Extracto
Antecedentes
antígeno específico de próstata (PSA) se utiliza tradicionalmente como un indicador de la presencia de cáncer de próstata (CaP) y la radioterapia se usa generalmente para tratar inoperable y CaP localmente avanzado . Sin embargo, cómo el nivel de PSA celular se asocia con la sensibilidad del CP a la radioterapia es desconocido. La anterior conclusión de que la vía alternativa NF-KB basada en RelB regula diferencialmente PSA y la interleucina-8 (IL-8) en CaP agresivo ha dirigido nuestra atención hacia el papel de RelB en la respuesta del CP a la radioterapia.
Metodología /Principales conclusiones
RelB y sus metas de PSA e IL-8 en células de CaP fueron manipulados por la expresión ectópica en células de CaP con un bajo nivel endógeno de RelB (LNCaP) y por knock-down basado en RNAi en células de CaP con un alto nivel constitutivo de RelB (PC3). Los efectos de RelB, PSA y IL-8 en la respuesta de PCa a tratamiento de radiación se examinaron
in vitro
y en los tumores de xenoinjertos. RelB regula PSA y IL-8 de una manera inversa. Cuando los niveles celulares de PSA y la IL-8 se modulan directamente por manipulaciones genéticas o por la adición de proteínas recombinantes, los resultados demuestran que la regulación de IL-8 radioresistance mejorada de células de CaP y PSA simultáneamente regulada hacia abajo. En contraste, la sobre regulación de PSA como resultado radioresistance reducida concurrente con la baja regulación de IL-8.
Conclusión /Importancia
RelB juega un papel fundamental en la respuesta del CP a la radioterapia y la expresión inversa de IL-8 y PSA. Los resultados identifican una relación no reconocida previamente entre IL-8 y PSA en la respuesta de las células de CaP a la radioterapia
Visto:. Xu Y, Fang M, St. Clair DK, St. Clair WH (2012) Relación inversa entre PSA y la IL-8 en el cáncer de próstata: una penetración en un mecanismo mediado por NF-kB. PLoS ONE 7 (3): e32905. doi: 10.1371 /journal.pone.0032905
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Junio, 2011; Aceptó 7 de febrero de 2012; Publicado: 5 Marzo 2012
Derechos de Autor © 2012 Xu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud subvenciones CA 49797 a 11580 DKS y CA de WHS. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es la segunda neoplasia maligna más común en América del Norte y la segunda causa principal de muerte por cáncer en los hombres estadounidenses [1]. La concentración sérica de PSA en los hombres se utiliza como un indicador de la enfermedad de la próstata y el aumento de nivel de PSA se utiliza ampliamente como un biomarcador de la PCa. La radioterapia se utiliza generalmente para tratar las primeras etapas, inoperable y CaP localmente avanzado. Sin embargo, si PSA celular podría utilizarse como indicadores de la capacidad de respuesta del tumor a la radioterapia es desconocido.
NF-kappa B, un factor de transcripción sensible inflamatoria, juega un papel importante en la tumorigénesis y la resistencia a la citotoxicidad inducida por el tratamiento [2] . El alto nivel constitutivo de NF-kappa B en los cánceres se ha implicado como un mecanismo protector importante contra el tratamiento del cáncer [3]. Por lo tanto, la inhibición de NF-kappa B está siendo considerada como un objetivo para la mejora de la eficacia de la quimioterapia y la radioterapia convencional [4]. Hemos demostrado anteriormente que la sobreexpresión de RelB, un miembro de NF-kB, suprimida la expresión de PSA en células LNCaP CaP sensibles a andrógenos, lo que sugiere un efecto negativo de NF-kB en la expresión de PSA [5]. Casualmente, también hemos encontrado que en los animales portadores de tumores LNCaP sobreexpresados-RelB, los niveles circulantes de IL-8 se incrementó.
