Extracto
TREX (transcripción /exportación) es un complejo multiproteico que juega un papel clave en la elongación de la transcripción y el transporte del ARNm desde el núcleo hasta el citoplasma. Hemos informado anteriormente de la purificación de la proteína TREX humana y encontró que la expresión de un miembro de este complejo, p84N5 (referido como hTREX84 o hHPR1), una proteína de unión a RB, en correlación con el tamaño del tumor de mama y la metástasis. Aquí se examinan los mecanismos de expresión aberrante de hTREX84 de mama y células de cáncer ovárico y evaluar su papel en la tumorigénesis. Se demuestra que las células tumorales de ovario sobre-expresa hTREX84 4 veces y 10 veces en comparación con las células epiteliales de la superficie del ovario inmortales, no tumorigénicas y primarias, respectivamente. Reducción de los niveles hTREX84 por pequeños ARN de interferencia como resultado la inhibición de la proliferación celular y G
arresto 2 /M. A pesar de que se observó que la expresión hTREX84 fue inducida por el tratamiento con un agente de desmetilación, 5-aza-2 'desoxicitidina (5-aza-dC), la secuenciación del ADN con bisulfito de sodio y PCR específica de metilación no encontró ninguna evidencia de cambios en la metilación del ADN en el islas CpG de la región reguladora de
hTREX84
. Posteriormente, identificamos varios factores de transcripción, incluyendo sitios de unión de NF-kB en el
hTREX84
promotor del gen y demostramos por inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP) y mutagénesis dirigida al sitio que de RelA /p65 se une e induce sitios
hTREX84
expresión. Finalmente, se muestra mediante técnicas de inmunohistoquímica (IHC) que de RelA /p65 se expresa abundantemente en las células malignas que expresan de manera aberrante hTREX84 lo que indica que de RelA /p65 podría desempeñar un papel fundamental en la regulación de la expresión hTREX84 en el cáncer. Nuestros resultados indican que la sobreexpresión de
hTREX84
está asociada con la transformación de células de cáncer, la proliferación y puede estar regulada por de RelA /p65
Visto:. Guo S, Liu M, Godwin AK (2012) transcripcional La regulación de hTREX84 en células de cáncer humano. PLoS ONE 7 (8): e43610. doi: 10.1371 /journal.pone.0043610
Editor: Zhang Lin, de la Universidad de Pennsylvania School of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 12 Junio, 2012; Aceptado: 23 de julio de 2012; Publicado: 27 Agosto 2012
Copyright: © Guo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos nacionales de Salud, R01 CA140323 y 5U01CA113916, el Programa de Investigación de cáncer de mama del Departamento de Defensa del Ejército de EE.UU. de Investigación médica, DAMD17-03-1-0312, y el Fondo de Investigación del cáncer de Ovario. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el (transcripción /exportación) complejo TREX juega un papel clave en la elongación de la transcripción y el transporte del ARNm desde el núcleo hasta el citoplasma [1]. Este complejo se conserva desde la levadura al ser humano. En la levadura, complejo TREX se compone del complejo THO y factores de la exportación de ARNm Sub2 y Yra1 [2], [3], [4], [5]. complejo THO contiene subunidades heterotetrameric, ThO2, HPR1, Mft1 y Thp2 [6], [7]. Además, TEX1, una proteína de función desconocida, se encontró que era co-purificar con el complejo THO, aunque en cantidades subestequiométricas [3], [5]. componentes complejos TREX también se asocian con GBP2 y Hrb1 [5], [8]. Estas dos proteínas son características de la familia de las serina-arginina-rica de factores de empalme y son reclutados para mRNAs nacientes a través de una interacción física con el complejo TREX durante la elongación de la transcripción [9]. Funcionalmente, el complejo THO juega un papel en la recombinación dependiente de la transcripción y la transcripción [6]. Se ha demostrado que el complejo THO es reclutado para genes activamente transcrito [5] y se requiere para la transcripción de elongación eficiente [4]. mutaciones nulas en cada uno de los genes que codifican las subunidades del complejo THO plomo a un defecto de exportación de ARNm [5], [10].
