Extracto
El cáncer de ovario sigue siendo difícil de tratar debido principalmente a la presentación de la enfermedad en una etapa avanzada. adenovirus condicionalmente replicantes (crads) son prometedores agentes contra el cáncer que matan selectivamente las células tumorales. El presente estudio evaluó la eficacia de una novela VAO (Ad5 /3-CXCR4-TIMP2) que contiene el promotor CXCR4 para la replicación viral selectiva en células de cáncer junto con TIMP2 como un transgén terapéutico, centrándose en las metaloproteasas de la matriz (MMPs) en un modelo ortotópico murino diseminada de cáncer de ovario. Un modelo ortotópico de cáncer de ovario se estableció en ratones desnudos atímicos mediante inyección intraperitoneal de la línea celular de cáncer de ovario humano, SKOV3-Luc, que expresa la luciferasa. Tras la confirmación de difusión peritoneal de las células mediante formación de imágenes no invasiva, los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos de tratamiento: PBS, Ad-ΔE1-TIMP2, Ad5 /3-CXCR4, y Ad5 /3-CXCR4-TIMP2. Todos los ratones fueron imágenes semanal para controlar el crecimiento del tumor y se sacrificaron al llegar a cualquiera de los puntos finales predefinidos, incluyendo una alta carga tumoral y la pérdida de peso significativa, junto con evidencia clínica de dolor y angustia. El análisis de supervivencia se realizó mediante la prueba de log-rank. La mediana de supervivencia para la cohorte de PBS fue de 33 días; para Ad-ΔE1-TIMP2, 39 días; para Ad5 /3-CXCR4, 52,5 días; y para Ad5 /3-CXCR4 TIMP2, 63 días. El VAO armado-TIMP2 retrasó el crecimiento del tumor y aumentó significativamente la supervivencia en comparación con el desarmado VAO. Este efecto terapéutico se confirmó estar mediada a través de la inhibición de MMP9. Los resultados de la
in vivo
estudio apoyan el potencial de traslación de Ad5 /3-CXCR4 TIMP2 para el tratamiento de pacientes humanos con cáncer de ovario avanzado
Visto:. Yang SW, Chanda D, Cody JJ , Rivera AA, Wæhler R, Siegal GP, et al. (2011) de replicación condicional Adenovirus TIMP2 Expresando aumenta la supervivencia en un modelo de ratón de cáncer de ovario diseminado. PLoS ONE 6 (10): e25131. doi: 10.1371 /journal.pone.0025131
Editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 27 de mayo de 2011; Aceptado: August 25, 2011; Publicado: 12 Octubre 2011
Derechos de Autor © 2011 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud subvenciones R01CA108585, T32 CA075930, y la Universidad de Alabama en Birmingham, Departamento de Patología Fondo de Investigación es apreciada. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es la principal causa de muerte por cáncer ginecológico en los EE.UU. [1]. La morbilidad y mortalidad significativa en pacientes con este grupo de tumores se atribuye al hecho de que los pacientes presentan sólo síntomas no específicos en las primeras etapas, lo que impide su diagnóstico [2]. La mayoría de los pacientes son diagnosticados en estadio III o más allá, donde el cáncer se ha diseminado por toda la cavidad peritoneal, lo que conduce a un mal pronóstico. Las terapias actuales tienen limitaciones, ya que la tasa de supervivencia a cinco años se ha mantenido sin cambios en el 50% en las últimas cuatro décadas [3]. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevos y terapias eficazmente específicas para la enfermedad diseminada.
adenovirus de replicación condicional (crads) son una nueva clase prometedora de agentes terapéuticos, ya que estos virus tienen el potencial de forma selectiva y auto-perpetuamente replican y cáncer lyse células para erradicar el tumor entero [4]. Los ensayos clínicos con crads han demostrado hasta el momento la seguridad de los adenovirus oncolíticos. Sin embargo, modesta eficacia terapéutica con crads sugiere se requiere una mayor optimización para la traducción clínica eficaz [5]. Una estrategia de aumentar la eficacia antitumoral utiliza la VAO como una plataforma para la entrega de un transgén terapéutico, además de su potencial oncolítico [6]. A tal efecto, la hipótesis de que la eficacia de un adenovirus de replicación podría ser mejorado para el tratamiento de cáncer de ovario por armar con un gen que actúa sobre el microambiente de acogida, como la interacción entre las células cancerosas y su microambiente se ha conocido para modular la progresión tumoral [7], [8], [9].