IL-8, una citoquina activado por NF-kappa B, se cree que es un importante factor en la metástasis tumoral y la resistencia al tratamiento [6] - [9]. El nivel circulante de IL-8 se incrementa en el CaP avanzado en la etapa cuando el tumor ya no responde a las terapias anti-andrógenos [10]. Además, la expresión de IL-8 aumenta la CaP independiente de andrógenos metástasis [11], [12]. Por lo tanto, la expresión de IL-8 puede tener valor pronóstico importante para el crecimiento y la respuesta al tratamiento CaP. El presente estudio investigó el papel de los PSA e IL-8 en el radioresistance de células de CaP usando
in vitro
y
in vivo
enfoques. Los resultados ponen de manifiesto el papel previamente no reconocido de la IL-8 y PSA como determinantes de la sensibilidad del CP a la radioterapia.
Resultados
NF-kB regula por IL-8, pero regula a la baja de PSA en el CaP células
la activación de la ruta de NF-kB se piensa que es un factor importante que contribuye al desarrollo de la radioresistance de las células cancerosas. Porque de RelA y RelB son los dos miembros principales de la familia NF-kappa B que se encuentra en células de CaP [13], se determinó el efecto de de RelA y RelB de IL-8 y la expresión de PSA y radiosensibilidad utilizando múltiples enfoques para la activación e inactivación de la NF -κB vía. En primer lugar, de RelA o RelB se sobreexpresa en las células LNCaP por transfección con sus respectivas construcciones de ADNc. Como se muestra en la Fig. 1A, los niveles de PSA se redujeron por tanto de RelA y RelB cuando se sobreexpresa en las células LNCaP. En contraste, los niveles de IL-8 se incrementaron en ambos de RelA y RelB. El efecto correspondiente de RelB de RelA y en radioresistance de las células LNCaP fue mayor con la sobreexpresión de RelB.
Para manipular la función de NF-kB, de RelA y RelB construcciones de ADNc (A), y de RelA RelB siRNAs (B) y inhibidores de RelA y RelB de translocación nuclear (IκBαM y P100M) (C) se transfectaron en células LNCaP anteriores al tratamiento IR. Los niveles de proteínas transfectadas y el PSA objetivo vinculados se cuantificaron por transferencias de Western (panel superior). Las imágenes occidentales se normalizaron por β-actina y luego normalizaron por un control del vehículo. Plegables cambios se indican. IL-8 concentraciones en los medios de comunicación se cuantificaron mediante un kit de ELISA (panel central). supervivencias celulares se cuantificaron utilizando el ensayo de exclusión con azul de tripano (panel inferior). * (P & lt; 0,05) y ** (p & lt; 0,01) indican significación estadística en comparación con el control del vehículo
En segundo lugar, la de RelA endógeno y RelB en las células LNCaP fueron derribado utilizando el ARN. interferencia enfoque (RNAi). De RelA siRNA o RelB siRNA se transfectaron en células LNCaP de silenciar su expresión. Como se muestra en la Fig. 1B, los niveles de PSA se correlacionan inversamente a los niveles reducidos de ambos de RelA y RelB, con un mayor efecto observado para RelB. Los niveles de IL-8 se redujeron de manera similar en de RelA y RelB derribado en las células, con un efecto mayor para de RelA siRNA. Radiosensibilidad de las células LNCaP se ha mejorado mediante la reducción, ya sea de RelA o RelB (Fig. 1B). La supervivencia celular en siRNA de control se redujo a 46,3% en el tratamiento de radiación, mientras que la supervivencia de las células se redujo adicionalmente a 30,1% o 23,4% cuando de RelA o RelB fue derribado. El análisis estadístico mostró diferencias significativas de los siRNA y de RelA RelB siRNA en comparación con el control de siRNA. Por lo tanto, knock-down de RelB casi se duplicó la célula efecto de la radiación matar. Sin embargo, el asesinato de RelB siRNA más radiación fue ligeramente menor que los efectos combinados de siRNA solo y la radiación sola. Por lo tanto, es posible que el segundo golpe a las células que ya estaban muertos puede dar cuenta de esta observación. En tercer lugar, y de RelA RelB se inhibieron mediante el bloqueo de su translocación nuclear para confirmar aún más su papel en la regulación de PSA y la IL-8 expresiones. construcción de mutantes de I? B? (IκBαM) [14] o p100 (P100M) [15] se transfectó en células LNCaP para bloquear de RelA: dímero p50 o RelB: p52 dímero translocación nuclear, respectivamente. Como se muestra en la Fig. 1C, las respuestas de PSA y IL-8 expresiones fueron similares a los resultados obtenidos a partir del método de RNAi (Fig. 1B). Por lo tanto, el bloqueo de cualquiera de RelA o RelB translocación nuclear mejorada de manera eficiente la radiosensibilidad de las células LNCaP.
