Extracto
PIK3CA
regulación al alza, la amplificación y mutación han sido ampliamente reportado en los cánceres de ovario y otros tumores, lo que sugiere fuertemente que
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es un objetivo terapéutico prometedor. Sin embargo, hasta la fecha, los mecanismos que subyacen a
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regulación y activación
in vivo
todavía no está claro. Durante la tumorigénesis, interacciones huésped-tumor pueden desempeñar un papel crítico en la edición del tumor. Aquí, se presenta un nuevo mecanismo a través del cual el microambiente tumoral activa el
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oncogén. Se demuestra que
PIK3CA
regulación al alza se produce en regiones tumorales no proliferativas
in vivo
. Hemos identificado y caracterizado el
PIK3CA página 5 'región reguladora aguas arriba de la transcripción y confirmó que
PIK3CA
está regulado transcripcionalmente a través ruta de NF-kB. Estos resultados ofrecen un nuevo mecanismo por el que el microambiente tumoral activa directamente las vías oncogénicas en las células tumorales
Visto:. Yang N, Huang J, Greshock J, Liang S, Barchetti A, Hasegawa K, et al. (2008) La regulación transcripcional de
PIK3CA
Oncogene por NF-kB en el microambiente del cáncer de ovario. PLoS ONE 3 (3): e1758. doi: 10.1371 /journal.pone.0001758
Editor Académico: Edathara Abraham, Universidad de Arkansas, Estados Unidos de América
Recibido: Enero 15, 2008; Aceptó 7 de febrero de 2008; Publicado: 12 Marzo 2008
Derechos de Autor © 2008 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el NCI SPORE P01-CA83638 en cáncer de Ovario (Premio desarrollo de la carrera, LZ); Fondo de Investigación del Cáncer de Ovario (GC y LZ); Mary Kay Ash Charitable Foundation (LZ) y la Sociedad Americana del Cáncer (LZ). AG fue apoyado en parte por una beca predoctoral del Ministerio Helénico de Educación (Programa de Heráclito, EPEAEK). DK fue apoyado en parte por la Asociación Italiana para la Investigación del Cáncer (AIRC)
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El fosfatidilinositol-3 'quinasa (PI-3 quinasa) es un transductor intracelular con especificidad de sustrato de lípidos implicado en una amplia gama de vías de señalización asociadas con el cáncer implicados en el metabolismo de las células tumorales, la supervivencia y la proliferación [1], [2], [3], [4 ], [5], [6], [7]. Se recluta y activa por varios receptores tirosina quinasas y genera segundos mensajeros través de la fosforilación de lípidos de inositol membrana en la posición D3 [3], [8]. PI-3 quinasa fue reconocida primero como oncogén putativa debido a su capacidad para unirse al antígeno T medio del polioma [9], [10]. La clonación molecular de PI-3-quinasas reveló una familia grande y complejo que contiene tres clases de múltiples subunidades y isoformas [3], [8]. Sin embargo, como cada subunidad contribuye precisamente para el progreso y el mantenimiento de cáncer es en gran parte desconocida [3], [5].
El
PIK3CA
gen codifica la subunidad catalítica de p110-alfa, una de las tres proteínas de la subunidad catalítica de la clase IA PI-3-quinasas que por lo general son activadas por factores de crecimiento tirosina quinasas receptoras.
PIK3CA
fue identificado como un oncogén retrovirus codificada aviar que transforma fibroblastos de embrión de pollo [11]. Numerosos estudios recientes indican que
PIK3CA Opiniones y vías descendentes son señalados por amplificación genómica, la mutación o sobreexpresión en tumores sólidos, incluyendo cáncer de ovario [12], [13], [14], [15], [16] , [17], [18], [19], [20]. Estudios anteriores sobre la función de
PIK3CA
han centrado principalmente en trazados de circuito de regulación dentro de la célula cancerosa.
in vitro
,
PIK3CA
juega un papel crítico en la supervivencia y la proliferación [1] celular, [2], [3], [4], [5], [7]. Sin embargo, hasta la fecha aún se desconoce si
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una cierta diversidad de funciones dependiendo del estado y /o el contexto en el que se encuentra la célula tumoral. Por otra parte, no está claro cómo tales funciones de
PIK3CA
podría verse afectada por el entorno del tumor.
