Extracto
El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo y sigue siendo el más frecuente. Interacción entre PI3K /AMPK /AKT y MAPK vías es un efector crucial en el crecimiento del cáncer de pulmón y la progresión. Estas quinasas de proteínas de transducción de señales sirven como buenas dianas terapéuticas para el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) que comprende hasta 90% de los cánceres de pulmón. A continuación, describimos si 21α-Methylmelianodiol (21α-MMD), un derivado activo de triterpenoides
Poncirus trifoliata
, puede mostrar propiedades contra el cáncer mediante la regulación de estas señales y modular la aparición de resistencia a múltiples fármacos en células de NSCLC. Se encontró que 21α-MMD inhibió el crecimiento y la formación de colonias de células de cáncer de pulmón sin afectar el fenotipo de las células de pulmón normal. 21α-MMD también abrogada la actividad metastásica de las células de cáncer de pulmón a través de la inhibición de la migración celular y la invasión, y se indujo G
0 /G
detención del ciclo celular 1 con aumento de la generación intracelular de ROS y la pérdida de integridad de la membrana mitocondrial. 21α-MMD regulada la expresión de PI3K AKT y MAPK señalización AMPK //, que nos llevó a una evaluación adicional de su actividad en la resistencia a múltiples fármacos (MDR) en células de cáncer de pulmón mediante la especificación de la P-glicoproteína (P-gp) /MDR1-asociación. El empleo de las células A549 resistentes a paclitaxel establecidos (A549-PACR), encontramos además que 21α-MMD indujo una actividad de inversión de la MDR a través de la inhibición de la P-gp /expresiones MDR1, la función y la transcripción con la sensibilidad paclitaxel recuperado cuales dependiente podría correlacionarse con la regulación de la vía de señalización /mTOR PI3K. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran, por primera vez, la evaluación mecanicista
in vitro Red de 21α-MMD se presentan inhibidor del crecimiento potencial con influencia sobre MDR reversión en células de cáncer de pulmón humano.
Visto : Aldonza MBD, Hong JY, Bae SY, Song J, Kim WK, Oh J, et al. (2015) La supresión de señalización MAPK y Reversión de mTOR-dependiente MDR1-Asociados resistencia a múltiples fármacos por 21α-Methylmelianodiol en células de cáncer de pulmón. PLoS ONE 10 (6): e0127841. doi: 10.1371 /journal.pone.0127841
Editor: Javier S. Castresana, Universidad de Navarra, ESPAÑA
Recibido: 28 Agosto, 2014; Aceptado: April 21, 2015; Publicado: 22 Junio 2015
Derechos de Autor © 2015 Aldonza et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Esta investigación fue apoyada por una beca (2005 y 12172MFDS989) del Ministerio de Alimentación y Medicamentos de Seguridad y la Fundación Nacional de investigación de Corea (NRF), financiado por la subvención el Gobierno de Corea (MEST) (Nº 2009-0.083.533)
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es el más común de cáncer en todo el mundo durante décadas, y es responsable de aproximadamente 1,38 millones de muertes cada año, tanto para hombres y mujeres en los Estados Unidos solamente. El pronóstico asociado con la enfermedad es muy pobre retrasando el diagnóstico hasta etapas avanzadas finales de los años y las opciones de tratamiento son limitadas, lo que resulta en la tasa de mortalidad casi el 90%, debido al fracaso del tratamiento causada por la progresión de la metástasis no detectada [1]. productos naturales se han utilizado como agentes terapéuticos médicos durante siglos con hasta 70% de todos los fármacos aprobados para la quimioterapia clínica, así como para el tratamiento de cáncer de pulmón entre 1981 y 2002 que consiste en cualquiera de los productos o químicos naturales y derivados sintéticos a base de productos naturales. [2]. Sin embargo, el mecanismo por el cual la mayoría de los productos naturales exhiben su potencial terapéutico es menos conocido. Triterpenoides han estado tomando una creciente atención últimamente en la terapéutica del cáncer de pulmón debido a su quimiopreventivo informado y potencial terapéutico tanto
in vitro
y
in vivo
[3,4]. 21α-Methylmelianodiol (21α-MMD) es un triterpeno natural y un isómero de 21-methylmelianodiols primera aisladas a partir de los frutos de
Poncirus trifoliata gratis (Rutaceae), que durante mucho tiempo se ha utilizado en la medicina oriental como remedio para la alergia inflamación. En informes recientes, 21α-MMD está representada actividades anti-inflamatorias funcionales [5]. Sin embargo, no ha habido ningún informe de evaluación aún más su potencial contra el cáncer y el mecanismo de acción en el cáncer de pulmón.