PSA se correlaciona inversamente con IL-8 en células de CaP
PSA y IL-8 han demostrado ser biomarcadores importantes en múltiples etapas de la progresión de PCA. Hemos demostrado que la regulación de la IL-8, pero la baja regulación de PSA se asocia con el aumento de la tumorigenicidad de células de CaP [5]. Dos líneas de células de CaP se utilizaron para validar la correlación de PSA a IL-8: LNCaP, una línea celular de CaP sensibles a los andrógenos, expresa PSA y un bajo nivel de IL-8; PC3, una línea celular de CaP independiente de los andrógenos, expresa un alto nivel de IL-8, pero PSA es indetectable. Después de la transfección de una expresión de ADNc de IL-8 constructo en las células LNCaP, se cuantificaron los niveles relativos de PSA. A medida que aumentaba la expresión de IL-8, disminuyeron los niveles de PSA celular dependiente de la dosis. Además, knocking- abajo PSA por PSA siRNA dado lugar a aumentos dependientes de la dosis en los celulares de IL-8 niveles (Fig. 2A). Además, expresando PSA en células PC3 condujo a la reducción en la producción de IL-8. Sin embargo, no hubo expresión de PSA en células PC3 incluso cuando IL-8 se knocked- por siRNA (Fig. 2B). Se ha demostrado que la activación de NF-kappa B puede mediar la vía prosupervivencia de IL-8: CXCR2 señalización [16]. Para probar si NF-kappa B puede ser un mediador para la relación inversa observada entre IL-8 y PSA, un constructo reportero NF-kappa B-luciferasa fue co-transfectaron en células LNCaP con la construcción de expresión de PSA o PSA siRNA. Como se muestra en la Fig. 2C, la sobreexpresión de PSA suprimida pero la deficiencia de PSA mejoradas de NF-kB mediada activación transcripcional.
Para manipular PSA e IL-8 en células de CaP, las células LNCaP fueron transfectadas con una construcción de ADNc de IL-8 y una PSA siRNA (A); células PC3 se transfectaron con cDNA PSA construir y IL-8 siRNA (B). Para probar si PSA influye en la activación transcripcional NF-kB, un constructo reportero NF-kappa B-luciferasa se co-transfectadas con un constructo de expresión de PSA o PSA siRNA y una expresión de β-gal construir en células LNCaP. Las respuestas de luciferasa se normalizaron con las actividades de β-gal (C). Los niveles de PSA y la IL-8 se cuantificaron mediante transferencias Western con la normalización como se describe en la Figura 1.
PSA e IL-8, desempeñan funciones opuestas en la radiosensibilidad de células de CaP
Siendo NF -κB productos de los genes regulados, PSA e IL-8 pueden desempeñar un papel importante en las respuestas de CaP a la radioterapia. Por lo tanto, hemos manipulado los niveles de PSA y la IL-8 para determinar directamente sus papeles en la radiosensibilidad de células de CaP. El aumento de IL-8 en células LNCaP por cualquiera de tratamiento de las células con la proteína IL-8 (Fig. 3A, panel superior) o de forma estable la transfección de IL-8 de ADNc en las células (Fig. 3A, bajo panel) resultó en una disminución de los niveles de PSA y la sensibilidad a la radiación. Además, basado en lentiviral shRNA estable knock-down de PSA en células LNCaP dio como resultado el aumento de IL-8 niveles y la reducción de la radiosensibilidad de las células (Fig. 3B). A fin de verificar los papeles de PSA e IL-8 en la radiosensibilidad de las células de CaP, PSA y la IL-8 en células PC3 se modula mediante transfección de ADNc de PSA y la IL-8 siRNA, respectivamente. expresión de PSA lentivirus de base y knock-down de la IL-8 en células PC3 dirigidos a altos niveles de PSA, la reducción de los niveles de IL-8 y el aumento de la radiosensibilidad de las células PC3 (Fig. 3C). En conjunto, estos resultados indican la relación inversa entre la IL-8 y PSA en células de CaP y sugieren que el PSA y la IL-8 tienen efectos opuestos sobre la radiosensibilidad de células de CaP.