Recientemente, el
Drosophila Opiniones y complejos TREX humanos se caracterizaron por varios grupos, entre ellos el nuestro [5], [11], [12], [13]. TREX complejo humano incluye ThO2 (levadura componente ThO2), HPR1 (levadura HPR1), UAP56 (Sub2 levadura) y ALY (Yra1 levadura). Además, el complejo TREX humano contiene otros componentes, TREX90 (fSAP79), TREX40 (fSAP35) y TREX30 (fSAP24), que tienen homólogos en
Drosophila
(THOC5, 6 y 7, respectivamente), pero no en la levadura [1], [11], [14]. Tanto el
Drosophila
y los humanos homólogos TREX complejo falta de Mft1 o Thp2. Sin embargo,
Drosophila Opiniones y estudios de interferencia de ARN humanos de ThO2 y /o HPR1 indican que el metazoos y complejo THO humana, al igual que su homólogo de la levadura, las funciones de ARNm de exportación [11], [13]. asociados TREX84 /HPR1 con el alargamiento de la ARN polimerasa II, indicando complejo THO humano también funciones en la elongación transcripcional [12].
Nuestros intereses en HPR1 humana como resultado de nuestra observación de que p84N5 se expresa de manera aberrante en el cáncer de mama humano [15] . p84N5 fue descubierto como una proteína de unión que se asocia con la proteína supresora de tumor retinoblastoma (RB) [16]. Durante mucho tiempo, sirvió como un marcador de proteína nuclear [17], [18]. Sorprendentemente, reconocimos que p84N5 es HPR1 humano, un homólogo de la levadura, en el complejo TREX [11]. Este hallazgo fue confirmado por otros grupos de forma independiente [12], [14] y que se conoce como hTREX84 /HPR1.
El mecanismo de regulación del complejo TREX humana, incluyendo hTREX84 en condiciones normales y células transformadas no es bien estudiado. Nos informan de que hTREX84 se expresa de manera aberrante en cáncer de mama y de ovario y su expresión está regulada en parte por de RelA /p65.
Resultados
La sobreexpresión de la hTREX84 en células de cáncer de ovario humano
Anteriormente, se informó de que la expresión de hTREX84 en tumores de mama está inversamente relacionada con el estado del receptor hormonal [11]. Por otra parte, cuando comparamos la expresión de mRNA en hTREX84 6 de reducción de mamoplastia representante especímenes incluidos 3 premenopáusicas nulíparas y multíparas 3 mujeres premenopáusicas,
hTREX84
la expresión de ARNm fue significativamente elevado en las muestras nulíparas [11] [datos no mostrados]. Estos resultados indican que hTREX84 no sólo está desregulado en los tumores de mama, pero también muy regulada durante la diferenciación de lobular de mama humano normal y podría modificarse por ciertas hormonas, tales como gonadotropina coriónica humana (hCG). Por lo tanto, nos preguntamos si hTREX84 también se expresa de manera aberrante en otros tumores dependientes de hormonas, como el cáncer de ovario. Hemos observado que hTREX84 fue altamente expresado en todos los 30 casos de carcinomas epiteliales de ovario (datos no mostrados). Además, se determinó la expresión hTREX84 (hTREX84 /beta-actina ratio) en cultivos de células primarias epiteliales superficie de ovario humano (manguera) (n = 10), Tag de SV40 líneas de células TUBO inmortales, no tumorigénicas (n = 10) y de células tumorales de ovario líneas (n = 11) por análisis de transferencia Western. Se encontró que la expresión hTREX84 es significativamente elevada en líneas celulares inmortales (valor medio, 0,51) en comparación con células epiteliales primarias (valor medio, 0,125; p = 0,00024) y alcanza su nivel más alto en las líneas celulares de cáncer (valor medio, 2,10; p = 0,0022) (Figura 1a, b).
a, España expresión de la proteína hTREX84 en líneas celulares de cáncer de ovario representativos (OVCAR10, UPN251, UPN275, UPN289), líneas de células epiteliales inmortales (HIO- 118, HIO-102, HIO-104, HIO-113), las células epiteliales primarias (ROE). Las muestras de proteína se separaron en un gel de SDS-poliacrilamida a inmunotransferencia utilizando anti-hTREX84 o anticuerpos monoclonales ß-actina.
B, relación hTREX84 /ß-actina en cultivos primarios de células epiteliales de ovario (epitelial), líneas de células epiteliales inmortales (HIO) y líneas celulares de cáncer (cáncer).