Cáncer de supervivencia asociada a las vías de señalización, incluyendo fosfoinosítido 3-quinasa (PI3K) /Akt /objetivo mamífero de la rapamicina (mTOR ) y asociados a metástasis vías AMPK activadas por mitógenos proteína quinasa (MAPK) y cáncer desempeñan un papel fundamental en la regulación de las actividades funcionales inducidas por fármacos tales como la apoptosis inducida por daño en el ADN, la inhibición del crecimiento celular, y servicios públicos /progresión anti-metastásicos [6 , 7], con actividad reguladora funcional fundamental pronunciado en la proliferación de células de cáncer de pulmón y la supervivencia [8]. Los mecanismos moleculares exactos responsables de la mayor parte de las actividades contra el cáncer inducido por triterpenoides que implican estas vías clásica aún no se han aclarado por completo para incorporar nuevas estrategias terapéuticas para mejorar los resultados.
Otra causa fundamental del fracaso del tratamiento en el cáncer de pulmón es la aparición de resistencia a múltiples fármacos (MDR), el mecanismo principal por el que muchos tipos de cáncer se hacen resistentes a un amplio espectro de agentes quimioterapéuticos. PI3K /AKT y MAPK señalización han sido ampliamente implicado en el desarrollo de la TB en el cáncer de pulmón. La estimulación de estas vías hace que las células de tumor de pulmón resistente a los fármacos quimioterapéuticos citotóxicos, tales como paclitaxel, para impactar aún más la función celular [9,10]. La sensibilidad a diferentes agentes quimioterapéuticos varía ampliamente de un paciente a otro. Sin embargo, un mecanismo molecular puede señalarse para diseñar con eficacia la combinación de tratamientos quimioterapéuticos razón de ser, es decir apuntando el MDR1 (ABCB1) gen codificado P-glicoproteína (P-gp), responsable de bombear a cabo una variedad de xenobióticos y sustancias endógenas desde el interior a la región extracelular de las células [11]. Evidencias recientes han hecho hincapié en la interacción entre la señalización de mTOR y P-gp /MDR mediada por MDR1 en los carcinomas hepatocelulares y el cáncer colorrectal [12,13]. Este tipo de asociaciones han llevado a caracterizar funcionalmente el mecanismo regulador potencial de apuntar a la vía PI3K /AKT y MAPK vía y posterior deterioro de la actividad de P-gp [14,15]. Además, varios estudios también han sugerido el desarrollo de fármacos en base de flavonoides y triterpenoides que pueden dirigirse estas señales a la forma posterior de una categoría de los inhibidores de P-gp y mejorar la actividad de varios medicamentos contra el cáncer, tales como paclitaxel y doxorubicina [16 -18].
el propósito de este estudio, por lo tanto, era identificar de manera mecánica el modo de acción de 21α-MMD en las células de NSCLC humanos y relacionar aún más su mecanismo de regulación sobre el crecimiento celular y las señales relacionadas con la supervivencia como la vía PI3K /AKT /AMPK y MAPKs con P-gp /MDR1-MDR asociada aparición de un fenotipo de cáncer de pulmón. Caracterización de los mecanismos de acción de 21α-MMD puede conducir a nuevos conocimientos de desarrollo terapéutico para combatir el crecimiento, la actividad metastásica, así como la incidencia de la TB en los cánceres de pulmón humano.