Para determinar el papel de los PSA e IL 8 en la radiosensibilidad de las células de CaP, las células LNCaP se trataron con proteína de IL-8 o establemente transfectadas con IL-8 cDNA (a) y de forma estable transducido con PSA shRNA lentivirus (B); células PC3 se transducido de manera estable con ADNc de PSA y IL-8 shRNA lentivirus (C). Los niveles de PSA se cuantificaron por transferencias de Western y los niveles de IL-8 se cuantificaron por cualquiera de transferencias de Western o un kit de Elisa. La supervivencia celular se cuantificó por Trypan ensayos de exclusión con azul. Las transferencias Western se normalizaron con los controles y análisis de la fracción de supervivencia celular como se describe en la Figura 1.
Sobre regulación de RelB reduce la radiosensibilidad de los tumores LNCaP
in vivo
los datos anteriores obtenidos
in vitro implican
RelB y objetivos, IL-8 y PSA, como teniendo un papel importante en la radiosensibilidad de CaP. Para verificar el papel de RelB en la radiosensibilidad de PCa y la relación inversa entre las expresiones PSA IL-8 y
in vivo
, se generó un establo RelB que expresan clon LNCaP (Fig. 4A) y se inyectaron subcutáneamente en el flancos de ratones machos desnudos; el crecimiento del tumor se controló durante 50 días, midiendo el tamaño del tumor. cambio en la tasa de crecimiento del tumor se cuantifica por el tiempo (días) necesarios para el tamaño del tumor para llegar a un volumen de 500 mm
3. Higo. 4B muestra que el tiempo promedio para el grupo de control para llegar a 500 mm
3 fue de 54 ± 6,7 días. aumento de la tasa de crecimiento del tumor en el clon expresado-RelB tomó 43 ± 5,6 días para llegar a 500 mm
3. Los animales con un tamaño medio de los tumores de 500 mm
3 fueron distribuidos aleatoriamente en dos grupos para 1) el tratamiento con radiación fraccionada (3 Gy de radiación por día durante 5 días) y 2) controles simulados. Los ratones fueron sacrificados humanitariamente cuando los tumores alcanzaron el tamaño máximo de 2000 mm
3. Como se muestra en la Fig. 4C, en los ratones unradiated, los tumores de control de vectores creció de 500 mm
3-2000 mm
3 en 25 ± 3,7 días, mientras que el tumor que expresa RelB alcanzó el mismo tamaño en 14 ± 2,3 días. La radiación ionizante (IR) previene eficazmente el crecimiento de los tumores de control en el plazo de 50 días del experimento. Sin embargo, IR sólo se detuvo el crecimiento de tumores que expresan RelB durante 20 días después de la radiación, después de lo cual se observó nuevo crecimiento del tumor. El experimento se terminó debido a que algunos ratones en los grupos irradiados desarrollaron malas condiciones de salud implicados por los signos clínicos de enfermedad sistémica como la deshidratación, respiración dificultosa o superficial, y la pérdida de 20% de su peso máximo. Después se eliminaron los tumores, la expresión de RelB y los niveles de PSA y la IL-8 en los tejidos tumorales se cuantificaron utilizando un anticuerpo apropiado para cada proteína. En consonancia con los altos niveles de RelB identificados en los tumores expresados-RelB, IL-8 se incrementó pero PSA se redujo en los mismos tejidos tumorales (Fig. 4D).
