Extracto
La expresión de los gangliósidos es a menudo asociada con la progresión del cáncer. Sialiltransferasas han recibido mucha atención en términos de su relación con el cáncer, ya que modulan la expresión de gangliósidos. Hemos demostrado anteriormente que la producción GD1a fue alta en líneas celulares de cáncer de próstata resistentes a la castración, PC3 y DU145, debido principalmente a su alta expresión de β-galactósido α2,3-sialiltransferasa (ST3Gal) II (no ST3Gal I), y la expresión de tanto ST3Gals estaba regulada por NF-kB, principalmente por RelB. Nos documento demuestran que GD1a fue producido en abundancia en muestras de tejidos cancerosos de pacientes humanos con cáncer de próstata sensibles a las hormonas, así como los cánceres de próstata resistente a la castración. La expresión de ST3Gal II fue activado constitutivamente en líneas celulares de cáncer de próstata resistentes a la castración, PC3 y DU145, debido a la hipometilación de la isla CpG en su promotor. Sin embargo, en las células LNCaP de andrógenos-agotado, una línea celular de cáncer de próstata sensible a las hormonas, la expresión de ST3Gal II fue silenciado debido a la hipermetilación de la región promotora. La expresión de ST3Gal II en las células LNCaP aumentó con el tratamiento con testosterona debido a la desmetilación de los sitios CpG. Esta expresión ST3Gal II testosterona dependiente fue suprimida por RelB siRNA, lo que indica que RelB activa ST3Gal II transcripción en el promotor desmetilado testosterona inducida. Por lo tanto, en los cánceres de próstata sensibles a las hormonas, la producción de GD1a puede estar regulada por andrógenos. Este es el primer informe que indica que la expresión de una sialiltransferasa está regulado transcripcionalmente por desmetilación dependiente de andrógenos de los sitios CpG en su promotor del gen
Visto:. Hatano K, Miyamoto Y, Mori M, Nimura K, Nakai Y, Nonomura N, et al. (2012) regulada por andrógenos control transcripcional de sialiltransferasas en células de cáncer de próstata. PLoS ONE 7 (2): e31234. doi: 10.1371 /journal.pone.0031234
Editor: Irina Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 10 Agosto, 2011; Aceptado: January 4, 2012; Publicado: 8 Febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Hatano et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyada por el Programa de Promoción de Estudios Fundamentales en Ciencias de la Salud del Instituto Nacional de Innovación Biomédica (identificación del proyecto: 10-03) y por el norte de Osaka (Saito) biomédica basada en el conocimiento del proyecto de creación del clúster. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Muchas células cancerosas tienen glicanos sialilados aberrantes en su superficie. Estas moléculas aberrantes pueden estar implicados en la progresión del cáncer [1] - [3], pero glicanos sialilados también juegan muchos papeles en organismos sanos y las células no cancerosas, incluyendo la embriogénesis, la regulación de la respuesta inmune y la unión del virus que conduce a infecciones [4 ], [5]. glicanos Sialylated son sintetizados por sialiltransferasas, que añaden ácidos siálicos a las cadenas de oligosacáridos de glicoproteínas y glicoesfingolípidos (GSL) [5]. Hasta la fecha, 20 sialiltransferasa genes han sido clonados, y las respectivas enzimas se han agrupado en cuatro familias de acuerdo con los vínculos de hidratos de carbono que catalizan: ß-galactósido alfa 2,3 sialiltransferasas (ST3Gal I-VI), β-galactósido α2,6- sialiltransferasas ST6Gal (I y II), GalNAc alfa 2,6 sialiltransferasas (ST6GalNAc I-VI), y α2,8-sialiltransferasas (ST8Sia I-VI) [6]. Durante la transformación neoplásica y la progresión del cáncer, la actividad de las sialiltransferasas a menudo se altera, y, en consecuencia, las células cancerosas tienen más fuertemente glicanos sialilados en su superficie de las células no cancerosas [1], [2], [7].