Las interacciones dinámicas entre la desregulación genética en las células tumorales y los cambios moleculares y celulares reactivos en células huésped poblar el tumor microambiente juegan un papel crítico en la promoción de la transformación maligna y la progresión del tumor y el crecimiento [21], [22]. Tras la adquisición de alteraciones genéticas críticos, las células tumorales se someten a estrés metabólico /isquémica y editar el microambiente que rodea. A su vez, las células huésped sirven para editar el tumor, la promoción de la selección de las células tumorales que se benefician de las influencias microambiente tumoral. mecanismos de respuesta inmune innata y adaptativa a los tumores que culminan en la inflamación han recibido mucha atención en este contexto, como la inflamación se ha demostrado para promover el crecimiento y progresión del cáncer [23], [24], [25]. leucocitos asociados a tumores producen numerosos factores proangiogénicos que promueven la vascularización del tumor [26], [27], [28], [29]. Además, el factor nuclear kappa-B (NF-kB), un regulador transcripcional crítico de la inflamación, se ha demostrado que desempeñan un papel crítico en la carcinogénesis de la inflamación impulsada y promover el crecimiento del tumor y la progresión [25] [30], [31, ], [32], [33], [34], [35]. Así, se ha postulado que la diafonía continuo y dinámico entre las células tumorales y las células huésped asegura la supervivencia de las células tumorales y sostiene el crecimiento del tumor [21], [22]. Los efectos mutuos de interacciones tumor-huésped se han caracterizado con respecto a la angiogénesis. Sin embargo, cómo las interacciones tumor-huésped afectan directamente las células tumorales sigue siendo parte indeterminada.
Cáncer de ovario
epitelial (EOC), el tumor maligno de ovario más común, sigue siendo la principal causa de muerte entre los tumores malignos ginecológicos [36]. La falta de estrategias de prevención, métodos de diagnóstico precoz y terapias eficaces para el tratamiento de los tumores de ovario recurrente crea una necesidad apremiante de entender su patogénesis y para identificar dianas moleculares para el diagnóstico y la terapia del COE en diferentes etapas de la progresión de la enfermedad [20], [37] , [38], [39], [40], [41]. En este estudio, hemos examinado la expresión de
in vivo PIK3CA
y su relación con el microambiente tumoral en el cáncer de ovario humano. La identificación y caracterización de la
PIK3CA 'transcripcional región reguladora página 5 (TRR), junto con experimentos de validación funcionales confirmado que
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está regulado transcripcionalmente por el microambiente, a través de la inflamación y el NF-kB. Estos resultados ofrecen un nuevo mecanismo a través del cual el microambiente tumoral activa directamente las vías oncogénicas en células tumorales y promueve el crecimiento tumoral.
Materiales y Métodos
Pacientes y muestras
Los especímenes utilizados en este estudio se recogieron en la Universidad de Pennsylvania y la Universidad de Turín, Italia [42]. Los tejidos se obtuvieron después de consentimiento por escrito de los pacientes bajo un protocolo general de recogida de tejido aprobado por el Directorio de la institución de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Pennsylvania y la Universidad de Turín. Todos los tumores fueron de sitio primario, y se recogieron en el momento de la cirugía de reducción de volumen de pacientes no tratados previamente con la etapa III y IV de cáncer de ovario. Las muestras fueron inmediatamente snap-congelado y almacenado a -80 ° C. Las muestras se recogieron en proceso de aprobación local de la junta de revisión institucional y la transformación en los procedimientos aprobados por la Ley HIPAA.
Cultivo Celular
Las células se cultivaron en medio DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS, Invitrogen). En algunos experimentos se incubaron las células en medios enriquecidos con TNF-α humano recombinante (50 o 100 ng /ml, BD Bioscience, San Jose, CA) para las varias horas como se indica.