A RelB estable expresó clon LNCaP se caracterizó por transferencias de Western (A). Las células fueron inyectadas /LNCaP RelB en ratones macho para la formación de tumores y el crecimiento de llegar a 500 mm
3 (B). Los tumores se trataron IR (5 × 3 Gy) y los volúmenes tumorales se midieron hasta que alcanzaron 2.000 mm
3 (C). RelB, PSA e IL-8 niveles se cuantificaron en los lisados tumorales y se analizaron estadísticamente (D). significancias estadísticas de los volúmenes tumorales (C) y los niveles de las proteínas diana (D) entre RelB expresan y control del vehículo en ambos grupos nociones IR e IR tratados se indican.
El descenso de regulación de RelB aumenta la radiosensibilidad de los tumores PC3
a fin de validar el papel protector de RelB contra la radiación, un RelB siRNA PC3 clon basados en lentivirus fue seleccionado (Fig. 5A) y se inyecta en los costados de ratones desnudos masculinos. En el grupo de control de siRNA, el tiempo promedio para que un tumor alcanzó 500 mm
3 fue de 11 ± 2,1 días, mientras que el tiempo promedio en el grupo de knock-down RelB extendió a 26 ± 5,1 días (Fig. 5B). Los tumores fueron tratados con IR a 3 x 5 Gy después de tumor alcanzó un tamaño medio de 500 mm
3. En los ratones de control unradiated, el tamaño del tumor en el grupo de control de siRNA creció rápidamente a partir de 500 mm
3 a 2.000 mm
3 dentro de 15 ± 3.1 días. En comparación con el grupo control de siRNA, el crecimiento del tumor en el grupo de knock-down RelB fue significativamente más lenta que en el grupo de control siRNA. IR inhibe el crecimiento del tumor de control con la tendencia a nuevo crecimiento después de 20 días después de la IR. Curiosamente, IR no sólo controla el nuevo crecimiento del tumor, sino que también reduce el tamaño del tumor en el grupo de RelB siRNA (Fig. 5C). Las diferencias observadas
in vivo
no son simples reflejos de las diferencias de crecimiento
in vitro
porque no hay una disminución significativa en el crecimiento celular cuando RelB fue derribado de forma estable en células PC-3. Por lo tanto, el efecto de radiosensibilización por knock-down de RelB es debido a la inhibición de la activación de NF-kappa B inducible por radiación. Los efectos de siRNA mediada por knock-down de RelB fueron confirmados por análisis de Western blot de RelB e IL-8 en los tejidos tumorales (Fig. 5D). Estos resultados apoyan el papel de RelB en la respuesta del CP a la radioterapia.
Un clon RelB siRNA PC3 knock-down basados en lentivirus se caracterizó por transferencias de Western (A). Las células fueron inyectadas /PC3 RelB shRNA en ratones machos para la formación de tumores (B). Los tumores fueron tratados con IR (3 × 5 Gy) cuando el volumen de tumor alcanzó 500 mm
3 y se dejó que los tumores para crecer a 2.000 mm
3 (C). RelB niveles de IL-8 y se cuantificaron en los lisados tumorales y se analizaron estadísticamente (D). El análisis estadístico de los volúmenes tumorales y los niveles de proteínas diana como se describe en la Figura 4.
Discusión
PSA es un receptor de andrógenos (AR) de la proteasa serina -regulated producida por las células epiteliales de la próstata [17]. Aunque un nivel de PSA en suero elevada se correlaciona con la presencia de PCa, muchos factores, tales como la inflamación, la infección, la hiperplasia prostática, así como los procesos de tejido, conducen a cierta pérdida de la integridad de la glándula prostática y las fugas de PSA desde el lumen a la intersticial líquido y en la circulación general. [18], [19]. Además, CaP puede estar presente en la ausencia de niveles de PSA en suero elevados de [20]. De hecho, no hay niveles detectables de PSA en las líneas celulares de CaP andrógeno-independientes, tales como PC3 y DU-145. Aunque PSA se utiliza como un biomarcador para el diagnóstico de CaP, su función biológica no ha sido totalmente dilucidado. Los resultados del presente estudio demuestran que el nivel de PSA celular puede ser un indicador importante de la respuesta celular a CaP IR. Down-regulación de PSA en células LNCaP sensibles a los andrógenos conduce a radiosensibilidad reducida y la expresión de PSA en independientes de andrógenos en las células PC3 resultados radiosensibilidad mejorada, lo que sugiere que PSA juega un papel importante en la respuesta de células de CaP a la radioterapia.