GSL que contienen ácidos siálicos son conocidos como gangliósidos y se expresan en niveles altos en varias células cancerosas [3]. Los gangliósidos presentes en las células de cáncer se utilizan como biomarcadores o los objetivos de tratamiento, y los gangliósidos enriquecidos difieren entre los tipos de células de cáncer [8] - [10]. Nos hemos centrado en la síntesis GD1a en las células cancerosas, ya GD1a tiene varias acciones biológicas que promueven la progresión del cáncer. Por ejemplo, las células cancerosas altamente metastásicas tienen abundante GD1a, y GD1a está implicado en la adhesión de células de cáncer a las células endoteliales durante la metástasis [11]. El GD1a derramada por células tumorales en el microambiente tumoral promueve la angiogénesis y aumenta la señalización del factor de crecimiento mediante el aumento de la dimerización de receptores de factores de crecimiento [12] - [15]. Por lo tanto, GD1a puede estar involucrado en la proliferación de células cancerosas y la metástasis. Además, este gangliósido es un receptor para el virus Sendai [16], y se inactiva Sendai partículas de virus [virus hemaglutinante del Japón sobre (VHJ-E)] inducir la apoptosis en varias células cancerosas humanas con GD1a enriquecido en su superficie [17]. Por lo tanto, GD1a puede ser una molécula atractiva desde el punto de vista de la terapia del cáncer
GD1a se ha informado de que se produce abundantemente en células de cáncer de próstata resistentes a la castración [17] - [20]., Y previamente demostrado que la castración células de cáncer de próstata resistentes se erradicaron de manera efectiva por VHJ-E [17]. GD1a se sintetiza a partir GM1 por ST3Gal I y II. El valor de Km de ST3Gal II para GM1 es menor que el de ST3Gal I; Por lo tanto, ST3Gal II contribuye preferentemente a la síntesis GD1a [6], [21] - [24]. Recientemente hemos demostrado que abundante producción de GD1a en células de cáncer de próstata resistentes a la castración se correlaciona con los altos niveles de expresión ST3Gal II [20] y que la expresión ST3Gal II está regulada por NF-kB, principalmente por RelB, en el cáncer de próstata resistente a la castración las células [20]. Aunque los niveles RelB fueron similares en una línea celular de cáncer de próstata hormono-sensible (LNCap) y las células de cáncer de próstata resistentes a la castración, y aunque ST3Gal que se expresó en las células LNCaP [20], la expresión de ST3Gal II fue silenciado en las células LNCaP, y GD1a era mucho menos abundante en las células LNCaP [17], [20]
no ha sido hasta ahora ningún análisis publicado de los niveles de gangliósidos en muestras de tejido canceroso de pacientes humanos con cáncer de próstata.; sin embargo, se observó una respuesta inmune endógena a GD1a en pacientes con cáncer de próstata sensible a las hormonas, pero no en los controles sanos [19], lo que sugiere que GD1a se produce abundantemente en los cánceres de próstata sensibles a hormonas. El cáncer de próstata exhibe crecimiento dependiente de andrógenos y la progresión [25]; Por lo tanto, los andrógenos también pueden regular la producción GD1a que se relaciona con la progresión del cáncer. Sin embargo, también se han publicado estudios que han examinado el control hormonal de la síntesis de glucanos sialilado
.
El objetivo de este estudio fue determinar si GD1a se produce en abundancia en los cánceres de próstata sensibles a las hormonas en los pacientes y para analizar el control transcripcional de sialiltransferasas, especialmente ST3Gal II, necesaria para la síntesis de GD1a en los cánceres de próstata sensibles a las hormonas.
Materiales y Métodos
Ética declaración
escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes para el uso de sus muestras de tejido, y el uso de dichos especímenes fue aprobado por el Consejo Institucional hospital de la Universidad de Osaka Revisión (Osaka, Japón).
cultivo de células
la castración líneas celulares resistentes humanos de cáncer de próstata, PC3 y DU145, y una línea celular de cáncer de próstata humano sensible a hormonas, LNCaP clon FGC, se adquirieron de la American Type Culture Collection (Rockville, MD). Una célula de próstata humana normal epitelial, PNT2, se adquirió de la Colección Europea de Cultivos de Células Animales (Porton Down, Reino Unido). células PC3 se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco F12 (Nacalai Tesque, Kyoto, Japón), y las células DU145, LNCaP, y PNT2 se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Nacalai Tesque, Kyoto, Japón). Todos los medios se complementaron con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 U /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina. Las células se incubaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de CO
2.