Para más elucidar la importancia biológica de hTREX84 en células de cáncer de ovario, el siRNA contra
hTREX84
se transfectó en un OVCAR10 células. análisis de RT-PCR usando cebadores de oligonucleótidos específicos para la
hTREX84
gen mostró que el nivel de expresión de la transcripción hTREX84 disminuye ~ 70 a 80% a partir de la transfección del ARNsi en células OVCAR10 cuando se compara con la de las células de control . En estas condiciones, las constantes niveles de expresión de la deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato (
GAPDH
) de genes se obtuvieron tanto en las células (Figura 2a). siRNAs dirigidos-hTREX84 reducen eficazmente los niveles de hTREX84, pero no afectó los niveles de transcripciones que no son objeto tales como β-actina (Figura 2b). La inmunotinción confirmó que la proteína hTREX84 se redujo drásticamente en la mayoría de las células tratadas (Figura 2C). El número total de células disminuyeron significativamente después de tratamiento con hTREX84-siRNAs en comparación con las células tratadas con reactivo de transfección o control-siRNA (Figura 2d). Hemos observado que el crecimiento celular se redujo en cultivos tratados con hTREX84-siRNA en comparación con el control (Figura 2e). ensayos Guava nexina mostraron que hubo también una reducción de la anexina V-PE y las células 7-AAD positivos en las células tratadas con hTREX84-siRNAs comparación con los controles y las diferencias también no fueron significativas (p & gt; 0,05) (datos no mostrados). Con el fin de mirar en el mecanismo de acción hTREX84 siRNA, determinamos aún más la distribución del ciclo celular por citometría de flujo y se encontró que el número de células en fase G2-M se redujeron y el número de células en la fase G1 se incrementaron en OVCAR10 tratados con hTREX84 siRNA como en comparación con las células tratadas con ARNsi de control, indicando que hTREX84 puede ser necesario para la entrada en la fase G2-M (Figura 2f). Estos resultados indican que la expresión aberrante de hTREX84 puede contribuir al cáncer de ovario mediante la promoción de la proliferación celular. Se obtuvieron resultados similares usando líneas celulares de tumores adicionales [datos no mostrados].
A, España Análisis de los niveles de ARNm de GAPDH hTREX84 y después del tratamiento de las células con siRNA contra hTREX84 o control siRNA.
B, Análisis de hTREX84 y los niveles de proteína beta-actina después del tratamiento de las células con siRNA contra hTREX84 o control siRNA.
C, España Análisis de la expresión hTREX84 después del tratamiento siRNA durante 72 horas mediante tinción de inmunofluorescencia de las células (
a la izquierda, las células transfectadas con siRNA
de control;
derecho de búsqueda células tratadas con hTREX84-siRNA).
D de búsqueda microfotografías que muestran la morfología tras el agotamiento de hTREX84 (
a la izquierda, las células tumorales transfectadas con siRNA
de control;
la derecha, España células tratadas con hTREX84-siRNA).
E, España Ensayo de proliferación celular de las células tumorales tras el agotamiento de los
hTREX84
. La proliferación celular y la apoptosis (datos no mostrados) se examinó usando Guava ViaCount y ensayos de nexina respectivamente. El número de células viables (x10
4) se representan frente a la duración del tratamiento a las 24, 48, y 72 horas después del tratamiento con ARNsi de control o con hTREX84-siRNA. Se muestran los resultados de tres experimentos independientes. La diferencia es estadísticamente significativa. *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01.
F
. El análisis FACS de las células después de la baja regulación de los niveles de hTREX84. Se muestra el porcentaje de células en G1, S, G2-M después de 72 horas de tratamiento con siRNA (panel izquierdo) o hTREX84-siRNA (panel derecho).