las metaloproteinasas de matriz (MMPs) son una familia diversa de las proteasas capaces de degradar varios componentes de la matriz extracelular (ECM) [10]. Son uno de los objetivos ideales para la terapia del cáncer de ovario, como su desregulación se ha demostrado que contribuyen a la promoción del crecimiento tumoral, la angiogénesis, la invasión y la metástasis [11]. En particular, la MMP-2 y MMP-9 son upregulated consistente en cáncer de ovario y están asociados con un mal pronóstico [12], [13]. regulador importante de MMPs son sus inhibidores endógenos, el inhibidor tisular de las metaloproteinasas (TIMP), una familia de pequeñas proteínas secretadas que actúan uniéndose directamente a MMPs activas inhibiendo de esta manera su acción. Hasta la fecha, cuatro TIMPs de mamíferos se han identificado [14]. Entre los miembros de la familia TIMP, TIMP-2 es único en su capacidad para inhibir el crecimiento del tumor y la angiogénesis a través de vías también independientes de la inhibición de MMP [15], [16], [17]. La hipótesis de que la producción de TIMP2 a partir de células infectadas por virus debe unirse e inhibir el exceso de MMP extracelulares y con ello inhibir la progresión del tumor a través de las dos vías dependientes de MMP y MMP-independientes.
Anteriormente, hemos desarrollado y se determinó el potencial terapéutico de un VAO TIMP2-armado, Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, para la terapia de cáncer de ovario [18]. selectividad de transducción de la VAO se logró mediante la sustitución genéticamente la perilla Ad5 con el mando Ad3, que elude la coxsackie y adenovirus receptor (CAR) y redirige la unión al receptor Ad3, que se expresa en abundancia en las células de cáncer de ovario [19], [ ,,,0],20]. El promotor CXCR4 se utilizó para mediar tumor replicación selectiva del vector, ya que exhibe actividad superior tanto en las células cancerosas establecidas de ovario humano y los tejidos tumorales primarios derivados del paciente [18]. Además, la actividad de promotor CXCR4 es mínima en el hígado, el principal órgano conocido para modular sistémicamente entregados vectores adenovirales [21]. El gen TIMP2 se incorporó para inhibir la progresión del tumor. Recientemente hemos validado
in vitro
que Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 produjo TIMP2 funcional, como se indica por la inhibición de la degradación enzimática de la gelatina por MMPs activas [18]. Para el VAO TIMP2-armado para ser eficaz, es importante que la expresión de TIMP2 no perjudicó la replicación viral o su potencia oncolítico. Recientemente hemos demostrado que tanto la replicación viral y la potencia oncolítico no se vieron comprometidas en tanto SKOV3.ip1 y 4 OV-células humanas de cáncer de ovario por armar con TIMP2 [18]. Además, hemos demostrado que no había selectividad en la replicación con el promotor CXCR4, como se indica por un nivel más alto de replicación en las células de cáncer de ovario, en comparación con el control de los fibroblastos. Hacia la traducción de este virus en la clínica, se empleó adicionalmente el uso de un
ex vivo
sistema modelo para examinar más la replicación viral en los tumores de los tejidos obtenidos a partir de pacientes con estadio confirmado III y IV de cáncer de ovario. Los resultados de este estudio indicaron una reproducción consistente de alto nivel con Ad5 /3-CXCR4 TIMP2 [18]. Colectivamente, estos datos fueron muy alentadores, lo que sugiere que Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 podría ser eficaz para el tratamiento de cáncer de ovario avanzado. En el presente estudio, hemos tratado de determinar la eficacia terapéutica de Ad5 /3-CXCR4 TIMP2 en un modelo murino ortotópico de cáncer de ovario diseminado. La progresión tumoral se controló a través de
in vivo
imagen no invasivas. Los resultados del presente estudio demostraron un aumento significativo en la supervivencia tras el tratamiento con Ad5 /3-CXCR4 TIMP2, lo que sugiere su potencial para la traducción clínica.