Reactivos y anticuerpos
tricostatina A (TSA) y 5-aza- 2 'desoxicitidina (5-azadC) fueron adquiridos de Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japón). La testosterona se adquirió de Tokyo Chemical Industry (Tokio, Japón). La bicalutamida se adquirió de Enzo Life Sciences (Plymouth Meeting, PA). Las enzimas de restricción,
Msp I y
Hpa II
, se adquirieron de New England Biolabs (Ipswich, MA). Anti-humano RelB (C1E4) fue adquirido de Señalización Celular (Danvers, MA). β-actina anti-humano (AC-15) fue adquirido de Abcam (Cambridge, Reino Unido).
Real-time RT-PCR cuantitativa
El ARN total se aisló utilizando un kit de aislamiento de ARN RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). El cDNA se sintetizó usando una alta capacidad de cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). PCR en tiempo real cuantitativa se realizó con un 7900 HT rápido sistema de PCR en tiempo real de Applied Biosystems bajo las siguientes condiciones: 95 ° C durante 10 min seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 60ºC durante 1 min. Las mezclas de sondas y pares de cebadores específicos para ST3Gal humano I (Hs00161688_m1), ST3Gal II (Hs00199480_m1), ST3Gal VI (Hs00196086_m1), RelB (Hs00232399_m1), y la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (Hs99999905_m1) se compraron de Applied Biosystems . Los niveles relativos de expresión se calcularon a partir de una curva patrón obtenida usando diluciones logarítmicas de cDNA que contiene el gen de interés, y los valores se normalizaron a GAPDH, un control interno.
Evaluación usando un gen reportero
los genes se transfectaron en células junto con un constructo indicador de luciferasa conducido por un sitio de unión de NF-kappa B, de RelA, y RelB (NF-kappa B gen indicador de luciferasa; BD Bioscience Clontech, Palo Alto, CA), utilizando el reactivo Fugene HD (Roche, Basilea, Suiza). La actividad luciferasa se midió con el sistema de ensayo de doble-luciferasa (Promega, Madison, WI).
Western blot
fueron cosechadas y lisadas con RIPA Las células de tampón de lisis. Las muestras de proteína se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio. Las proteínas separadas se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno, a continuación, las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5% y se incubaron durante la noche a 4 ° C con anti-RelB (1:500) o anti-β-actina (1:2000) anticuerpos. Las membranas se lavaron y se marcaron con una dilución 1:2000 de anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora. La detección por quimioluminiscencia se realizó de acuerdo a la guía del usuario ECL (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido). Las imágenes fueron capturadas con ImageQuant LAS 4000mini (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido), y la cuantificación de las señales de Western blot se realizó por densitometría con el software ImageQuant TL (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido).
experimentos de interferencia de ARN
El siguiente de la doble cadena de sigilo pequeños ARN de interferencia (siRNA) y oligonucleótidos de ARN codificado se compraron de Invitrogen (Tokio, Japón): siRNA oligonucleótidos contra RelB eran (sentido) 5 'UCUUCAGGGACCCAGCGUUGUAGGG-3' y (antisentido) 5 '-CCCUACAACGCUGGGUCCCUGAAGA-3'. Las transfecciones se realizaron con Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen, Tokio, Japón), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
PCR específica de metilación (MSP) análisis
metilación del ADN se examinó en las islas CpG de una análisis de MSP como se informó anteriormente [26]. Para el análisis de MSP, el ADN genómico se extrajo de las células y se purificó usando el kit de ADN QIAamp (Qiagen, Valencia, CA). El ADN genómico se somete a la conversión de bisulfito usando un metilación del ADN Kit EZ (Zymo Research, Irvine, CA). Basándose en la secuencia del promotor p1 ST3Gal II y ST3Gal I P1 promotoras, cebadores metilados específicos y cebadores no metilados específicos fueron diseñados utilizando el programa de versión de metilo Primer Express Software 1.