Materiales y Métodos
Reactivos
ácido tricloroacético (TCA), (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT), sulforodamina B (SRB), yoduro de propidio (PI ), la RNasa A, paclitaxel, 5-fluorouracilo (5-FU), monoclonal de ratón anti-β-actina de anticuerpos, dicloro-dihidro-fluoresceína diacetato (DCFH-DA), rodamina 123, violeta cristal, N-acetil-L- cisteína (NAC), y otros reactivos a menos que se indique lo contrario se adquirieron de Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO, EE.UU.). RPMI 1640, suero bovino fetal (FBS), solución de antibiótico-antimicótico, y tripsina-EDTA fueron adquiridos de Invitrogen (Grand Island, NY, EE.UU.). monoclonal de ratón anti-fosfo-ERK (Tyr 204), anti-c-myc, y policlonal de conejo anti-ciclina A, B1 anti-ciclina, e anti-ciclina, anti -CDK2, anti-CDK4, anti-Rb y anti-fosfo-Rb, anti-ERK media, MAPK anti-p38, anti-fosfo Akt, anti-Akt, anti-fosfo-mTOR, anti-mTOR se adquirieron de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.). Ratón monoclonal anti-fosfo-JNK /SAPK (Thr 183 /Tyr 185), anti-JNK /SAPK, anti-fosfo-p38 (Thr 180 /Tyr 182), anti-AMPK, anti-fosfo-AMPKα (Thr 172), anti-PI3K, y p85 anti-fosfo-PI3K (Tyr 458) fueron adquiridos de Señalización celular Tecnología (Danvers, MA, EE.UU.). Alexa Fluor 488 marcado con pollo IgG anti-conejo se adquirió de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). Ratón monoclonal anti-P-gp y isotiocianato de fluoresceína (FITC) marcado con monoclonal anti-P-gp fue adquirido de Abcam (Cambridge, MA, EE.UU.). El éster etílico del tinte tetrametilrodamina lipofílico catiónico (TMRE) se adquirió de Molecular Probes (OR, USA). EN-TARGETplusTM (SmartPool) mTOR y revueltos siRNAs fueron adquiridos de Thermo Scientific-Dharmacon RNAi Tecnologías (Suwanee, GA, USA). El compuesto de ensayo, 21α-MMD, se aisló de los frutos de
Poncirus trifoliata
como se describe anteriormente [19] y proporcionados por el doctor S. H. Lee, un co-autor, de la Facultad de Farmacia, Universidad de Yeungnam, Corea.
Líneas celulares y condiciones de cultivo
células de cáncer de pulmón humano (A549, H460, H358 H1299, H292 y) , células humanas normales de pulmón (L132 y MRC-5), células de cáncer de mama humano (MDA-MB-231), las células tumorales epiteliales de mama ductal humano (T47D), células de cáncer de hígado humano (SK-HEP-1), y gástrica humana las células cancerosas (SNU-638) fueron proporcionados por la célula de Corea Línea de banco (Seúl, Corea). A549 células resistentes a paclitaxel (A549-PACR) fueron desarrollados por nuestro grupo a partir de células A549 parentales a través de la exposición continua a aumentar gradualmente las concentraciones de paclitaxel mantenimiento continuo crecimiento y morfología fina padres-como [20]. Las células se cultivaron en DMEM (por MRC-5, MDA-MB-231, y las células 1 SK-HEP-) y RPMI-1640 (por A549, A549-PACR, H358, H1299, H460, H292, T47D, y SNU -638 células) suplementado con 10% FBS inactivado por calor y antibióticos antimicóticos (PSF; 100 unidades /ml de penicilina G sodio, 100 g /ml de estreptomicina y 250 ng /ml de anfotericina B). Las células se incubaron a 37 ° C y 5% de CO
2 en un ambiente humidificado.
celulares Ensayos de proliferación
La proliferación celular se evaluó utilizando MTT ensayo colorimétrico a excepción de la selección preliminar de la actividad anti-proliferativa de
P
.