El aumento de la expresión hTREX84 por 5- aza-dC en células inmortales ováricos
en un estudio previo que informó de que
hTREX84
ARNm se expresó de manera aberrante en la gran mayoría de alto grado y carcinomas ductales invasivos de mama [11]. Por otra parte,
hTREX84
niveles de mRNA fueron elevados en las células epiteliales malignas en comparación con las células epiteliales ductales de mama normales, como se demuestra por láser capturado micro-disección y análisis de qPCR. Por lo tanto, se especula que la desregulación de la transcripción de
hTREX84
mRNA puede ser uno de los mecanismos de hTREX84 proteína sobre-expresión en células de cáncer. Para ayudar a dilucidar los mecanismos moleculares que subyacen a la transcripción anormal de
hTREX84
en la tumorigénesis, una línea inmortal, no tumorigénicos de ovario epitelial de la superficie celular, HIO-107 fue tratado con un agente de desmetilación, 5-aza-dC en concentraciones de 1, 5, 10 o 50 mM durante 5 días. ARN totales se aislaron y RT-PCR con cebadores específicos a hTREX84 ADNc o de ADNc se llevó a cabo β-actina. Los resultados mostraron que las intensidades de producto de RT-PCR de
hTREX84
se incrementaron por el tratamiento con 5-aza-dC de una manera dependiente de la dosis (Figura 3). Por el contrario, los productos de la β-actina se amplificaron de manera uniforme de todas las muestras, lo que ilustra que la expresión de β-actina no fue alterada por el tratamiento con 5-aza-dC (Figura 3a, c). También se encontró proteína hTREX84 ser aumentado de la misma manera utilizando el análisis de transferencia Western (Figura 3b, d). Se obtuvieron resultados similares cuando se utilizó una línea celular de cáncer de ovario, OVCAR2, que presentan una baja expresión de hTREX84 endógenos (datos no mostrados).
,
HIO-107 células A fueron tratados con 5 -aza-dC en concentraciones de 1, 5, 10, 50 mM respectivamente durante 5 días. RT-PCR espectáculo
hTREX84
la expresión de ARNm y
B Opiniones, occidental muestran análisis de transferencia de los niveles de proteína hTREX84.
C, D, España mRNA cuantitativa y Western blot datos se calcularon a partir del análisis densitométrico de las bandas con el software ImageJ NIH, respectivamente. Los valores se normalizaron a ß-actina como control interno.
bisulfito de sodio de ADN La secuenciación del promotor y el exón 1 del gen hTREX84
Se identificaron en el GenBank ™ un clon genómico humano (RP11 -70.501) derivado del cromosoma 18p que contiene la secuencia de ADNc humano TREX84 informó inicialmente por Durfee, et al [16] (DDBJ /GenBank ™ /EMBL Data Bank, número de acceso AAA53571), así como otros grupos [5], [19] , [20] (número NM_005131 adhesión). La alineación de la humana
TREX84
ADNc y el clon genómico en el GenBank ™ nos permitió determinar la organización exón-intrón del gen. El ADN genómico se aisló posteriormente a partir de estas células 5-aza-dC tratadas y secuenciación de ADN de bisulfito de sodio se llevó a cabo. Sorprendentemente, los resultados demostraron que todos los dinucleótidos CpG localizar el promotor y el exón 1 hTREX84 regiones de tratados y sin tratar y células HIO107 OVCAR2 estaban desmetilados, lo que indica que los cambios en la metilación del promotor no está asociado con el aumento de expresión de
hTREX84
ARNm y proteínas después de tratamiento con 5-aza-dC.
Para correlacionar aún más el estado de metilación del
hTREX84
promotor y el exón 1 región y la expresión hTREX84, se analizaron 15 casos de cáncer de mama y de ovario líneas de células, 10 casos de cáncer de mama y las líneas celulares inmortales de ovario, 6 casos de carcinoma ductal de mama invasivo, 13 casos de tumores de ovario, así como sus tejidos normales emparejados por la secuenciación del ADN de bisulfito de sodio. Los resultados mostraron que
hTREX84
promotor y el exón 1 en regiones casi se desmetilados todas las líneas celulares (Figura 4a, b).
también se desmetiló hTREX84
promotor y el exón 1 regiones en la mayoría de los tejidos normales. Había sitios CpG metilados esporádicos en los tejidos normales (Figura 4c); sin embargo, metilación aberrante promotor de
hTREX84
no parece ser el mecanismo epigenético principal asociada con la expresión anormal de hTREX84 en tumores de mama y de ovario y de líneas de células tumorales.
A
, la secuencia de ADN de
hTREX84
regiones del regulador. sitios CpG se muestran en color verde. Los nucleótidos están numerados a la derecha desde el código de inicio de la traducción agosto que está subrayado.
B
, sodio bisulfito secuenciación de ADN aislado de tratar (I) y las células tratadas (II). Las estrellas indican los sitios CpG.
C
. Sodio secuenciación de bisulfito de ADN a partir de un tejido normal de mama (N) y un carcinoma ductal invasivo (T). Las estrellas indican los sitios CpG.