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA). El cebadores ST3Gal metilado-II-específicos fueron sentido, 5'-TAGGGCGTAGCGGTTTTATC-3 ', antisentido, 5'-ACTAACCGAAAACGCCTCTC-3', y los cebadores ST3Gal II-metilado específicos fueron sentido, 5'-GGTTAGGGTGTAGTGGTTTTATT-3 ', y antisentido, 5'-CACACTAACCAAAAACACCTCTC-3 '. El ST3Gal II región 5 'no traducida -659 a -495 fue elegido para el análisis de MSP. El cebadores ST3Gal metilado-I-específicos fueron sentido, 5'-TAGGGTCGGTCGTAGTGTTC-3 ', antisentido, 5'-ACCGATCCCCTACTAACGAC-3', y los cebadores ST3Gal I-metilado específicos fueron sentido, 5'-TTAGGGTTGGTTGTAGTGTTT-3 ', y antisentido, 5'-AACCAATCCCCTACTAACAAC-3 '. La región 5 'no traducida ST3Gal I -697 a -535 fue elegido para el análisis de MSP. cebadores El gen de la glutatión S-transferasa-π (GSTP1) -methylated-específicos fueron sentido, 5'-AGTTGCGCGGCGATTTC-3 ', antisentido, 5'-GCCCCAATACTAAATCACGACG-3', y los cebadores GSTP1-metilado específicos fueron sentido, 5 ' -GATGTTTGGGGTGTAGTGGTTGTT-3 ', y antisentido, 5'-CCACCCCAATACTAAATCACAACA-3', como se describe anteriormente [27]. ADN genómico purificado se trató con bisulfito de sodio fue amplificado por PCR como sigue: 2 min a 95 ° C para la desnaturalización, 35 ciclos de amplificación (95 ° C durante 30 s, 56 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 30 s) . ADN genómico humano o enzimáticamente metilada de ADN genómico humano (Chemicon International, Temecula, CA) fue bisulfito convertido y utilizado como control positivo para los genes metilados o metilados. La ausencia de un molde de DNA sirvió como un control negativo. Los productos se analizaron en geles de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio.
Aislamiento de GSL ácidas a partir de tejidos de cáncer de próstata
Los pacientes diagnosticados con cáncer de próstata se habían sometido a una biopsia de próstata o la resección de los tumores en la Universidad de Osaka hospitalaria (Osaka, Japón). muestras de tejidos cancerosos primarios fueron congelados en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. La mayoría de los procedimientos experimentales se ha informado anteriormente [28]. En breve, las muestras se homogeneizaron en cloroformo /metanol (02:01, v /v), y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 h con 30 s de sonicación cada 30 min. A continuación, se añadió metanol a las muestras, que se centrifugaron a 1800 xg durante 15 min. Los gránulos se homogeneizaron en cloroformo /metanol /agua (1:2:0.8, v /v /v), se incubaron a temperatura ambiente durante 2 h, y después se centrifugó a 1800 xg durante 15 min. Ambos extractos se combinaron y se evaporaron a sequedad en un concentrador de vacío. El residuo se disolvió en cloroformo /metanol /agua (30:60:8) y se fraccionó por cromatografía en columna DEAE-Sephadex A25 para separar los GSL neutros de GSL ácidos.
Análisis de los GSL ácidos
las estructuras de los GSL ácidas se analizaron por liberación enzimática de grupos carbohidrato, etiquetado fluorescente con aminopiridina, y mapeo bidimensional seguido por espectrometría de masas. La mayoría de los procedimientos experimentales se ha informado anteriormente [28]. En resumen, los ácidos GSL fueron extraídos de muestras de tejido de cáncer primario o células cancerosas cultivadas y se digirieron con endoglycoceramidase recombinante II de
Rhodococcus sp
. (Takara Bio Inc., Shiga, Japón). Los oligosacáridos liberados se marcaron con 2-aminopiridina (2-AP) y se separaron en un sistema HPLC Shimadzu LC-20A (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japón) equipado con un detector de fluorescencia Waters 2475. De fase normal HPLC se realizó en una columna de gel TSK Amide-80 (0,2 x 25 cm, Tosoh, Tokyo, Japón). El tamaño molecular de cada -oligosaccharide pyridylaminated (PA) se da en unidades de glucosa (GU) en base a los tiempos de elución de PA-isomaltooligosacáridos. HPLC de fase inversa se realizó en una columna de ODS-80Ts gel TSK (0,2 x 15 cm, Tosoh). El tiempo de retención de cada PA-oligosacárido se da en unidades de glucosa a partir de los tiempos de elución de los PA-isomaltooligosacáridos. Por lo tanto, el comportamiento de un compuesto dado en estas dos columnas proporcionan un conjunto único de Gu (amida) y los valores Gu (SAO), que corresponden a las coordenadas en un mapa 2-D. PA-oligosacáridos se analizaron por LC /ESI MS /MS. PA-oligosacáridos estándar, PA-GM1 y PA-GD1a, se adquirieron de Takara Bio, y PA-LST-a y PA-SPG se aislaron como en nuestro estudio anterior [28].