trifoliata
compuestos activos que se llevó a cabo mediante ensayo con SRB. Las células se sembraron a una densidad de 3 a 5 x 10
4 células por pocillo en placas de 96 pocillos con un volumen total de 200 l /pocillo y se les permitió volver a colocar durante la noche. Después de 24 h de incubación las células se trataron con varias concentraciones de 21α-MMD, H
2O
2, drogas, tan individual o en combinación, o el control de DMSO de forma continua a los cursos de tiempo indicados. Después del tratamiento, las células se fijaron con una solución de TCA al 10% y se sometieron a ensayos de SRB o MTT. Para el ensayo de MTT, las células se incubaron en MTT (0,5 mg /ml) que contiene medio de cultivo a 37 ° C durante 4 h. medio sobrenadante se eliminó y se añadió DMSO (200 l) a cada pocillo y se mezcla completamente para disolver MTT. Para el ensayo de SRB, las células se incubaron con solución de SRB al 0,4% durante 30 min. La SRB no unida se eliminó rápidamente por lavado de los pocillos cinco veces con ácido acético al 1% y después se secó al aire. se añadieron 100 l de tampón Tris (0,01 M, pH 10,4) y se agitaron suavemente durante 5 min en un agitador mecánico. Se midió la absorbancia a 570 nm para el ensayo MTT, mientras que 515 nm para el ensayo de SRB con común sustracción de fondo a 650 nm (cero días o replicar control) por lector de microplacas Versamax (Molecular Devices Inc., Toronto, Canadá). Los valores de absorbancia se expresaron como un porcentaje de la de células control sin tratar o DMSO, y la concentración de fármacos probados que se calculó por la fórmula% de viabilidad = ((Ave. Día Abs.Drug-Ave.Abs.Zero) /(Ave. Abs.Control-Ave. Día Abs.Zero)) x 100. el IC
50 valores se calcularon como la droga que inhibe la proliferación celular en un 50% comparado con los controles utilizando el análisis de regresión no lineal (por ciento de supervivencia frente a la concentración) . Todos los experimentos se realizaron con cuatro repeticiones y se repitieron al menos tres veces de una manera paralela en cada /concentración del compuesto de la droga.
formación de colonias de ensayo
monocapas de células fueron tratadas durante 20 h con 21α- MMD a varias concentraciones, y después se recogieron, se contaron y se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 1.500 células por pocillo. Después de una a una y media semanas, las colonias macroscópicas adherentes se lavaron con PBS, se fijaron con paraformaldehído al 2% y se tiñeron con violeta cristal (0,5% w /v) y después se contaron visualmente o utilizando software Image J.
Análisis de la combinación de fármacos
Las células se sembraron a una densidad de 5 x 10
4 células por pocillo en placas de 96 pocillos con concentraciones crecientes de 21α-MMD, paclitaxel, y 5-FU solo o en combinación en su relación molar equipotente de forma concomitante. actividad inhibidora del crecimiento de las combinaciones se midió mediante el ensayo de MTT. Los efectos combinados se analizaron mediante el método de análisis de la mediana del efecto y por el cálculo del índice de combinación (CI) usando la ecuación: CI = D
1 /(D
x)
1 + D
2 /(D
x)
2, donde D
1 y D
2 son las concentraciones del compuesto y farmacológico combinado que logró el efecto esperado, y (D
x)
1 y (D
x)
2 son las concentraciones que logran efectos similares cuando los compuestos se utilizan solos. 50% de inhibición fue elegido como el indicador de eficacia. entonces el CI calculado se comparó con los valores de referencia indicados [21].