Identificación de factores de transcripción unido al promotor del gen hTREX84
Para proporcionar una mejor comprensión de las bases moleculares de hTREX84 sobreexpresión en cáncer de mama y cáncer de ovario , evaluamos factor de transcripción sitios de unión en
hTREX84
regiones del regulador [21] utilizando AliBaba2 (http://wwwiti.cs.uni-magdeburg.de/grabe/alibaba2). Nueve SP1, 7 NF1, 4 AP1, 2 NF-B, junto con otros factores de transcripción sitios de unión se predijo por este programa. Inicialmente nos centramos en dos sitios de unión a NF-kB en la regulación transcripcional de
hTREX84
. En primer lugar hemos utilizado la cromatina immunoprecipitation (CHIP) ensayo para determinar el estado de de RelA /p65, una de las subunidades de NF-kB, en el promotor de
hTREX84
. Tras el chip de protocolo,
hTREX84
regiones promotoras de genes se amplifican y se analizaron mediante PCR semicuantitativa usando pares de cebadores específicos en torno a las regiones de unión de NF-kappa B en el promotor de
hTREX84 gratis (Figura 5a). Uno de mama (MDA-MB-231) y dos líneas de células tumorales de ovario (OVCAR10, OVCAR5) se cultivaron sometido a chip con un anticuerpo (Ab) a de RelA /p65. El enriquecimiento de secuencias específicas de ADN en los inmunoprecipitados de la cromatina, lo que indica una asociación de de RelA /p65 con cadenas de ADN dentro de la cromatina intacta, se visualizaron por amplificación por PCR. Sin unión fue visto en muestras de inmunoprecipitación sin anticuerpo de RelA /p65 (Figura 5b). Estos resultados se confirman cuando se transfectadas transitoriamente plásmidos de expresión de RelA /p65 en una línea de células epiteliales de mama no tumorigénicos, MCF-10F y estimuló la expresión de proteínas hTREX84 (Figura 5c). Por otra parte, cuando derribaron la expresión /p65 de RelA utilizando siRNA dirigidos contra de RelA /p65, los niveles de proteína hTREX84 eran a su vez disminuyó (Figura 5d).
Un
, diagrama esquemático de la hTREX84 promotor indicando el motivo de unión a ADN conservado NF-kB.
B Opiniones, chip de ensayo de de RelA /p65 unión a
hTREX84
promotor del gen en MDA-MB-231 (carril 1, 2); OVCAR5 (carril 3, 4); OVCAR 10 (carril 5, 6). Las células se cultivaron durante 48 h. a continuación, los ensayos de chip se realizaron con anticuerpo anti-de RelA /p65. análisis de PCR se realizó en muestras de inmunoprecipitación sin anticuerpo (carril 1, 3, 5), con anticuerpo de RelA /p65 (carril 2, 4, 6).
C
, las células MCF-10F se transfectaron transitoriamente con un vector de control (carril 1) o una expresión de ADNc de RelA /p65 construir durante 48 horas. Western blot RELA /p65, hTREX84 y β-actina.
D
, Western blot de de RelA /p65, hTREX84 y β-actina niveles de proteína después del tratamiento de MDA-MB-231 células con siRNA control (carril 1) y siRNA contra de RelA /p65 (carril 2) para 72 horas.
a fin de determinar si el NF-kB regula directamente la actividad del promotor hTREX84 a través de estos dos sitios de unión de NF-kB, se realizó un ensayo de transfección transitoria en células MCF-10F con reporteros hTREX84 /pGL3. construcciones de indicador que contiene mutados sitios de unión de NF-KB (Figura 6a, b), que se generaron por mutagénesis dirigida por PCR, se compararon con la secuencia de tipo salvaje en presencia de de RelA /p65. Los resultados mostraron todos los reporteros que contienen NF-kB mutado sitio (s) de unión han reducido la actividad del promotor (Figura 6c).
A, secuencia de ADN Red de NF-κB1M lo que demuestra que la primera sitio de unión a NF-kB está mutado a partir de 5'-GGAAACTCCC-3 'a 5' CCAAACTCCC-3 '.
B, secuencia de ADN
de NF-κB2M, lo que demuestra que el segundo sitio de unión a NF-kB está mutado a partir de 5'-AGGTAATCCA-3 'a 5' ACCTAATCCA-3 '. N5-κB1 /2M representada ambos de los dos sitios de unión a NF-kB en hTREX84 región promotora se mutaron como se describe anteriormente (secuencia que no se muestra).