Total Aislamiento de ARN y cuantitativa Real- tiempo de RT-PCR
ARN total fue aislado de 100 a 500 mg de tejido congelado o 1 × 10
6 células cultivadas con el reactivo TRIzol (Invitrogen). Después del tratamiento con DNasa libre de RNasa (Invitrogen), el ARN total fue utilizando Superíndice primer capítulo de síntesis Kit para RT-PCR (Invitrogen) en condiciones definidas por el proveedor-transcripción inversa. cDNA se cuantificó mediante PCR en tiempo real en el sistema de detección ABI Prism 7900 de la secuencia (Applied Biosystems). Humana
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cebador directo: TCA AAG GCA GAT TGG CTT TT, y el cebador inverso: CCG TCG ACT TGC CTA TTC AG. PCR se realizó usando reactivos SYBR Green PCR Core (Applied Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante. amplificación por PCR del gen de mantenimiento GAPDH se llevó a cabo para cada muestra como control para carga de muestra y permitir la normalización entre muestras. Una curva estándar se construyó con PCR-II TOPO vector de clonación (Invitrogen) que contiene el mismo fragmento insertado y amplificada por la PCR en tiempo real.
Tissue Microarray
La micromatriz de tejido se construyó como se describe anteriormente [43], [44]. En resumen, los tumores fueron incorporados en las secciones de parafina y 5 micras fueron teñidas con hematoxilina-eosina para seleccionar regiones representativas para las biopsias. Cuatro biopsias de tejido de núcleo se obtuvieron de cada muestra. La presencia de tejido tumoral en las muestras dispuestas se verificó en la sección teñida con hematoxilina-eosina.
La inmunohistoquímica (IHC) y Análisis de Imágenes
IHC se realizó utilizando el kit VECTASTAIN ABC como se describe por el fabricante (Vector, Burlingame, CA). Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios (todos de BD Pharmingen menos que se indique lo contrario): conejo anti-humano Ki67 (1:200, Dako, Carpinteria, CA); conejo anti-citoqueratina humana (1:200, DAKO); p65 de conejo anti-humano (1:400, Santa Cruz, Santa Cruz, CA); p110α ratón anti-humano (o 1:250 1:50); de rata anti-ratón CD31 (1:200); ratón HIF1Α anti-humana (1:200); ratón c-Jun anti-humano (1:200); de rata anti-ratón CD11b (1:200). Los anticuerpos se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. La inmunorreacción se visualizó con 3,3'-diaminobencidina (Vector). Doble tinción de inmunofluorescencia se realizó como se describe anteriormente [45]. Brevemente, las secciones se incubaron secuencialmente en suero normal de 5%; anticuerpos primarios durante 2 horas; y la etiqueta fluorescente secundaria de anticuerpos (Vector) durante 30 minutos. Las secciones fueron contrastadas con DAPI antes de ser inspeccionado bajo el microscopio de fluorescencia. Las imágenes se recogieron a través de SNAP fresca de color para cámara digital (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) y el índice de tinción se analizó utilizando Image-Pro Plus 4.1 del software (Media Cybernetics).
TUNEL ensayo
la peroxidasa ApopTag en el kit de detección in situ (Intergen) se utiliza para visualizar las células apoptóticas
in vivo
y
in vitro
. El procedimiento se realizó según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las secciones de tejidos tumorales se fijaron con paraformaldehído al 1% en PBS, seguido de etanol frío y ácido acético después de la fijación. Tras la incubación con los residuos de nucleótidos digoxigenina y desoxinucleótido transferasa terminal de durante una hora a 37 ° C, las células se incubaron con anticuerpo anti-digoxigenina marcado con FITC.
Los plásmidos
El ratón
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cDNA fue proporcionado generosamente por el Dr. Roberts (Universidad de Harvard). Mamíferos plásmido de expresión pCDNA3 fue de Invitrogen. Para la construcción de plásmidos informadores de luciferasa, 5'TRRs del hombre y el ratón
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fueron amplificados de BAC o ADN genómico utilizando ampliar el sistema de Alta Fidelidad PCR (Roche, Indianapolis, IN) y se inserta aguas arriba del gen de la luciferasa de pGL3 vector -Básico (Promega, Madison, WI). Secuencias de 5'TRR en todas estas construcciones indicadoras se verificaron por secuenciación de ADN.