Los análisis estadísticos
los resultados se presentan como el medio ± error estándar (sE).
t-test fue utilizado
de Student no pareada de dos colas para determinar la significación estadística de las diferencias entre los dos grupos. Los valores de probabilidad de P & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. El análisis estadístico se realizó mediante el programa informático Statview 5.0 (SAS Institute, Cary, NC).
Resultados
Los análisis de los gangliósidos en muestras de tejidos cancerosos de pacientes con cáncer de próstata
Hemos demostrado anteriormente que GD1a era abundante en líneas celulares de cáncer de próstata resistentes a la castración (incluyendo PC3 y DU145), mientras que fue apenas detectable en una línea celular de cáncer de próstata hormono-sensible (LNCap) y una línea de células epiteliales normales de la próstata (PNT2) [17]. Se examinaron los niveles de gangliósidos en muestras de tejido canceroso de ocho pacientes con cáncer de próstata, incluyendo seis pacientes con cáncer de próstata avanzado sensible a hormonas y dos pacientes con cáncer de próstata resistente a la castración (Tabla 1). Los GSL ácidos extraídos de muestras de tejidos cancerosos de estos pacientes se examinaron usando HPLC (Fig. 1). Tanto GM3 y GD3 son gangliósidos comunes expresados en las células cancerosas de la próstata y las células epiteliales de la próstata normales [18], [19]. GD1a se produjo en las muestras de tejido canceroso de tanto los pacientes con cánceres de próstata sensibles a las hormonas y los que tienen cáncer de próstata resistentes a la castración (Fig. 1A, 1B). En todas las muestras de los pacientes '(hormona-sensibles y resistentes a la castración), el porcentaje medio de los GSL ácidos totales con GD1a fue del 8,1%, y no hubo diferencia estadísticamente significativa se observó en comparación con el valor de las líneas celulares de cáncer de próstata resistentes a la castración ( PC3 y DU145) (Fig. 1C).
(A) los GSL ácidas de las muestras de tejido canceroso de ocho pacientes con cáncer de próstata, incluyendo seis pacientes con cáncer de próstata avanzado sensible a hormonas y dos pacientes con castration- cáncer de próstata resistente se separaron por el tamaño molecular de los oligosacáridos utilizando HPLC en fase normal. Las muestras de un paciente (Caso 1 designado) se tomaron de ambas las metástasis óseas de próstata y para la evaluación. (B) Los GSL ácidos en las muestras de tejido cancerosos primarios fueron separados por el tamaño molecular de los oligosacáridos utilizando HPLC. La cantidad de GD1a se presenta como un porcentaje del total de los GSL ácidos con GD1a. (C) Los GSL ácidos en las células de cáncer de próstata en cultivo se separaron por el tamaño molecular de los oligosacáridos utilizando HPLC. El ensayo se realizó por triplicado, y los medios ± S. E. niveles GD1a se muestran como la proporción de los GSL ácidos totales en las líneas celulares. La media ± S. E. GD1a nivel también se presentó como la relación de los GSL total de ácidos en las muestras de los pacientes (SA + CR) indicadas en la figura 1B. (SA, sensible a las hormonas; CR, resistente a la castración; F, libre de glicano)
Regulación de andrógeno-dependientes de ST3Gal II en las células LNCaP
La síntesis de. GD1a se rige principalmente por ST3Gal II, y la expresión de ST3Gal II está regulada por NF-kB, principalmente por RelB, en líneas celulares de cáncer de próstata resistentes a la castración [20]. Las cantidades de RelB nuclear fueron similares en las células LNCaP sensibles a las hormonas y PC3 y DU145 células resistentes a la castración [20], pero la expresión de ST3Gal II fue menor en las células LNCaP que en las células PC3 y DU145 [20].