Materiales y Métodos
Las células
La línea celular de adenocarcinoma de ovario luciferasa que expresan SKOV3-luc luciérnaga fue proporcionado amablemente por el Dr. R. Negrín (Escuela de Medicina de Stanford, Stanford, CA). La línea celular de carcinoma de pulmón humano A549 se adquirió de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). Ambas líneas celulares se cultivaron en una mezcla 01:01 de medio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) y medio F-12 de Ham, suplementado con 10% (v /v) de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS; Invitrogen, Carlsbad, CA) , L-glutamina (2 mM), penicilina (100 U /ml) y estreptomicina (100 mg /ml), a 37 ° C en una atmósfera humidificada y en 5% de CO
2. Medios y suplementos se compraron de Mediatech (Herndon, VA).
Es una, eliminan E3-
Construcción y producción de los virus
Ad-ΔE1-E1- TIMP2 deficiente en la replicación del vector Ad5 cuales expresa TIMP2 bajo el control del promotor de CMV [22]. Ad5 /3-CXCR4, es un VAO con el promotor CXCR4 insertado en la posición de E1A junto con una fibra de tropismo modificado, que contiene el eje de la fibra Ad5 y la cola que ha tenido el dominio perilla reemplazado con la del virus Ad3 [23]. El /3-CXCR4-TIMP2 Ad5 se construyó usando un ADNc TIMP2 humano de longitud completa como se describe anteriormente [18]. El adenovirus de replicación deficiente, Ad-ΔE1-TIMP2 se propagó en células 293. Los crads, Ad5 /3-CXCR4 y Ad5 /3-CXCR4 TIMP2 fueron amplificados en la línea celular A549. Todos los virus se purificaron mediante dos rondas de centrifugación de densidad de cloruro de cesio. Los títulos de partículas virales infecciosas y las unidades se determinaron como se describe anteriormente [24].
modelo ortotópico de cáncer de ovario y tratamiento vector
hembra Balb /c nu /nu ratones de 6 a 8 semanas de la edad se obtuvieron del Instituto del cáncer-Frederick Animal Área Nacional de Producción (Frederick, MD) y puesto en cuarentena durante 2 semanas. Los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos según la Asociación Americana para la Acreditación de Laboratorio Animal Care directrices. los animales protocolos fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Alabama en Birmingham.
In vivo
imágenes ópticas se llevó a cabo en la pequeña instalación núcleo formador de imágenes de animales en el Centro Integral del Cáncer de la Universidad de Alabama en Birmingham. En el día 0, los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal (i.p.) con 5 x 10
6 células SKOV3-luc en 250 l de PBS y la imagen de bioluminiscencia para obtener lecturas de línea de base. Ocho días más tarde, los ratones se vuelven a crear imágenes para asegurar la implantación de los tumores y luego se dividieron al azar en cuatro grupos: PBS, Ad-ΔE1-TIMP2, Ad5 /3-CXCR4, y Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, con n = 10 por grupo. Cada ratón se inyectó i.p. con 2 × 10
8 UI del virus dado en 200 l de PBS, o PBS solo. Todos los ratones fueron imágenes de bioluminiscencia semana después de la inyección de las células tumorales para controlar el crecimiento del tumor. Todos los ratones fueron seguidos diariamente para grabar la supervivencia. El tiempo de supervivencia refleja el tiempo requerido para los animales para alcanzar ambos de los siguientes parámetros. En primer lugar, la evidencia clínica de dolor o angustia. En segundo lugar, ninguno de los parámetros medibles predeterminados incluyendo: pérdida de peso superior al 15%, o el aumento de peso inferior o igual a 20% del peso corporal. El peso de los animales se midió en días 0 y vuelve a medir cada 3 días hasta el final del experimento. Los datos de supervivencia se representaron en una curva de Kaplan-Meier, y los diferentes grupos se compararon mediante el log-rank (Mantel-Cox) prueba (v.5 GraphPad Prism Software).