5 'Amplificación Rápida de extremos de ADNc (5' RACE)
ARN total fue extraído con el kit RNeasy Mini RNA se utilizó (Qiagen, Valencia, CA) y el "sistema RACE 5 (Invitrogen). El 5 'RACE PCR producto se introduce en el sistema de clonación TA (Invitrogen).
transfección del plásmido
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos a 3 × 10
5 células /pocillo y crecer durante la noche a ~ 40% de confluencia antes de la transfección. Todos los plásmidos se transfectaron con el reactivo de transfección FuGENE6 (Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para seleccionar las células resistentes a la neomicina, se aplicó 400 g /ml de neomicina (Invitrogen). Para los experimentos de shRNA, las células fueron transfectadas con siRNA expresar pLTsuppressor1.0. En experimentos in vitro indicaron que la supresión de
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ARNm persistió hasta por 30 días. Todos los experimentos de transfección se realizaron por triplicado y se repitieron al menos dos veces con diferentes aislamientos de ADN.
luciferasa reportero de ensayo
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos a 3 x 105 células /pocillo y se cultivaron durante la noche a 40% de confluencia antes de la transfección. Para probar la actividad del promotor de
PIK3CA
, se utilizaron un total de 0,5 g constructo indicador y 0,01 mg control interno PRL-TK (Promega) para cada transfección. Todos los experimentos de transfección se realizaron por triplicado y se repitieron al menos dos veces con el ADN diferentes aislados. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, el análisis de la luciferasa se realizó en Luminoskan ascenso (Thermo-Labsystems, Waltham, MA) usando el Sistema de Ensayo de Luciferasa Dual-Reporter (Promega) según las instrucciones de los fabricantes. Para los experimentos de co-transfección, 1 g de cada plásmido pCMV-I? B? O pCMV-IκBαM (Clonetech, Mountain View, CA) fue utilizado.
La movilidad electroforética cambio de ensayo (EMSA)
extracto nuclear a partir de células se preparó usando NE-PER nucleares y citoplasmáticas de extracción Reactivos más Halt inhibidor de la proteasa Cocktail Kit (Pierce, Rockford, IL) siguiendo los protocolos del fabricante y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. NFkB recombinante (P50) recibió la orden de Promega. 5'-Biotina-etiquetados oligonucleótidos de ADN que contienen la naturaleza humana tipo
PIK3CA
NFkB sitio de unión (GACGTGGGGGATTTTTCGCGTA), mutados
PIK3CA
sitio de unión NFkB (GACGTGGGCGATTTTTCGCGTA), scramble humana
PIK3CA humana
NFkB sitio de unión (TCAGATAGACGAGACTTGAGTC), sitio de unión de control de tipo salvaje NFkB (AGTTGAGGGGACTTTCCCAGG) [35], sitio de control mutado NFkB unión (AGTTGAGGCGACTTTCCCAGG) fueron sintetizados y los dos oligos complementarios se hibridaron para obtener la sonda de doble cadena. EMSA se realizó utilizando LightShift quimioluminiscente EMSA Kit (Pierce). El extracto nuclear (o p50) y 30 fmol de sonda marcada se incubaron en el tampón de unión 10 × más 1 g de poli (dI-dC) en el sistema de reacción 20 l a temperatura ambiente durante 20 min. La totalidad de los 20 l de reacción de unión se cargaron en un gel de poliacrilamida al 7,5% y se ejecutan a temperatura ambiente en 0,25 × TBE a 110 V durante 1-1,5 h. A continuación, la reacción de unión a electroforesis fue transferido a BrightStar-Plus con carga positiva membrana de nylon (Ambion, Austin, TX) en Trans-Blot SD Transferencia electroforética Semi-Dry Cell (Bio-Rad, Hercules, CA) a 15 V durante 30 min y cruz = Conectado en UV Stratalinker 1800 (Stratagene, La Jolla, CA) a nivel reticular de automóviles durante 1 min. La detección de la sonda de ADN marcada con biotina se llevó a cabo siguiendo estrictamente el protocolo del fabricante.
Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP)
chip de ensayo para detectar la unión de la p65 humana
PIK3CA
promotor se realizado usando el kit de ensayo de Upstate chIP (Upstate, Charlottesville, VA) siguiendo las instrucciones del fabricante. ADN esquilada se incubó a 4 ° C durante la noche con 2 g inmunoprecipitar anticuerpo IgG policlonal de conejo a p65 (Santa Cruz) o 2 mg de IgG normal de control de conejo. De entrada y el ADN de la cromatina inmunoprecipitada se utilizó como molde de PCR para la detección de p65 de unión en el promotor (con los cebadores 5'-GCACCAAGACACTACCTTGAATC-3 'y 5'-CTCTGCAGTCCTTTGACTCACTT-3') o en el promotor GAPDH (con los cebadores 5'-GACACCATGGGGAAGGTGAA 3 'y 5'-GAGTAGGGACCTCCTGTTTC-3') usando el kit de PCR Core (Roche).