IL-8, una citoquina pro-inflamatoria, expresa únicamente en células de CaP independientes de andrógenos, pero no en células de CaP sensibles a andrógenos [8], [21]. Elevados de IL-8 niveles en CaP avanzado se han considerado como un factor importante que contribuye a la proliferación de células de cáncer y la supervivencia después de los tratamientos [6], [12]. El presente estudio revela una relación interesante entre PSA y la IL-8 en la respuesta de las células de CaP a la radioterapia. La relación inversa entre el PSA y la IL-8 expresiones confunde a la conclusión de que los cambios observados en la radiosensibilidad de CaP dependen de la concentración de PSA; Alternativamente, el efecto observado de PSA puede ser mediada, en parte, por un cambio en el nivel de IL-8. Los datos presentados en este informe demuestran directamente el papel de la IL-8 en la radiosensibilidad de células de CaP. En conjunto, estos resultados ponen de manifiesto la intrincada relación entre la IL-8 y PSA, que contribuyen a la respuesta de las células de CaP a la radioterapia.
NF-B es constitutivamente activo en muchos tipos de cáncer, y funciona en la sobre regulación de genes antiapoptóticos y oncogénicos [10], [22], [23]. Otra importante función biológica de NF-kappa B está relacionado con la coordinación de la respuesta inmune innata y adaptativa que mantienen los sistemas de defensa celular [3]. Por lo tanto, la inhibición de NF-kB se considera un complemento útil a la quimioterapia tradicional o la radioterapia. NF-kappa B consta de cinco proteínas relacionadas con Rel, que contienen el /p50 heterodímero mediada por la vía clásica de RelA y la vía alternativa mediada por heterodímero RelB /p52 [3], [10], [13]. RelB se expresa únicamente en células de CaP avanzada y de la vía alternativa basada en RelB juega un papel importante en la tumorigénesis de CaP [24], [25]. Hemos demostrado anteriormente que la inhibición selectiva de la vía alternativa suprime notablemente la tumorigenicidad de células de CaP [5], [26], [27]. Los resultados del presente estudio demuestran que RelB también puede jugar un papel crítico en la radioresistance de células de CaP, en parte, a través de un efecto inverso en las expresiones de IL-8 y PSA.
actividad de AR es esencial para la iniciación y progresión del CaP. Incluso cuando CaP progresa a las etapas refractarios a las hormonas, la señalización AR sigue siendo a través de una variedad de mecanismos independientes de andrógenos [28]. Por lo tanto, la ablación de la función de AR es la meta de la terapia de primera línea. Aunque estos tratamientos son inicialmente eficaces, surgen los tumores recurrentes con actividad restaurado AR [29] o incluso con otros receptores de unión a ligando [30]. Como un objetivo de AR, la prueba de PSA supervisa la gestión del CaP. Sin embargo, la presencia de AR no es adecuado para predecir la eficacia de la terapia debido a que el nivel de PSA puede ser también regulada por muchos otros factores. Un gran número de estudios han demostrado que tanto la AR y la señalización de NF-kappa B son factores importantes en la progresión del CaP. La restauración de la actividad de AR, en ausencia de andrógenos se considera un mecanismo de PCa a medida que avanza a la etapa refractario a las hormonas [29]. Además, NF-KB mediada por la activación de IL-6-STAT3 se piensa que es otro mecanismo importante para la metástasis del tumor [31]. Sin embargo, la diafonía entre las dos vías de señales es difícil de alcanzar. Los resultados de este estudio demuestran que la sobreexpresión de RelB aumentó el nivel celular de IL-8, pero disminuyó el nivel de PSA, lo que sugiere que los genes diana NF-KB pueden ser diferencialmente regulados por diferentes miembros de la familia NF-kB o que RelB puede servir como co-activador para IL-8 de la transcripción mientras que actúa como un co-regulador negativo para la transcripción PSA. Se ha demostrado que la combinación de RelB y receptor de aril hidrocarburos (AHR) puede activar la transcripción a partir de un elemento RelB /Ahr único que se encuentra aguas arriba del sitio de IL-8-kappa B [32]. También se ha demostrado que NF-kappa B suprime la transcripción de PSA a través de un elemento receptor de andrógenos situado en la región promotora de un gen [33]. Nuestro hallazgo es consistente con la posibilidad de que NF-kappa B no sólo tiene la capacidad de activar su gen diana, sino también para inhibir su gen diana dependiendo de la composición de los factores que afectan la transcripción.