C
, las actividades del promotor entre los tres constructos reporteros que contienen ya sea un solo sitios de unión de NF-kB mutado o ambos (NF-κB1 /2M) según lo determinado por un ensayo de luciferasa. 1) Tipo Salvaje NF-B sitios de unión; 2) NF-κB1M; y 3) NF-κB2M; y 4) NF-κB1 /2M.
Desde nuestros estudios anteriores encontraron que hTREX84 fue altamente expresado en el núcleo de la célula, especialmente en los cánceres de mama humanos pobremente diferenciados y más agresivos [11], nos preguntó si de RelA /p65 también puede expresarse de una manera similar. Se examinó la expresión de la proteína de de RelA /p65 mediante análisis inmunohistoquímico en 89 casos de cáncer de mama humano, así como 5 tejidos normales de mama (Tabla 1). Este panel incluye tumoral 22, 33 y 34 casos de tumores bien diferenciados, moderadamente y mal, respectivamente. De RelA /p65 fue débilmente (0 /+ 1) detectado en células normales epiteliales de mama (4 de 5) y tinción de proteínas indica la localización citoplasma de la célula (Figura 7a). RELA tinción /p65 también se observó principalmente en el citoplasma en los tumores bien diferenciados (Figura 7b). Claramente de tinción granular con un mayor número de núcleos teñidos positivamente se observó en los especímenes de tumores pobremente diferenciados (+ 2 /+ 3, 31 de 34) (Fig. 7C). Ambos de RelA /p65 y hTREX84 son altamente expresado en el cáncer más agresivo que indica que de RelA /p65 y /o hTREX84 puede tener un papel en la progresión tumoral y la metástasis.
Un
, de RelA /p65 se detectó débilmente en las células epiteliales de mama normales y los productos positivos se encuentra en el citoplasma de la célula.
B Opiniones, tinción RELA /p65 se detectó principalmente en el citoplasma en altas tumores diferenciados.
C
, se detectó tinción intensa y claramente granular RELA /p65 en muestras de núcleos teñidos de bajos tumorales diferenciadas.
D
, la sección del tumor evaluado sin el anticuerpo primario para servir como control negativo. Aumento de 200x.
Discusión
En este informe, hemos ampliado nuestra observación previamente que la sobreexpresión de hTREX84 no sólo se asocia con el cáncer de mama agresivo, pero también se asocia con células aberrantes proliferación en el cáncer de ovario. hTREX84 de localización nuclear en el cáncer de ovario, así como en otros tipos de cáncer, como el de mama [11], cáncer de pulmón [22] se encuentra para ser situado en el centro de procesamiento de la matriz y el ARN nuclear. hTREX84 regula la elongación de la transcripción de un subconjunto de genes mediante la participación en el complejo de proteínas TREX [11], [12], que se conserva desde la levadura a humanos. Además, hTREX84 también está involucrado en la transcripción de elongación, pre-empalme de ARN, y la exportación de ARNm. Hemos explorado los mecanismos moleculares que regulan la sobre expresión de hTREX84 en células de cáncer. Desde
hTREX84
niveles de mRNA son significativamente elevados en los tumores de mama y las líneas celulares tumorales, especuló que los mecanismos epigenéticos pueden contribuir a este fenotipo. Es bien sabido que la metilación de DNA en los dinucleótidos CpG es un mecanismo importante para la regulación de la expresión génica en células de mamífero [21], [23]. La metilación de citosinas en la secuencia de CpG se encuentra en las regiones reguladores de algunos genes se piensa para asegurar el silenciamiento de algunos genes específicos de tejido en nonexpressing células. metilación aberrante ahora se considera una importante alteración epigenética que ocurre en el cáncer humano [24], [25]. La hipermetilación de genes supresores de tumor normalmente no metiladas se correlaciona con una pérdida de la expresión en líneas celulares de cáncer y tumores primarios [26], [27], [28]. Por otro lado, el hecho de reprimir genes adecuadamente por desmetilación anormal de genes restringido de tejido o por la hipometilación de los proto-oncogenes podría resultar en la pérdida de especificidad de tejido y podría promover la formación del cáncer [29], [30], [31]. En estudios previos, se ha demostrado que el promotor γ-sinucleína, que tiene un patrón similar de sitios CpG como
hTREX84
, se hypomethylated en muchos tumores sólidos humanos que expresan de manera aberrante esta proteína [32], [33]. La hipótesis de que
hTREX84
pueden ser regulados por un mismo mecanismo. De hecho, 5-aza-dC induce hTREX84 en todas las células tratadas, pero indirectamente como se evidencia por la falta de cambios en la metilación en los sitios de CpG, lo que indica que la hipometilación no está directamente asociado con el aumento de expresión de
hTREX84
mRNA y proteína. Estos resultados fueron confirmados aún más cuando analizamos una serie de tumores de mama y de ovario y líneas de células tumorales y tejidos normales para pruebas de metilación aberrante mediante secuenciación de ADN con bisulfito de sodio. Los sitios CpG en el
hTREX84
promotor y regiones exón 1 se desmetilados mundo, con independencia del nivel de
hTREX84
expresión. Los resultados sugieren que la metilación anormal hTREX84 no se asocia con una elevada expresión hTREX84 en tumores de mama y de ovario y puede ser regulada por otros mecanismos epigenéticos.