Bioinformática
Una búsqueda de potencial factor de transcripción sitios en el hombre y el ratón unión
PIK3CA
5'TRRs se realizaron utilizando el programa Mat Inspector V2.2 en http://www.genomatix.de/online_help/help_matinspector/matinspector_help.html [46].
Estadísticas
el análisis estadístico se realizó con el paquete estadístico SPSS (SPSS). Todos los resultados se expresaron como media ± desviación estándar, y p & lt; 0,05 se utilizó para la significación
Resultados
PIK3CA
está regulada al alza en las regiones no-proliferación en cáncer de ovario
Para revelar aspectos espaciales de
PIK3CA
regulación en el tumor
in vivo
, lo primero que examinó la expresión de p110α en muestras de cáncer de ovario humano. Curiosamente, la expresión fuerte p110α se detectó principalmente en grupos de no proliferación, las células tumorales Ki67- (Figura 1 A a C). En estas células, p110α se transloca a la membrana celular (Figura 1 C). Por el contrario, las regiones Ki67 + exhibieron baja expresión de p110α, que se encuentra principalmente en el citoplasma, mientras que sólo pocas células Ki67 + exhibieron p110α en la membrana celular (Figura 1 B). Un microarray de tejido fue utilizado para validar aún más este resultado en el cáncer de ovario humano. En 18 de 30 (60%) tumores, la expresión fuerte p110α (y localización de la membrana) se detectó principalmente en regiones tumorales Ki67-, mientras que en los otros tumores expresión fuerte membrana p110α se detecta ya sea tanto en las células tumorales Ki67- y Ki67 + (5 /30, 16,7%); principalmente en las células tumorales Ki67 + (3 /30,10.0%); o que era indetectable. (4/30; 13,3%)
A a C. doble inmunotinción de p110α (verde, FITC) y Ki67 (rojo, rojo de Texas) en el cáncer de ovario B. Alta ampliación de un ser humano Una región de la baja expresión de p110α. p110α se expresa a niveles bajos y se localiza en el citoplasma de las células tumorales Ki67 positivas. C. alta magnificación de una región de la A con alta expresión de p110α. p110α se expresa en niveles altos y se localiza en la membrana plasmática en las células tumorales Ki67-negativos. D y E. inmunohistoquímica localización de Ki67 permite una clara identificación de las áreas de la proliferación y áreas de células tumorales no proliferativas
in vivo
en 2008 xenoinjertos de tumores de ovario. E. de alta magnificación de área de D que muestra el límite entre una proliferación y una región no proliferantes. F a H. Fuerte expresión y localización de la membrana celular de p110α sólo se encuentra en las zonas Ki67-negativos. F. sección adyacente a D, se tiñeron con anticuerpo contra p110α humana (dilución 1: 250). G. Alta ampliación de la superficie de F muestra el límite entre la proliferación y la región no proliferativas. H. alta magnificación de área de G que muestra la localización de membrana de p110α en la región no proliferantes. I. La inmunotinción de citoqueratina humana identifica las células tumorales que proliferan en las zonas y no proliferan en el modelo de xenoinjerto de 2008. La línea traza el límite entre las dos zonas, como se define por la tinción de Ki67 en sección adyacente (ver J). Ambas regiones proliferantes y no proliferativas son positivas para citoqueratina humana (FITC, verde), lo que indica las células tumorales. Los núcleos celulares se contratiñeron con DAPI. J a L Doble p110α y Ki67 mapas inmunotinción
PIK3CA
activación en la proliferación o no proliferación de las áreas en 2008 xenoinjertos de tumores. J. Ki67 (rojo, rojo de Texas) y p110α (FITC, verde) muestran la expresión recíproca. K y L. de gran aumento de la proliferación de la región (I) y la región no proliferativas (H) de J.