Análisis y Ciclo Celular de incorporación de BrdU Ensayo
Análisis de los efectos de la 21α-MMD en la distribución del ciclo celular se realizó por el método descrito anteriormente [22]. Las células fueron tratadas con o sin 21α-MMD durante 24 h en 10% de medio suplementado con FBS. Se recogieron las células, se lavaron dos veces, y se fijaron en 70% durante la noche etanol frío a -20ºC. Se sedimentaron las células fijados con etanol, se lavaron con PBS enfriado en hielo, y se resuspendieron en solución de tinción que contiene /ml PI, 0.1% Triton-X-100, 0,1% de citrato de sodio 50 mg, y 100 mg /ml de RNasa. Después de 1 h de incubación a temperatura ambiente en la oscuridad, se clasificaron las células activadas por fluorescencia y el contenido de ADN celular se analizaron por citometría de flujo usando el citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.) equipado con un láser de argón y los datos se evaluaron usando el software CellQuest 3.0.1 (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Se usaron al menos 20.000 células para cada análisis. Los cambios en el porcentaje de la distribución de células en cada fase del ciclo celular se determinaron y los resultados se muestran como histogramas. A continuación, la proporción de células en diferentes fases del ciclo celular se registró con al menos por triplicado y se expresaron como media ± SD. Además, un ensayo de incorporación de BrdU colorimétrico (Abcam) se llevó a cabo para medir la tasa de síntesis de ADN. Brevemente, las células fueron tratadas con o sin 21α-MMD durante 24 h en el mismo medio que el anterior. BrdU se añade a las células cultivadas en microplacas seguido de 4 h de incubación para incorporar BrdU en el ADN de células en proliferación. El sobrenadante del cultivo se retiró seguido de la fijación. Las células fueron incubadas con un anticuerpo anti-BrdU conjugado con peroxidasa. BrdU unido se detecta mediante una reacción de sustrato y cuantificado por medición de la absorbancia a 350 nm.
Medición de ROS intracelulares
intracelular de ROS se midió por citometría de flujo (Becton Dickinson, FACSCalibur) como se describe anteriormente [ ,,,0],23]. Brevemente, las células se sembraron a una densidad de 1 x 10
4 células /ml en plato estéril 60 mm durante 24 h y se trataron con o sin 21α-MMD de 24 h para detectar cambios ROS. Las células se recogieron y se lavaron dos veces y se tiñeron con 1 ml de DCFH-DA en 10 concentración mu M, que se utilizó como sonda para evaluar la producción de ROS. Las células fueron incubadas a 37ºC durante 40 min y la longitud de onda de excitación de pico para oxidado DCFH-DA a 488 nm con la emisión a 525 nm se analizaron por citometría de flujo. la producción de ROS se expresó como la intensidad media de fluorescencia (MFI) calcula mediante el software Cell Quest. La detección de ROS también se examinó por microscopía de fluorescencia. Brevemente, las células se sembraron a la densidad de 5 x 10
4 células /ml en cubreobjetos de platos y se incubaron durante la noche para la fijación. Las células se trataron entonces con diferentes concentraciones de 21α-MMD o NAC, individualmente o en combinación, por 24 h a 37ºC. cubreobjetos fueron retirados de los platos y las células se tiñeron con 40 mM DCFH-DA durante 40 minutos. Las células se lavaron con PBS dos veces para eliminar el exceso de tinte. Los cubreobjetos se montaron en portaobjetos de vidrio y las imágenes fueron tomadas usando un microscopio de fluorescencia con un aumento de 200X.
Medición del potencial mitocondrial transmembrana (Δѱm)
Los cambios en el potencial mitocondrial se evaluaron utilizando el fluorescente TMRE colorante potenciométrico. El colorante lipófilo catiónico TMRE funciona mediante la introducción de la célula en forma de un éster, que posteriormente se hidroliza y se convierte en tetramethylrhodamine, que se acumula de forma reversible en la matriz mitocondrial con carga negativa dependiendo de potencial transmembrana mitocondrial que muestra la acumulación dependiente del potencial en la mitocondria. Para analizar la Δѱm después del tratamiento 21α-MMD, las células fueron crecimiento a una densidad de 1 x 10
5 células por pocillo durante 24 h en una placa de cultivo de 24 pocillos estériles tratadas con o sin 25 mM de 21α-MMD de 24 marido. Veinte minutos antes de la final del período de incubación, las células se lavaron con PBS y TMRE tinte a 100 nM se cargó durante 10 minutos a 37ºC. Las células se trataron con tripsina y se recogieron con PBS frío, seguido de la medición de la intensidad de fluorescencia por citometría de flujo (Becton Dickinson, FACSCalibur) y analizados mediante el software CellQuest 3.0.1.