Imágenes de bioluminiscencia para detectar
In in vivo
luciferasa de expresión
Ratones se obtuvieron imágenes en el día 0 para la señal bioluminiscente después de la inyección de las células SKOV3-luc para obtener una lectura de referencia de la carga tumoral. Imaging se realizó de nuevo antes del tratamiento inicial el día 8 y luego semanalmente hasta que se sacrificaron los ratones. Brevemente, 150 mg /kg de D-luciferina se inyectó i.p., y los ratones fueron anestesiados con anestesia de gas isoflurano y se coloca en una cámara hermética a la luz. La imagen de referencia fotográfica (escala de grises) se obtuvo en 10 min después de la inyección de D-luciferina, y la imagen bioluminiscente se recogió inmediatamente después. Las imágenes se obtuvieron con un CCD enfrió a -120 ° C, utilizando el Sistema de -100 IVIS Imaging (Xenogen Corp., Alameda, CA), con el campo de visión fijada a una altura 25 cm. Las imágenes bioluminiscentes utilizan las exposiciones que van desde 1 a 10 s, 1 f /stop, 4 de agrupación y filtro abierta. Software de adquisición de datos fue calibrado de manera que ningún píxel se saturaron durante la recogida de la imagen. Las imágenes bioluminiscentes y en escala de grises se superpusieron usando el software LivingImage. Living Software Image (Xenogen, Alameda, CA) se utilizó también para obtener una imagen en pseudocolor que representa la intensidad de la bioluminiscencia (azul, menos intenso, y rojo, más intenso). Las regiones de interés se extrajeron alrededor de la vía intraperitoneal tumores, y los recuentos totales (fotones) se sumaron para toda el área del tumor. Los recuentos totales se normalizaron a tiempo de adquisición de imagen (fotones /seg). Las diferencias estadísticas del tamaño del tumor entre los grupos se evaluaron mediante la prueba de la t de Student. Un
p valor Red de & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Los datos se presentan como valores medios ± SD.
Inmunohistoquímica
Los ratones se sacrificaron a alta carga tumoral por los parámetros predeterminados definidos como anteriormente. Al momento del sacrificio, se realizaron necropsias en 3 ratones de cada grupo de tratamiento, desde el que se recogieron los tumores y los órganos principales y se fijaron en bloques de parafina. Brevemente, las secciones de parafina de los tumores de ovario humano xenoinjertados se deparaffinized en xileno y se hidrataron a través del alcohol graduada. La recuperación del antígeno se llevó a cabo en tampón de citrato (pH 6,0), bajo vapor para 20 min. Las secciones se enfriaron a temperatura ambiente, y la peroxidasa endógena se eliminó usando 0,3% H
2O
2 en metanol durante 30 min y se bloquearon con 5% de BSA durante 30 min. Las secciones de tejido se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C. Las secciones se lavaron en solución salina tamponada con fosfato que contiene 0,05% de Tween-20 (PBST) y de nuevo se incubaron a temperatura ambiente con anticuerpo secundario conjugado con biotina de cabra anti-cabra /anti-ratón de 2 h. Después del lavado, las secciones se incubaron con peroxidasa de rábano picante conjugada con estreptavidina por 1 h a temperatura ambiente. Después de otro lavado con PBST, inmunodetección se realizó utilizando 3,3 '-Diaminobencidina-H
2O
2 (Vector Labs) y contratinción con hematoxilina.
Resultados
Armado con TIMP2 retraso en el crecimiento tumoral
in vivo
ovario
Para evaluar la eficacia terapéutica de Ad5 /3-CXCR4 TIMP2 en un
in vivo
modelo clínicamente relevante, hemos generado de forma ortotópica difundimos cáncer mediante la inyección de ratones hembra desnudos con células SKOV3-luc humanos por vía intraperitoneal (ip). Una línea celular estable que expresa luciferasa se utiliza para monitorizar la eficacia terapéutica de los tratamientos de imagen no invasiva
in vivo