El medio de cultivo celular LNCaP se complementa de forma rutinaria con 10% de suero bovino fetal (FBS). Un informe reciente mostró que los medios suplementado con 10% FBS contiene sólo niveles de castración de testosterona [29]; por el contrario, sensibles a las hormonas cánceres de próstata de pacientes no tratados suelen crecer en un entorno que contiene testosterona
in vivo
. Para analizar el control transcripcional de ST3Gal II en cánceres de próstata sensibles a las hormonas, se examinó si la expresión de ST3Gal II fue controlada por la testosterona en las células LNCaP. células LNCaP fueron tratados con testosterona (0-1000 nM), y se incubaron durante 120 h. La cuantitativa en tiempo real PCR análisis mostró que la expresión de ST3Gal II fue mayor en las células LNCaP tratadas con testosterona que en las células LNCaP que no eran (Fig. 2A). Además, la inducción de la ST3Gal II después de tratamiento con testosterona fue suprimida por un bicalutamida antiandrógeno,, en las células LNCaP (Fig. 2B). Para asegurarse de que no había andrógenos presentes en los medios, las células LNCaP se incubaron en suero tratado con carbón vegetal durante 48 h. El nivel basal de ST3Gal II no fue significativamente diferente entre la FBS- 10% y las células tratado con carbón vegetal suplementado con suero LNCap (Fig. 2C). Las células LNCaP se trataron posteriormente con 100 nM de testosterona, y se evaluó el curso temporal de la expresión que sigue el tratamiento con testosterona. La expresión de ST3Gal II se incrementó 48 h después del tratamiento de testosterona, y permaneció elevada durante más de 120 h en las células LNCaP (Fig. 2C). Para evaluar la actividad de NF-kappa B después de tratamiento con testosterona, células LNCaP fueron transfectadas con un constructo indicador de luciferasa de NF-KB y se incubaron durante 120 h con o sin testosterona. La actividad de NF-kappa B no fue significativamente diferente en las células LNCaP tratadas con testosterona en comparación con las células cultivadas sin testosterona (Figura S1). En PC3 y las células PNT2, no se detectó ningún aumento significativo en la expresión de ST3Gal II independientemente de si las células cultivadas con o sin la testosterona (Fig. 2A). La expresión de ST3Gal II no aumentó después del tratamiento de testosterona en las células PC3 en cualquier punto de tiempo de hasta 120 h (Figura S2). Basándose en estos resultados, la hipótesis de que los medios de comunicación con los niveles de castración de testosterona llevó a la silenciamiento epigenético de ST3Gal, un gen necesario para la síntesis de GD1a, en las células LNCaP.
(A) LNCap, PC3, y células PNT2 se trataron con o sin testosterona (0-1000 nM) durante 120 h, por realimentación con medio fresco con o sin testosterona en 72 h. Se realizaron los cuantitativa en tiempo real los análisis por PCR de mRNA II ST3Gal, y los niveles de expresión se informan como la media ± S.E. (N = 3) de la diferencia veces en mRNA después de la normalización de los valores al nivel de expresión de las células no tratadas. ** P & lt; 0,001. (B) las células LNCaP se trataron con o sin testosterona (0-100 nM) y, simultáneamente, con o sin 10 bicalutamida mu M durante 120 h, por realimentación con medio fresco con o sin la testosterona y /o bicalutamida en 72 h. Se realizaron los cuantitativa en tiempo real PCR análisis para ST3Gal II, y los niveles de expresión se informan como la media ± S.E. (N = 3) de la diferencia veces en mRNA después de la normalización de los valores al nivel de expresión de las células no tratadas. ** P & lt; 0,001. las células LNCaP (C) se incubaron en suero tratado con carbón vegetal (CSS) durante 48 h y luego tratados con 100 nM de testosterona durante los tiempos indicados. Se realizaron los cuantitativa en tiempo real PCR análisis para ST3Gal II, y los niveles de expresión se informan como la media ± S.E. (N = 3) de la diferencia veces en mRNA después de la normalización de los valores al nivel de expresión de las células no tratadas. * P & lt; 0,05, ** P & lt;. 0.001
La regulación epigenética de ST3Gal II en las células LNCaP
A continuación, se examinó si ST3Gal II se regula epigenetically en las células LNCaP. Las células LNCaP se trataron con un inhibidor de la ADN metiltransferasa, 5-azadC, y se incubaron durante 120 h (Fig. 3A). La cuantitativa en tiempo real PCR análisis mostró que la expresión de ST3Gal II fue regulada hasta después de tratamiento con 5-azadC. Después de este experimento, las células LNCaP se trataron con un inhibidor de la histona desacetilasa, TSA, y se incubaron durante 48 h (Fig. 3B). La cuantitativa en tiempo real PCR análisis mostró que la expresión de ST3Gal II fue regulado hasta después del tratamiento TSA. Estos resultados sugieren que la regulación epigenética, incluyendo la metilación del ADN y las histonas modificaciones, puede estar implicado en la represión del gen ST3Gal II en células LNCaP. En otros experimentos, nos centramos en la metilación del ADN en la isla CpG en el promotor ST3Gal II.