A fin de confirmar este resultado, se determinó xenoinjertos de tumores generados con la línea celular de cáncer de ovario 2008 . La ventaja de este modelo es que las distintas áreas de la proliferación de células tumorales y en reposo pueden ser claramente identificados
in vivo fotos: por tinción Ki67 (Figura 1 D y E) [47]. De manera similar a la expresión recíproca observado en las muestras humanas, se detectó una fuerte expresión en las células tumorales p110α sólo en Ki67-, no proliferativas regiones (Figura 1 F a H). En estas áreas, p110α fue localizada principalmente a la membrana celular (Figura 1 H). Doble tinción confirmó que las áreas que expresan p110α fueron, de hecho, pobladas por células tumorales, que expresan citoqueratina, un marcador de tumor epitelial (Figura 1 I a K). Con la concentración de anticuerpo primario aumentado (de 1:200 a 1:50), la expresión p110α débil también podría ser detectada en las regiones Ki67 +, pero p110α localizado de forma difusa en el citoplasma en estas áreas (Figura 2). Por lo tanto, oncogén
PIK3CA
es upregulated significativamente en las regiones no-proliferación en el cáncer de ovario humano
in vivo
. Estas regiones no proliferantes siempre carecen de apoyo de los vasos sanguíneos y contienen numerosas células necróticas /apoptosis, así como la infiltración de linfocitos ricos (Figura 3).
A. La tinción inmunohistoquímica de p110α usando la concentración de anticuerpo primario alta (01:50) revela baja expresión de p110α difusa en el citoplasma de las células tumorales en las regiones Ki67 positivas (Ki67 +). B y C. Alta ampliación de la no-proliferación (B) y la proliferación de las regiones (C) de A.
A. inmunotinción doble de CD31 (rojo, rojo de Texas) y p110α (verde, FITC) en el modelo de xenoinjerto de 2008. tinción p110α fuerte se detecta principalmente en las regiones tumorales localizadas lejos de los capilares. B. triple tinción de p110α (rojo, rojo de Texas), Ki67 (azul, AMCA) y TUNEL (verde, FITC) en el modelo de xenoinjerto de 2008.
Identificación y caracterización de lo humano y murino
PIK3CA
promotores
para entender mejor las señales de regulación de contribuir a la regulación positiva de
PIK3CA
en el cáncer, 5 'secuencias de regulación aguas arriba de lo humano
PIK3CA
gen eran identificado. 5'-rápida se empleó la amplificación del ADNc extremo (5 'RACE) para identificar el sitio de inicio de transcripción (TSS) de humano
PIK3CA gratis (Figura 4A y B). Un segmento de 125 pb de la región 5 'no traducida (UTR) y 2,3 Kbp de la TRR de humano
PIK3CA
se clonó a partir de cromosoma humano artificial bacteriano (BAC, número de clon: PR11-245C23). Se encontró que la región reguladora aguas arriba 5 'del ser humano
PIK3CA
se encuentra a unos 50 Kbp aguas arriba del sitio de inicio de traducción codón (Figura 4A). Esta región es muy rica en GC (Figura 4B). Mapeo de RT-PCR confirmó además la TSS, de
PIK3CA
, y una pequeña variante de empalme se identificó (Figura 4 C a E). El murino
PIK3CA
'secuencia reguladora aguas arriba 5 fue también clonado por el mismo método, y se encontró que era 63,6% de identidad con la secuencia humana (Figura 5) y para incluir un pequeño intrón.
A. Ilustración de la estructura de PIK3CA
gen humano
y su región reguladora 5 'aguas arriba. B. Una región muy rica en GC se encuentra en el
PIK3CA
5'TRR. C. Ilustración de los cebadores utilizados para la asignación de RT-PCR de la
PIK3CA
sitio de inicio de la transcripción (SST). D. Resultados de mapeo de RT-PCR. No hay banda entre el cebador directo F1 situado aguas arriba de la SST y de marcha atrás R cebador localizado en el exón 1 de
PIK3CA
. Las bandas de tamaño adecuado podría ser detectado entre F2 o F3 imprimación (ambas ubicadas aguas abajo de SST) y revertir RE imprimación Una variante de empalme pequeña se encuentra en el 5'UTR del ser humano
PIK3CA
gen, que puede también ser detectado por mapeo de RT-PCR (cebadores F2 y R). F. Se resumen los resultados de la actividad transcripcional de
PIK3CA
fragmentos TRR.