. Ocho días después de la administración de células tumorales, los ratones se re-captación de imagen para asegurar la implantación de los tumores y se dividieron en cuatro grupos de tratamiento, con 10 ratones por grupo. Los grupos de control recibieron PBS, un vector deficiente en replicación que expresa TIMP2 (Ad-ΔE1-TIMP2), o una VAO regulado promotor CXCR4 con una Ad5 /fibra 3 quimérico (Ad5 /3-CXCR4). El grupo terapéutico recibió una VAO basado promotor CXCR4 TIMP2-armado con un Ad5 /fibra 3 quimérico (Ad5 /3-CXCR4-TIMP2) (Fig. 1). Todos los ratones fueron imágenes después por vía intraperitoneal inyecciones de D-luciferina sobre una base semanal. Un panel de imágenes representativas se muestra en la Fig. 2A, mientras que la determinación cuantitativa de las señales bioluminiscentes se muestra en la Fig. 2B. señales bioluminiscentes bajos de células SKOV3-luc se detectaron a los 8 días después de la inyección de células tumorales, y fueron relativamente consistentes entre los cuatro grupos. Por día 22, hubo un crecimiento tumoral significativo en el grupo de PBS y Ad-ΔE1-TIMP2 grupo tratado. Por el contrario, los grupos tratados con los crads tenían una inhibición significativa en el crecimiento tumoral. El grupo tratado con el virus diana, Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, exhibió la regresión del tumor en el día 22. En el día 30, hubo una considerable carga tumoral en el grupo de PBS, como los ratones mostraron un aumento considerable de la circunferencia abdominal y comenzaban a mostrar signos de la carga de enfermedad. Por el contrario, el crecimiento tumoral se inhibió de manera significativa en todos los grupos tratados con virus (p & lt; 0,001). Por día 36, la mayoría de los ratones en el grupo PBS había muerto de una carga tumoral pesada. En este punto del tiempo, los ratones tratados con Ad-ΔE1-TIMP2, comenzaron a mostrar una considerable carga tumoral. Sin embargo, ambos grupos tratados con crads tuvieron significativamente menos señal bioluminiscente (p & lt; 0,001), lo que indica una menor velocidad de desarrollo del tumor. Además, la carga tumoral en la cohorte de ratones tratados con Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, la VAO armado, fue significativamente menor en comparación con la carga tumoral en los ratones tratados tanto con Ad5 /3-CXCR4 y el desarmado VAO (p & lt; 0,01 ; Fig. 2B). Se observó una tendencia similar en la supervivencia después del tratamiento con diferentes vectores en dos estudios piloto con menos número de animales por grupo (datos no mostrados). Colectivamente, estos datos sugieren que tanto la replicación viral y de armado con TIMP2 contribuyeron a retrasar el comienzo del crecimiento tumoral.
Adwt300, es la de tipo salvaje virus Ad5. Ad-ΔE1-TIMP2 es un vector Ad5 de replicación deficiente con deleción de E3 E1-, que expresa TIMP2 bajo el control del promotor de CMV en E1. Ad5 /3-CXCR4 es un VAO desarmado con un promotor CXCR4 en E1 para limitar la replicación viral a las células del cáncer en combinación con una fibra modificada Ad5 /3 que contiene el eje y la cola de la fibra de Ad5 y el mando de fibra Ad3. Ad5 /3-CXCR4 TIMP2 es un VAO con el promotor CXCR4 en E1, armado con TIMP2 en la región E3B y el F5 3 de fibra mencionada /modificado.
tumores diseminados se establecieron mediante la inyección de 5 × 10
6 células SKOV3-luc ip en ratones desnudos atímicos hembra en el día 0. En el día 8, los ratones fueron tratados con una inyección i.p. inyección de PBS, o 2 × 10
8 UI de Ad-ΔE1-TIMP2, Ad5 /3-CXCR4, y Ad5 /3-CXCR4 TIMP2, respectivamente. los niveles de bioluminiscencia se midieron semanalmente. (A), que representa la imagen pseudocolor intensidad bioluminiscencia en los días 8, 22, 30 y 36. (B), la intensidad de la bioluminiscencia de la región abdominal se cuantificó y se normalizó, y los recuentos medios de fotones por segundo para cada grupo se muestran para los días indicados . Datos reportados como la media ± desviación estándar para cada grupo de tratamiento. * P & lt;. 0,05
Armado con TIMP2 aumento de la supervivencia
Todos los ratones se les dio seguimiento para la supervivencia, como se muestra en la Fig. 3A. El tiempo de supervivencia media aumentó de 33 días, para la cohorte de PBS, a 39 días en la cohorte inyectado con el vector que expresa TIMP2 no replicante (Ad-ΔE1-TIMP2), esta diferencia fue estadísticamente significativa (p & lt; 0,03). La cohorte tratada con la VAO desarmados (Ad5 /3-CXCR4) tuvo tiempo de supervivencia media de 52,5 días, mientras que la cohorte tratada con la VAO TIMP2-armada (Ad5 /3-CXCR4 TIMP2) tenían una mediana de supervivencia de 63 días ( Fig 3B), esta diferencia con también estadísticamente significativa (p & lt;. 0.002). En resumen, el armado con TIMP2 parece ser útil para el tratamiento de cáncer de ovario diseminado, ya que aumentó la supervivencia
in vivo
.