(A) células LNCaP fueron tratados con 5-aza-2'- desoxicitidina (5-azadC) (0-50 M) durante 120 h, por realimentación con medio fresco con o sin 5-azadC a 72 h. Se realizaron los cuantitativa en tiempo real PCR análisis para ST3Gal II, y los niveles de expresión se informan como la media ± S.E. (N = 3) de la diferencia veces en mRNA después de la normalización de los valores al nivel de expresión de las células no tratadas. * P & lt; 0,05. (B) las células LNCaP se trataron con 5 mM tricostatina A (TSA) para 48 h. Se realizaron los cuantitativa en tiempo real PCR análisis para ST3Gal II, y los niveles de expresión se informan como la media ± S.E. (N = 3) de la diferencia veces en mRNA después de la normalización de los valores al nivel de expresión de las células no tratadas. * P & lt;. 0.05
Control de metilación del ADN en la isla CpG en el promotor del gen ST3Gal II en células de cáncer de próstata
El gen de la humana ST3Gal II ha sido clonado, y el promotor p1 se informa, necesario para la transcripción activa de este gen en las células del cáncer de próstata [30]. Las secuencias promotoras ST3Gal II están disponibles para el público, y hemos identificado una isla CpG en el promotor P1 ST3Gal II utilizando el programa de software de metilo Primer Express, versión 1.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA) (Fig. 4A). Examinamos la metilación en CpG en el promotor ST3Gal II utilizando el análisis de MSP. ADN genómico se aisló de las células LNCaP tratadas con o sin 5-azadC durante 120 h, que se trataron a continuación con bisulfito de sodio, y el ADN se amplificó con cebadores específicos para el no metilado o el promotor metilado ST3Gal II (Fig. 4B). En las células LNCaP, la isla CpG en el promotor ST3Gal II, que fue originalmente hypermethylated, se desmetiló por tratamiento con 5-azadC. A continuación, se examinó el efecto de la testosterona en la metilación en el CpG en el promotor ST3Gal II en las células LNCaP utilizando un análisis de MSP (Fig. 4C). En las células PC3 y DU145, la isla CpG del promotor ST3Gal II era constitutivamente hypomethylated. En las células LNCaP, la isla CpG del promotor ST3Gal II se hypermethylated en ausencia de testosterona y desmetilado en presencia de testosterona. Además, la desmetilación en la isla CpG en el promotor ST3Gal II después de tratamiento con testosterona fue suprimida por un anti-andrógeno, bicalutamida, en las células LNCaP (Fig. 4D)
.