Para caracterizar mejor la actividad transcripcional de la región promotora, TRR la totalidad de 2,3 kbp 5 'o incrementalmente fragmentos de promotor truncadas se subclonaron junto con un 316 o una región transcripción 150 pb en el vector reportero pGL-básico para revelar la expresión de luciferasa (Figura 4F). actividad transcripcional fuerte se localizó en la región -2340 a -159 pb mediante el ensayo de luciferasa, mientras que la actividad transcripcional disminuyó significativamente después de -159 pb (Figura 4F).
A continuación, el factor de transcripción sitios de unión se predijo en humanos
PIK3CA
5'TRR
in silico fotos: por Genomatix (http://www.genomatix.de/index.html). Se encontraron numerosos sitios de unión para factores de transcripción asociados con el estrés, incluyendo NF-kappa B; factor de inducible por hipoxia (HIF); proteínas de choque térmico (HSP); y la proteína activadora 1 (AP1) (Figura 6). Por lo tanto, las señales de estrés mediados por estos factores podrían regular
PIK3CA
expresión en las células tumorales no proliferativas en las zonas de disminución de la vascularización y el aumento de los linfocitos infiltrantes.
Expresión y localización de la transcripción candidato factores
In situ
la expresión y localización de tres factores reguladores putativos que surgió de la anterior
in silico
análisis, HIF1α; c-Jun, un miembro del complejo AP1; y la subunidad p65 de NF-kB, se proyectó en 2008 xenoinjertos. Dado que la función de estos factores requiere la expresión y translocación nuclear, se consideró que la fuerte expresión y la localización nuclear de evidencia indirecta de la activación funcional. HIF1α expresión nuclear fuerte se observó en los grupos de células irregulares en las regiones Ki67-. proteína HIF1α también se detectó en las regiones Ki67 +, pero principalmente localizada en el citoplasma (Figura 7 A, D y G). la proteína c-Jun se expresó estrictamente en los límites entre Ki67 + y regiones Ki67-, donde sólo se detectó tinción nuclear. Pocas células c-Jun-positivos dispersos también podría ser detectada en regiones Ki67 +, pero nuclear c-Jun no se observó en las regiones Ki67- (Figura 7 B, E y H). localización nuclear fuerte de proteína /p65 NF-kappa B se observó en las regiones Ki67- y en las zonas Ki67 + adyacentes a las regiones Ki67- (Figura 7 C, F e I). Curiosamente, más fuerte NF-kB /p65 nuclear se detectó adyacentes a áreas de necrosis de tejido (Figura 7 F). Estos datos, junto con el
PIK3CA
promotor análisis sugieren que HIF1α y NF-B están implicados en la regulación positiva de
PIK3CA Hoteles en regiones Ki67-
in vivo
. Consistente con esta hipótesis, la vía de hipoxia /HIF ha informado de regular
PIK3CA
en células de cáncer [48]. Puesto que la regulación hipóxica de
PIK3CA
ha sido confirmado, el próximo enfocados en la regulación de los
PIK3CA fotos: por la ruta de NF-kB.
A a C. tinción inmunohistoquímica del candidato factores de transcripción HIF1α, c-Jun y NF-kB en 2008 xenoinjertos. La línea muestra el límite entre las regiones de baja p110α Ki67 +, y Ki67- p110α-alta. D a F. alta magnificación de A a C, respectivamente, muestra la expresión y localización nuclear de HIF1Α, c-Jun y NF-kB en 2008 xenoinjertos. G a I. Ilustración de la localización de la transcripción candidato factores HIF1α, c-Jun y NF-kB en el modelo de xenoinjerto de 2008. Grandes puntos representan localización citoplasmática, mientras que los pequeños puntos representan la localización nuclear. La línea representa el límite entre las regiones de baja p110α Ki67 +, y Ki67- p110α-alta.
NF-kB se une al promotor y regula al alza
PIK3CA expresión
de acuerdo con un importante papel de NF-kB en la regulación de
PIK3CA
, encontramos NF-kB secuencias consenso sitio de unión en
PIK3CA
5'TRRs (Figura 8A) humanos y de ratón. El sitio de unión de NF-kB promotor humanos se encuentra en -807 a -786 pb. Hemos probado si NF-kB regula la actividad transcripcional del ser humano
PIK3CA
promotor
in vitro
. la activación de NF-kappa B requiere la liberación de su subunidad inhibidora I? B?, que permite NF-kappa B translocación al núcleo [34], [35]. Transient forzado expresión de tipo salvaje o mutante I? B? I? B? (IκBαM), ambos de los cuales se une NF-kappa B y bloquear su translocación al núcleo, atenúa la actividad transcripcional de
PIK3CA
promotor, tal como se revela por el ensayo de luciferasa. Extracción del sitio de unión de NF-kappa B de la región promotora abrogada la actividad inhibidora de I? B? O IκBαM (Figura 8 B y C).