Los ratones se controlaron para la supervivencia. Los datos de supervivencia se representan en una curva de Kaplan-Meier (A). El tratamiento con Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 mejora de forma significativa la supervivencia en comparación con el tratamiento con Ad-ΔE1-TIMP2, Ad5 /3-CXCR4, o PBS (p & lt; 0,05). (B), la mediana de supervivencia en días para cada grupo de tratamiento.
TIMP2 se expresa en los tumores de los virus armados
Para determinar si el aumento de la supervivencia se ve en la VAO TIMP2-armado en comparación con el desarmado VAO era debido a la modulación del microentorno por TIMP2, la expresión de TIMP2 se examinó primero en los tumores extirpados de cada grupo de tratamiento en la autopsia. Como se ve en la Fig. 4, los tumores extirpados de los grupos tratados con PBS y Ad5 /3-CXCR4 fueron negativos para la expresión TIMP2. Resultado de la inmunohistoquímica indicó que en los tumores extirpados de cohorte tratada con el Ad-ΔE1-TIMP2, expresión TIMP2 fue mínimo y parecía limitada a la periferia del tumor. Esto no fue inesperado, como Ad-ΔE1-TIMP2 es un vector no replicante y no se esperaba que difundir dentro del tumor efectiva. Por el contrario, los tumores de los ratones tratados con Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 exhibieron mejorada tinción TIMP2 en todo el tumor, lo que indica que este virus oncolítico fue eficaz en infectar y replicar en todo el tumor.
En el momento del sacrificio de los ratones debido a la carga tumoral, los tumores fueron recogidos de los grupos de tratamiento indicadas y se examinó la expresión de TIMP2 por inmunohistoquímica.
TIMP2-VAO armada disminuyó el nivel de las MMP activas
TIMP2 es un conocido inhibidor de MMP2 y MMP9. Por lo tanto, se realizó la tinción para MMP2 y MMP9 activa para determinar si se afectan los niveles. Los resultados de este análisis indican que los tumores de los grupos tratados con PBS, Ad5 /3-CXCR4, y Ad-ΔE1-TIMP2, todos los altos niveles exhibidos de MMP2 activo. En contraste, los tumores del grupo tratado con Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 tenían niveles muy bajos de MMP2. Un patrón idéntico se detectó también en la expresión de MMP9 por inmunohistoquímica. Grupos tratados con PBS, Ad5 /3-CXCR4, y Ad-ΔE1-TIMP2, toda la inmunorreactividad exhibido por MMP9 activa. En contraste, los tumores del grupo tratado con Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 tenían niveles muy bajos de expresión de MMP9 activa (Fig. 5). Estos datos sugieren que TIMP2 secretada por la VAO armado también fue eficaz en la inhibición de las actividades de MMP2 y MMP9.
En el momento del sacrificio de los ratones, debido a la carga tumoral, los tumores se recolectaron de los grupos de tratamiento indicados y se examinaron para la expresión de MMP-9 mediante técnicas de inmunohistoquímica.
TIMP2-VAO armada inhibe la angiogénesis
por último, los tumores se examinaron para la expresión de CD31, un marcador de la angiogénesis. Cohortes tratadas con PBS, Ad-ΔE1-TIMP2, y Ad5 /3-CXCR4, tenían vasos de gran diámetro con inmunorreactividad mínimo revestimiento de las paredes endoteliales en comparación con las cohortes tratadas con Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 (Fig. 6).
se recogieron
conglomerados tumor en el área abdominal durante el sacrificio de los animales de los grupos de tratamiento indicados y fijo. M cinco secciones de bloques de parafina de los tejidos tumorales se tiñeron con el anticuerpo CD31 humano para detectar vasculatura sanguínea.
Discusión
La importancia de la interacción entre las células tumorales y el microentorno del tumor en la modulación progresión tiempo se ha reconocido [25]. En la patogénesis de cáncer de ovario, MMP-2 y MMP-9 son upregulated consistentemente [12]. Por otra parte, el aumento de los niveles de estas MMP correlacionados negativamente con la supervivencia ya que están asociados con la etapa avanzada, ascitis de alto grado y nodo (metastásico) linfáticos positivos [13]. Estos datos sugieren que las MMP son dianas terapéuticas válidas para el tratamiento de cáncer de ovario. Un regulador clave de MMPs es sus inhibidores endógenos, TIMPs. Cuatro TIMPs de mamíferos se han identificado hasta el momento, entre ellos TIMP2 se ha estudiado más extensamente debido a su capacidad para inhibir el crecimiento del tumor y la angiogénesis por una variedad de mecanismos independientes de la directa MMP-inhibición [15], [16], [17]. TIMP2 puede inhibir la proliferación de células endoteliales a través de la inducción de la proteína tirosina fosfatasa actividad [17]. TIMP2 también inhibe el crecimiento del tumor y la angiogénesis mediante el aumento de la actividad de mitogen-activated proteína quinasa fosfatasa 1 [15]. En un esfuerzo por desarrollar un VAO éxito orientado hacia el tratamiento de cáncer de ovario diseminado, hemos propuesto que armar con TIMP2 aumentaría la eficacia terapéutica de la VAO mediante la inhibición de la progresión del tumor a través de ambas vías de MMP-dependiente y MMP-independientes.