radioterapia causa la detención del crecimiento y la muerte en las células cancerosas, ya sea por ionización directa de ADN o por la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) que pueden dañar el ADN. Se ha demostrado que los agentes genotóxicos, incluyendo IR, inducida por roturas de la doble hebra (DSB) estimular la ruta de NF-kappa B para generar bucles de retroalimentación positiva a través de la producción de citoquinas, que a su vez activa los mecanismos de reparación del ADN [34] - [36]. La ruta de NF-kappa B activados por citoquinas también puede conducir a la inducción de enzimas antioxidantes, que protegen las células de cáncer contra ROS terapéutica de generación. Nuestros estudios previos que demuestran que la inhibición de NF-kB y su objetivo antioxidante, manganeso superóxido dismutasa (MnSOD), aumentan notablemente la radiosensibilidad de las células de cáncer de próstata agresivo [5], [25], son consistentes con la conclusión de este mecanismo más tarde.
El mecanismo por el cual PSA puede modular la respuesta celular a la terapia de radiación sigue siendo desconocido. Es posible que el efecto negativo observado de PSA se debe, en parte, al aumento en el nivel de IL-8 cuando se reduce PSA. De hecho, se observó asociación inversa de PSA y la IL-8 en células de CaP sensibles a andrógenos y independientes de andrógenos, lo que sugiere que el aumento de la relación de IL-8 a PSA contribuye a radioresistance de células de CaP. futuros estudios para determinar cómo el nivel de PSA afecta a la producción de IL-8 sería interesante.
En resumen, el presente estudio se utiliza enfoques experimentales complementarios para demostrar que RelB contribuye a radioresistance de células de CaP e inversamente regula IL expresiones -8 y PSA. La relación inversa entre los niveles de PSA IL-8 y es predictivo de la respuesta de células de CaP a la radiación, lo que sugiere el potencial de mejorar la radioterapia de CaP por modulación directa de IL-8 y /o PSA. Esta es la primera evidencia experimental de implicar el papel de PSA en la radioterapia de células de CaP. Conocimientos obtenidos a partir de este estudio proporcionan una base científica para el uso de la relación /PSA IL-8 como un indicador celular para el tratamiento de células de CaP por la radiación.
Materiales y Métodos
Cultivo celular y el tratamiento
carcinoma de próstata humano LNCaP y PC3 (American Type Culture Collection, ATCC) se cultivaron y se mantuvieron en medio RPMI con suero bovino fetal 10%. Las células fueron tratadas con IR usando una máquina de rayos X 250 kV (Faxitron X-ray Corp.) con pico de energía de 130 kV, 0,05 mm filtro de Al, a una dosis de 0 a 5 Gy. Para examinar el efecto de IL-8 en las respuestas de radiación, las células LNCaP se trataron previamente con IL-8 (BD Biosciences) a concentraciones de 0 a 100 pg /ml para 12 h antes de la exposición a la radiación. Radiosensibilidad de células de CaP se cuantificó utilizando la fracción de supervivencia celular se determina mediante el ensayo de exclusión con azul de tripano, tal como se describe anteriormente [26].
