC5.
para confirmar la implicación de las modificaciones de histonas en miR-212 silenciamiento en NSCLC, que inhibe tanto la expresión como la actividad HDAC EZH2 y luego se analizaron los efectos sobre miR-212 expresión en células Calu-1. Para este objetivo, las células Calu-1 se transfectaron con EZH2-siRNA y /o tratados con TSA, un inhibidor específico de la HDAC. miR-212 se evaluó entonces por Q-RT-PCR. Como era de esperar, ya sea mediada por siRNA knock-down de EZH2 metilasa, o mediada por la inhibición de HDAC TSA de actividad-de acetylase contribuido a aumentar el miR-212 niveles de expresión (Figura 4D). Curiosamente, el efecto fue mayor (cuatro pliegues) en la presencia de ambos inhibiciones. Se observó el mismo efecto en las células A549 (Figura S2E). La inhibición de la HDAC EZH2 y produjo un aumento (de dos pliegues) de miR-212 también en MRC5 células (Figura S2F)
.
Con el fin de determinar el papel de G9a de miR-212 silenciamiento, Calu-1 las células fueron tratadas con BIX01294, un inhibidor específico de G9a metilasa, en presencia o en ausencia de TSA. miR-212 se evaluó por Q-RT-PCR. Como era de esperar, el tratamiento con ambos reactivos, contribuyó a aumentar el miR-212 niveles de expresión hasta 5 pliegues (Figura 4E). Tomados en conjunto estos resultados sugieren que la regulación al alza de las enzimas EZH2 y G9a en cáncer de pulmón contribuye a aumentar la metilación de las histonas y por lo tanto para disminuir miR-212 niveles de expresión. Cuando se usa al mismo tiempo, siEZH2 /TSA o BIX01294 /TSA producen mayores efectos sobre la expresión de miR-212 en comparación con la única incubación. Por lo tanto, es posible especular que H3K27me3 o maquinaria mediada por silenciamiento H3K9me2 requiere la actividad de HDAC, como se informó anteriormente por Lachner M
et al
[22].
Efectos de la inhibición de la EZH2, G9a y HDAC en las proteínas histonas
en base a estos hallazgos, nos preguntamos si la inhibición de las enzimas EZH2, G9A y HDAC en células Calu-1 puede causar un cambio en el H3K27me3, H3K9me2 y H3K9ac histona marca pauta en el SAT de miR-212 que afecta a miR-212 niveles de expresión. Para este objetivo, las células Calu-1 se trataron con siEZH2 y TSA y análisis de chip se realizaron con anticuerpos H3K27me3 y H3K9ac, respectivamente. Curiosamente, la inhibición de tanto metilasa (EZH2) y de-acetylase (HDAC), incrementado fuertemente la acetilación de H3K9 y disminuyó significativamente la metilación de H3K27 de miR-212 TSS en comparación con las células no tratadas (Figura 5A). Estos resultados se correlacionan con la sobre regulación de miR-212 en las mismas condiciones experimentales (comparar Figura 4D con la figura 5A). Además, las células Calu-1 se trataron con inhibidores de BIX01294 y TSA y análisis de chip se realizaron usando anticuerpos H3K9me2 y H3K9ac, respectivamente. Como era de esperar, se encontró que la inhibición de la actividad catalítica de cualquiera de metilasa (G9a) o de-acetylase (HDAC), disminuyó fuertemente la metilación de H3K9 y aumentó significativamente la acetilación de H3K9 de miR-212 TSS en comparación con las células no tratadas (Figura 5B) . Tomados en conjunto, estos resultados demuestran firmemente que los cambios específicos en las modificaciones de las histonas determinar el miR-212 silenciamiento en el CPNM.
chip y QRT-PCR se utilizaron para analizar, en las células Calu-1, modificaciones de las histonas en el miR predicho 212 TSS (a) en ausencia (SCRB) o en presencia de TSA y siEZH2, y (B) en ausencia (SCRB) o en presencia de inhibidores de TSA y BIX, respectivamente. (A-B) las células Calu-1 se trataron en presencia de los inhibidores indicados como se describe en la leyenda de la figura 4. Los resultados indican que la modificación de las histonas catalizada por EZH2, G9A y HDAC sitios enzimas están implicadas en miR-212 en el silenciamiento NSCLC. Medias ± DE de cuatro experimentos independientes por triplicado, se les da.
Efecto de la inhibición de la EZH2, G9a y HDAC sobre la apoptosis en las células Calu-1