en nuestro estudio reciente, caracterizar y evaluar la eficacia de Ad5 /3-CXCR4 TIMP2
in vitro
. Se confirmó que la expresión TIMP2 no afectó la replicación viral o la potencia oncolítico del virus. Por otra parte, una replicación selectiva se logró con el promotor CXCR4. Validación de Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 en muestras de tumores primarios de cinco pacientes con la etapa confirmado III o IV de cáncer de ovario, reveló un alto nivel constante de la replicación en comparación con los otros virus de control. En conjunto, estos datos sugieren el potencial del Ad5 /3-CXCR4 TIMP2 para el tratamiento de cáncer de ovario avanzado [18].
En el presente estudio, hemos tratado de determinar la eficacia de Ad5 /3-CXCR4- TIMP2
in vivo
. bioluminiscente de imágenes no invasiva proporciona una potente herramienta que permite la monitorización longitudinal de crecimiento tumoral en ratones. Por otra parte, nos permitió utilizar un sistema modelo que es clínicamente relevante. En la mayoría de los casos, el cáncer de ovario se diagnostica en una etapa avanzada, donde el cáncer se ha diseminado por toda la cavidad peritoneal, por lo tanto, el uso de un modelo animal subcutáneo para evaluar la eficacia del tratamiento, mientras que es conveniente, no refleja la progresión clínica natural de la enfermedad. tumores, por lo tanto, el establecimiento de diseminados con i.p. inyección de células SKOV3-luc, junto con imágenes nos permitió utilizar un sistema modelo clínicamente válida que se puede predecir más precisión y eficacia el valor de traslación de Ad5 /3-CXCR4-TIMP2. Por otra parte, varios estudios han demostrado la sensibilidad y la validez de bioluminiscente de imágenes en i.p. modelos de tumores [26], [27], [28].
El tratamiento con un VAO aumentado significativamente la supervivencia TIMP2-armada cuando se compara con los desarmados VAO, sin embargo, el incremento no fue sólida. En el presente estudio, virotherapy se dio con una sola inyección de virus de baja dosis en el día 8 después de la implantación del tumor. Por el contrario, muchos
in vivo
experimentos que examinan la eficacia de iniciar el tratamiento, ya sea antes o en el mismo día de la inyección del tumor. Por otra parte, las dosis virales utilizados fueron al menos una o dos troncos superior y se entregan a través de múltiples administraciones de virus [29], [30], [31], [32]. El objetivo principal de la limitación de la dosis de vector en el presente estudio fue establecer un índice terapéutico seguro. Dado que los modelos de ratones desnudos utilizados en la evaluación preclínica de terapias experimentales de cáncer de ovario no tienen un sistema inmunológico funcional, el aumento de la dosis de vector al nivel más alto posible para lograr un efecto terapéutico puede no ser apropiado para la extrapolación a los seres humanos como el más alto del vector la dosis da como resultado la activación del sistema inmune que causa efectos secundarios graves. Sin embargo, a partir de datos de este estudio, es concebible que con una dosis más alta o un régimen de dosificación múltiple, la eficacia terapéutica puede mejorarse aún más. Una desventaja potencial con la administración repetida del virus es que la inmunidad podría convertirse en un problema significativo y obstaculizar la eficacia terapéutica. Publicación reciente de
Hemminki et al
sugieren que incluso en la presencia de una inmunidad significativa contra el Ad5, se podría pasar por alto esta inmunidad mediante el simple uso de un serotipo que es menos frecuente en la población, tales como Anuncio3 y así lograr la eficacia terapéutica sin la necesidad de aumentar la dosis viral. Este principio podría aplicarse fácilmente a repetir administraciones de virus, en la que si la inmunidad se desarrolla al serotipo utilizado, entonces uno puede simplemente cambiar la columna vertebral del virus de un serotipo menos frecuente [33]. Además, el aumento de la eficacia viral también podría conseguirse mediante un enfoque de múltiples modalidades, utilizando la radiación o la quimioterapia como terapias adyuvantes [34], [35], [36]. Con nuestra plataforma actual del virus de orientación a través de Ad5 /3 es concebible que potencialmente podría infectar y replicarse en las células inmunes humanas, en la medida de que no se puede determinar en este modelo, como adenovirus humano no se replican en el tejido del ratón y atímicos desnudos ratones carecen de células T. Sin embargo, este potencial efecto secundario podría mitigarse cambiando el tropismo de la plataforma viral. Perreau
et al
mostraron una disminución de la infección de células dendríticas con el serotipo de adenovirus canino 2 (CAV-2) Mando de fibra [37]. Por lo tanto, al cambiar el mando de la fibra de Ad5 /3 a Ad-CAV2, podemos evitar que la transducción de células dendríticas. Además, esto permite conservar los promotores CXCR4 ya que exhibe alta actividad en las células tumorales
.