transfección celular
Para expresar Rela RelB, PSA, IL-8, proteínas y P100M IκBαM en células de CaP, se utilizaron las construcciones de expresión que codifican estas proteínas. De RelA (p65) constructo de expresión es un regalo del laboratorio de Nancy Rice (NIH); el ADNc de p65 fueron clonados entre H
ind
III - X
ba
sitios I en PRC-CMV vector; RelB, PSA y IL-8 construcciones de expresión se adquirieron de Abrir Biosystems. Catálogo de RelB No .: MHS1010-7507797; Catálogo de PSA No .: MHS1010-9205472; IL-8 Catálogo No .: MHS1010-58052. El cDNA se clonó entre E
cor
V - N
ot
sitios en pCMV-SPORT6 vector; P100M constructo fue proporcionada por el laboratorio del Dr. Shao-Cong de Sun en la Universidad Estatal de Pensilvania [37]. P100M secuencia se clonó entre H
ind
III - X
ba
sitios I en pCMV4 vector; IκBαM constructo fue proporcionada por el laboratorio del Dr. Veronique Imbert, Celular adherencia, Hospital de Sainte Marguerite, Marsella, Francia. I? B? (S32-36A) secuencia mutante se clonó en E
cor
sitio de V en pcDNA 3.1 vectorial. Todos los vectores contienen un promotor de CMV y se utilizaron sin ninguna condición inducible. Los clones transfectados estables fueron seleccionados por resistencia a neomicina. Para knock-down de RelA endógena, RelB, PSA e IL-8 en células de CaP, se transfectó el siRNA (Santa Cruz Biotech.). shRNA basado en Lentivirus construye (Open Biosystems) se utilizaron para knock-down de forma estable los objetivos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los niveles de proteínas fueron confirmados por Western blots. Un plásmido reportero NF-kappa B-luciferasa que contiene cuatro copias de los elementos de NF-kB vinculados a un promotor SV40 en pGL3 vector (Promega) se construyó anteriormente [25]. El constructo reportero fue co-transfectadas con el vector de expresión de PSA o PSA siRNA (Santa Cruz Biotech.) Y β-galactosidasa (β-gal) construir en células LNCaP para determinar el efecto de PSA en la activación transcripcional NF-kB.
Animales
Cuatro semanas de edad de sexo masculino NCRNU (nu /nu atímicos) los ratones fueron adquiridos de Taconic (Hudson). 1,8 × 10
se inyectaron 6 células de CaP mezcladas con Matrigel (BD Biosciences) en los costados derechos de los ratones. Los volúmenes tumorales se calcularon semanal utilizando una fórmula estándar (A × B
2 × 0,52; A y B representan las longitudes tumor diagonal). Se recogieron los tejidos tumorales, y 100 g tejidos se lisaron para cuantificar los niveles de proteínas utilizando transferencias Western. procedimientos de experimentación con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Kentucky, Protocolo Aprobación Nº 01077M2006.
Western blot.
Para cuantificar los niveles de proteínas, extractos de células y tejidos eran separada por medio de SDS-PAGE, 8% (w /v) en gel de poliacrilamida, y después se transfirió a una membrana de nitrocelulosa y se transfirieron con anticuerpos primarios contra de RelA, RelB, P100, I? B?, PSA, IL-8 y β-actina. Un anti-IgG de ratón-HRP anticuerpo secundario de cabra conjugado se utilizó para detectar de RelA, PSA, IL-8, y β-actina. Otras proteínas se detectaron utilizando un anti-IgG de conejo-HRP anticuerpo secundario conjugado de cabra. Las inmunotransferencias se visualizaron por un mejorado sistema de detección de quimioluminiscencia (ECL, Amersham Pharmacia Biotech.).
IL-8 cuantificación
medios cultivadas se recogieron al final de los procedimientos experimentales. Los niveles de IL-8 secretadas a partir de células cultivadas se cuantificaron utilizando un kit de ELISA de IL-8 (BD Biosciences) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
análisis Datos estadísticos
experimentos independientes múltiples se realizaron para cada conjunto de datos. Imágenes en transferencias de Western se cuantificaron utilizando el software Carestream Molecular Imaging (Carestream Health Inc.). La significación estadística se analizaron mediante ANOVA de una vía y la prueba de comparación múltiple de Tukey, seguido de análisis de datos GraphPad Prism.