Hay varias posibilidades que podrían explicar por qué 5-aza-DC no induce expresión hTREX84 directamente a través de hTREX84 estado de metilación de genes. Por ejemplo, 5-aza-dC puede tener efectos dramáticos sobre los cromosomas, dando lugar a la descondensación de estructura de la cromatina, por lo tanto potenciar la expresión de genes específicos [34], [35]. Otra posibilidad es que el 5-aza-DC podría afectar a algunos factores de transcripción que influyen en la expresión hTREX84 posteriormente.
Para proporcionar una mejor comprensión de las bases moleculares de hTREX84 sobre-expresión en la inmortalización celular y tumorigénesis, hemos identificado el factor de transcripción sitios en el
p84N5
promotor de unión. Nos centramos en el factor nuclear kappa B de (NF-kB) y validarlo por varias razones. NF-kappa B no es una proteína única, pero un pequeño grupo de dímeros de proteínas estrechamente relacionados que se unen a un motivo de secuencia común conocido como el sitio kappa B [36]. De acuerdo con Hanahan y Weinberg, tumorigénesis requiere seis alteraciones esenciales en la fisiología normal de las células: la autosuficiencia en las señales de crecimiento; insensibilidad a la inhibición del crecimiento; la evasión de la apoptosis; inmortalización; angiogénesis sostenida; y la invasión tisular y la metástasis [37]. NF-kappa B es capaz de inducir varias de estas alteraciones celulares [38], y se ha demostrado para ser activado de forma constitutiva en algunos tipos de células de cáncer incluyendo cáncer de mama. Estudios anteriores han documentado la actividad de NF-kB de unión a ADN elevada o constitutiva tanto en líneas celulares de carcinoma de mama y en células de cáncer de mama primarios de origen roedor [39] humana y, [40], [41]. Esto podría ser correlacionado con el aumento del nivel de los receptores de la familia del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) [42]. El uso de un inmunoprecipitación de la cromatina [43], [44] y ensayos funcionales hemos demostrado claramente que de RelA /p65, una de las subunidades de NF-kB, se une al promotor de
hTREX84
e influenciado
hTREX84
expresión mRNA. Por otra parte, una vez agotadas, específicamente por enfoques siRNA, pérdida de de RelA /p65 bloquea la expresión hTREX84. A fin de determinar si el NF-kB regula directamente
hTREX84
promotor de la actividad a través de los sitios de unión de NF-kappa B, se realizó un ensayo de luciferasa promotor en el que los sitios de unión de NF-kB se mutaron individualmente o en combinación. Los resultados mostraron que los sitios de unión de NF-kappa B eran esenciales para la máxima actividad de promotor. Además, examinó la expresión de la proteína de de RelA /p65 por inmunohistoquímica en muestras de cáncer de mama humano y mostró un patrón consistente de sobre-expresión en tumores más agresivos, poco diferenciados. Por lo tanto, de RelA /p65 se expresa en una manera similar a hTREX84 [11], lo que indica que estas dos proteínas pueden contribuir de manera cooperativa para la progresión tumoral y la metástasis.