(A) La isla CpG en la ST3Gal promotor p1 II y la ubicación de los cebadores MSP. Las barras verticales representan los sitios CpG y TSS representa el sitio de inicio de la transcripción. (B-D) El MSP analiza de la isla CpG de ST3Gal II. ADN fue aislado de las células LNCaP tratadas con 5-azadC (0-50 mM) durante 120 h (B), las líneas resistentes a la castración celulares de cáncer de próstata (PC3 y DU145) o células LNCaP tratadas con o sin 100 nM de testosterona durante 120 h ( células C) o LNCap tratadas con o sin 100 nM de testosterona de forma simultánea con o sin 10 bicalutamida mu M durante 120 h (D). Entonces, el ADN se trató con bisulfito de sodio, y finalmente amplificó con cebadores específicos para el no metilado (USP) o la forma metilada (MSP) de la isla CpG en el promotor ST3Gal II (M, control metilado; UA, control no metilado A; UB, el control no metilado B). Los análisis de MSP se repitieron 3 veces con los mismos resultados, y una imagen representativa se muestra en las figuras.
También examinamos si la desmetilación del ADN mundial está bajo control dependiente de andrógenos en las células LNCaP. Se examinaron los patrones de restricción general de
Msp I o
ADN genómico
Hpa II
digerido. Estas enzimas son isoschizomers que reconocen la secuencia diana 5 'CCGG-3', pero la actividad de
Hpa
II es inhibida por la metilación de la citosina interior de esta secuencia. Las células LNCaP forma aislada de ADN genómico tratados con o sin testosterona se digirió utilizando
Msp
o
Hpa
II (Figura S3 A). El tratamiento con testosterona no afectó en gran medida el patrón de digestión de ADN genómico tratado-II
Hpa En venta células LNCaP, lo que indica que la desmetilación del ADN en las células LNCaP mundial no estaba bajo el control dependiente de andrógenos. A continuación, examinó la isla CpG de GSTP1, que se dice estar hypermethylated durante la carcinogénesis de próstata y también en células LNCaP [27]. Basándose en el análisis de MSP, el tratamiento con testosterona no afectó a la metilación de GSTP1 en las células LNCaP (Figura S3B). Por lo tanto, el control dependiente de andrógenos de la desmetilación de ADN puede ser inducida preferentemente a la isla CpG en el promotor del gen ST3Gal II en las células LNCaP.
dependientes de andrógenos y la regulación epigenética de la ST3Gal I en las células LNCaP
Aunque GD1a se sintetiza a partir GM1 principalmente por ST3Gal II, ST3Gal I también pueden contribuir a la síntesis de GD1a [6], [21] - [24]. Hemos informado anteriormente de que ST3Gal que se expresa en las células LNCaP, mientras que la expresión de ST3Gal II fue silenciado [20]. Por lo tanto, la regulación de la transcripción ST3Gal I puede ser diferente de la de ST3Gal II. Nos posteriormente examinamos si la expresión de ST3Gal I, como ST3Gal II, fue controlada por la testosterona en las células LNCaP. En este experimento, las células LNCaP se trataron con testosterona y se incubaron durante 120 h. La cuantitativa en tiempo real PCR análisis mostró que el tratamiento con testosterona resultó en el aumento de expresión de ST3Gal I en células LNCaP (Fig. 5A), aunque la expresión de ST3Gal VI, la sialiltransferasa se requiere para la síntesis de paragloboside sialil, no fue inducida por el tratamiento con testosterona (Figura S4). Además, la inducción de testosterona mediada por ST3Gal I en las células LNCaP fue suprimida por la bicalutamida (Fig. 5B). Para asegurarse de que no había andrógenos presentes en el medio de cultivo celular, células LNCaP fueron incubadas en suero tratado con carbón vegetal durante 48 h. El nivel basal de ST3Gal I no fue significativamente diferente entre las células LNCaP cultivadas con 10% de FBS y suero tratado con carbón vegetal (Fig. 5C). A continuación, las células LNCaP se trataron con 100 nM de testosterona, y se evaluó el curso del tiempo de los cambios siguientes tratamiento con testosterona. La expresión de ST3Gal I aumentó 72 h después de tratamiento con testosterona y permaneció elevada durante más de 120 h en las células LNCaP (Fig. 5C). En PC3 y las células PNT2, ningún aumento significativo en la expresión de ST3Gal I se detectó después de tratamiento con testosterona (Figura S5).
células LNCaP (A) se trataron con o sin testosterona (0-1000 nM) durante 120 h, por realimentación con medio fresco con o sin testosterona a las 72 h. * P & lt; 0,05.