A. Ilustración del sitio de unión de NF-kB predicho en humanos (arriba) o murino (parte inferior)
PIK3CA
región promotora. B. Ilustración de las construcciones que comprenden la luciferasa ligado al ser humano
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promotor con (Luc-2340/316) o sin el sitio de unión de NF-kB (Luc-378/316). C. Resumen de las actividades de luciferasa de Luc-2340/316 y Luc-378/316 co-transfectadas con pCMV-I? B? O pCMV IκBαM. D. ensayo gelshift uso de extracto nuclear de células de cáncer de ovario después de la estimulación de TNF-α. Carril 1, sitio de unión de NF-kB de
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promotor humano de tipo salvaje (wt hu
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sonda NF-kB) por sí sola; carriles 2 y 3, en peso hu
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sonda + extracto nuclear NF-B; carril 4, controlar la sonda NF-B + extracto nuclear, carriles 5 y 6, mutado hu
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sonda NF-B + extracto nuclear; carril 7, el control mutado sonda NF-B + extracto nuclear; calles 8 y 9, scramble hu
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sonda NF-B + extracto nuclear. Gel cambio de ensayo E. utilizando proteína /p50 NF-B recombinante. Carril 1, en peso hu
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sonda NF-kB solo; carriles 2 y 3, en peso hu
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sonda NF-B + p50; carril 4, mutado hu
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sonda NF-kB solo; carriles 5 y 6, mutados hu
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NF-B + sonda de p50; carril 7, controlar la sonda NF-kB solo; calles 8 y 9, el control de la sonda NF-B + p50.
La secuencia de unión a NF-kB predicho en el ser humano
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promotor se ensayó adicionalmente usando un ensayo de desplazamiento en gel. proteínas nucleares de 2008 línea celular de cáncer de ovario tratados con TNF-α fueron capaces de cambiar (BIND) secuencias de oligonucleótidos que contienen el sitio de unión de NF-kappa B predicho de
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promotor humano, pero no fueron capaces de cambiar, ya sea mutante o simulacros de secuencias de oligonucleótidos (Figura 8 D). Además, la proteína recombinante /p50 NF-kB fue capaz de cambiar las secuencias de oligonucleótidos que contienen sitios de unión a la predicha NF-kappa B, lo que confirma su presencia en el humano
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promotor (Figura 8 E). Por último, la presencia de sitio de unión a NF-kB en el
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promotor se confirmó mediante un ensayo cromosoma immunoprecipitation (CHIP).
La inflamación podría regular
PIK3CA expresión a través de NF-
kappa B vía
Durante el crecimiento del tumor, el estrés metabólico /isquemia induce la muerte de las células tumorales, el reclutamiento de células inflamatorias, incluyendo los macrófagos. Estas citoquinas proinflamatorias que activan la liberación de la ruta de NF-kB [25], [33], [34], [35]. Hemos trazado la distribución de necrosis, macrófagos infiltrantes de tumor y la activación de NF-kB en el modelo de xenoinjerto de 2008. Morfológica de necrosis se detectó predominantemente en Ki67- p110α + regiones, a menudo situados en su centro (Figura 9 A). la infiltración de macrófagos a paso ligero de CD11b +, que producen citoquinas pro-inflamatorias tales como TNF-α, se encuentra en asociación con áreas de necrosis (Figura 9 B a D).
A. H & amp; E tinción de 2008 tumor revela un área prominente de necrosis (N). B y C. La tinción inmunohistoquímica de murino CD11b revela macrófagos se infiltran en un xenotrasplante de 2008. células CD11b + se infiltran en tumores en regiones Ki67-negativos en la proximidad de necrosis. C. Alta ampliación de B. D. doble inmunotinción de CD11b (verde, FITC) y Ki67 (rojo, rojo de Texas) revela CD11b + macrófagos principalmente en las regiones no proliferativas Ki67-negativos. E. Análisis chip de NF-kB unión al endógena de
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promotor.