La biología del tumor, la naturaleza de la difusión peritoneal de cáncer de ovario, así como los papeles paradójicos de MMPs y TIMPs en la progresión del cáncer añade más complejidad a un tratamiento eficaz de la enfermedad. Está bien establecido que el aumento de MMP-2 y MMP-9 expresión en el cáncer de ovario se correlaciona negativamente con el pronóstico y la supervivencia [12], [13], [38], [39], [40], [41]. Sin embargo, las funciones específicas de MMPs en la progresión del cáncer de ovario no están bien definidos. Los estudios indican que la MMP-2 es predominantemente importante en la tumorigénesis temprana mediante el inicio de la metástasis a través de la mejora de la adhesión de células de cáncer de ovario al peritoneo [42]. Por lo tanto, las terapias para bloquear una vez se establece la metástasis son ineficaces. Sin embargo, otros informes apoyan el papel de la MMP-9 en el crecimiento tumoral y la angiogénesis [43]. Los papeles de MMP y TIMP en el cáncer de ovario son confundidos por estudios inmunohistoquímicos que miran la expresión de TIMP2 en tejidos de cáncer de ovario. Mientras que algunos grupos han informado de baja expresión de TIMP2 en los tumores primarios de ovario [38], otros han visto el aumento de expresión TIMP2 en tejidos de cáncer de ovario, lo que sugiere que TIMP2 contribuye a la progresión del tumor, en parte a través de la activación de pro-MMP2 y la inhibición de anti- actividades de las MMP tumorales [39], [41]. Por el contrario, varios estudios en animales utilizando la entrega viral de TIMP2 han demostrado su utilidad para suprimir el crecimiento de tumores, la migración y la metástasis en varios modelos de cáncer [44], [45], [46], [47], [48]. En conjunto, estos estudios indican que tal vez los efectos de TIMP2 en la promoción de tumores o supresión dependen de sincronización y el tipo específico de tumor. En lugar de la inhibición no específica de las MMP, tal vez sea más útil para inhibir específicamente diferentes MMPs durante las etapas de la progresión tumoral
.
Al salir de datos de los estudios genéticos clínicos, patológicos y moleculares sugieren un nuevo modelo de carcinogénesis de ovario, donde ovario cáncer se clasifica en dos grupos distintos, tipo I y II [49]. tumores de tipo I son clínicamente indolente, ya que son de crecimiento lento y generalmente confinadas al ovario en el diagnóstico. Por el contrario, los tumores de tipo II son clínicamente agresiva, presente en una etapa avanzada y se cree que surgen
de novo, ya que no se han identificado lesiones precursoras. Los tumores de tipo II, que representan el 70% de cáncer de ovario, se caracterizan por las mutaciones de TP53 en 80% de los casos. Estos nuevos datos sugieren que p53 podría potencialmente ser una diana terapéutica para armar el virus para la terapia del cáncer de ovario. Crads armados con p53 se ha demostrado
in vitro
para mejorar oncolisis en el cáncer cervical [50] y una variedad de otras líneas celulares de cáncer [51]. Otro objetivo terapéutico potencial es CXCR4, el único receptor de quimioquinas encontrado que se expresa en cáncer de ovario [52].