NF-kappa B y su relación subunidad /p65, en particular, pueden promover tumorigénesis a través de su capacidad para inducir la expresión de genes anti-apoptóticos como
Bcl-XL
,
XIAP
y
IEX
1L [45], [46]. NF-kappa B también puede estimular la proliferación del tumor a través de la inducción de ciertos oncogenes tales como ciclina D1 [47] y c-MYC [48]. Otros genes diana NF-kB que contribuyen migración de células tumorales y /o metástasis incluyen la adhesión celular molecular, tales como ICAM-1 y VCAM-1 [49]; metaloproteinasas de la matriz, tales como la MMP-9; receptores de quimioquinas, tales como CXCR4, y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) [50]. En un informe reciente, el NF-kappa B se mostró para regular una amplia red de genes, mucho más de lo estimado originalmente [51]. El significado de
hTREX84
como una nueva diana de RelA /p65 no debe pasarse por alto tan simple otro gen regulado NF-kB, desde entonces. hTREX84 es esencial para la elongación de la transcripción y de ARNm de exportación [11]. Por lo tanto, es interesante especular que NF-kB podría mediar directamente el metabolismo del ARNm mediante la regulación de
hTREX84
en las células cancerosas. NF-kappa B también se conoce para inducir la expresión de algunas citoquinas y quimiocinas y, a su vez, es inducida por ellos [48], [52]. Esta retroalimentación positiva mechanismis generalmente se mantiene en jaque a producir una reacción crónica o excesiva asociada con ciertas enfermedades cuando NF-kB se convierte de manera aberrante activa [52]. hTREX84 y /p65 relación subunidad de NF-kB también podrían ser activados mutuamente en el cáncer de mama agresivo. En estudios previos hTREX84 estimuló la transcripción de de RelA /p65 [53]; sin embargo, no ha sido bien establecido el papel de hTREX84 como un factor transcripcional. También se observó que la expresión hTREX84 es mayor en los receptores de estrógenos (ER) cáncer de mama negativo [11], mientras que la activación constitutiva de NF-kappa B se ha demostrado que se asocia con cánceres de mama más agresivos [40], [42], [54] . Como tal, la falta de dianas moleculares en cáncer de mama ER-negativo sigue siendo un obstáculo terapéutico importante. Al igual que NF-kB, hTREX84 podría considerarse como un objetivo terapéutico ideal para los cánceres de mama ER-negativos.
Otros factores de transcripción pueden contribuir a la regulación de los
hTREX84
. Cuatro AP-1 sitios de unión se identificaron en el
hTREX84
región promotora. El factor de transcripción AP-1 es un complejo dimérico que contiene los miembros de la junio, FOS, ATF y las familias de proteínas MAF [55]. Elevado de actividad de AP-1 también se encontró en tumores de mama humanos y líneas de células tumorales de mama resistentes a las drogas [56], [57], [58]. NF-kappa B puede aumentar indirectamente la expresión de genes regulados por AP-1 mediante la asociación física con AP-1 [59]. El posible papel de otros factores de transcripción AP-1 y en la regulación de
hTREX84
expresión no se habían determinado; Sin embargo, nuestros estudios recientes han demostrado que de RelA /p65 juega un papel fundamental en la regulación de
hTREX84
expresión en cáncer de mama y de ovario.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y de la célula Cultura y
medios y reactivos de cultivo celular fueron preparados por el Fondo para el cultivo celular en el Fox Chase Cancer Center. Se establecieron diez humana de ovario epiteliales superficiales (manguera) cultivos de células primarias y 10 Tag líneas de células SV40 inmortales, no tumorigénicas manguera y se cultivaron en medio 199 con 15% de SFB y la insulina (290 unidades /por cada 500 ml) como se ha descrito anteriormente [ ,,,0],60]. Las células epiteliales inmortalizadas de mama humano MCF-10F (HMECs), que se cultivaron en medio DMEM /F12 suplementado con 5% de suero de caballo, insulina, hidrocortisona, factor de crecimiento epidérmico, toxina del cólera, y los antibióticos, se establecieron a partir de un paciente con enfermedad fibroquística y no muestran características de un fenotipo maligno [61], [62]. líneas celulares de cáncer de ovario humano OVCAR2, OVCAR3, OVCAR4, OVCAR5, OVCAR8, OVCAR10, UPN251, UPN275, UPN289, UPN300, A2780 [63], [64], [65], [66], y las líneas celulares de cáncer de mama, MDA-