migración celular y la invasión ensayos
los cambios en la migración de células se determinaron y transwell ensayos sin la incorporación de matrigel. Para el ensayo de migración transwell, se sembraron las células en las cámaras superiores de placas de 24 transwell con 200 l de medio de suero de hambre (sin FBS). Después del tratamiento con diversos agentes, las células se dejaron tiempo extra para migrar a las cámaras inferiores contenían medio 800 l con 10% de FBS para inducir la quimiotaxis. Las células migradas se visualizaron por tinción con violeta cristal (0,5% w /v) después de lavar con PBS y fijación con metanol. Las imágenes fueron tomadas y analizadas usando Juli FL microscopio ayudado con el software Image J. ensayo de invasión de la célula se realizó en placas Transwell de 24 pocillos con filtros de policarbonato (PVDF) (tamaño de poro 8 micras, Corning, EE.UU.). Matrigel se diluyó a 1 mg /ml con medio de cultivo libre de suero y se aplica sobre la pieza de inserción en las cámaras superiores de los múltiples pocillos para la placa de ensayo de invasión. Las células en la densidad de 2 x 10
4 células por pocillo se sembraron en la cámara superior de la unidad de transwell en 200 medio de cultivo libre de suero l. La cámara inferior de la unidad se añadió con 800 l medio de cultivo suplementado con FBS al 10% para la inducción de la quimiotaxis. Después de la incubación con o sin 21α-MMD (5 M; & lt; IC
50) durante 24 horas a 37ºC, el medio en la cámara superior fue succionado hacia fuera, y un bastoncillo de algodón se utilizó para eliminar las células en el lado superior de la membrana. Las células que invadieron a la cara inferior de la membrana se tiñeron con violeta cristal (0,5% w /v) y se visualizó y obtuvo bajo Juli FL microscopio. Todos los resultados se expresan como el porcentaje de células migradas o invadido en comparación con el control (células no tratadas).
Rodamina-123 (Rho-123) Acumulación Ensayo
Los cambios en la función de flujo de salida de P-gp en células A549-PACR se determinaron en paralelo a los cambios en la acumulación de colorante Rho-123. Las células fueron sembradas en 30 mm platos a una densidad de 1 x 10
5 células por placa. Las células se trataron previamente con diferentes concentraciones de 21α-MMD de 24 y 48 h. 0,5% de DMSO se usó como control. Después del pretratamiento, las células se incubaron con 1 mg /ml de Rho-123 tinte en medio de cultivo a 37ºC y 5% de CO
2 en la oscuridad durante 90 min. Después de la acumulación de Rho-123, las células se trataron con tripsina de la monocapa subconfluentes de células en placas de cultivo, y el sedimento celular se lavó dos veces con PBS enfriado en hielo. Las células se analizaron inmediatamente usando FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.) equipado con un láser de argón de 488 nm. La concentración de Rho-123 en cada muestra se determinó a partir de las mediciones de fluorescencia de la construcción de Rho-123 curva estándar. La concentración intracelular de Rho-123 se normalizó por la cantidad de proteína y se expresó como nmol /g de proteína. La fluorescencia verde de Rho-123 se midió usando un 530 nm filtro de paso de banda [24]. La función de flujo de salida de la P-gp se controló en cuanto a la disminución de la exportación de Rho-123 con la incorporación de las células A549 parentales utilizado como control negativo.
inmunocitoquímica
P-gp localización, se observaron inmunofluorescencia, y el ADN observación fluorescente en las células A549 /A549-PACR utilizando Zeiss LSM 780 ApoTome microscopio (Carl Zeiss, Jena, Alemania). Las células A549 /A549-PACR se chapada en 30 mm placas con toboganes y se incubaron durante la noche. Las células fueron pre-tratadas con varias concentraciones de 21α-MMD o medio libre de drogas durante 48 h. Todos los lavados se realizaron con PBS y todas las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente a menos que se especifique lo contrario. Las células se lavaron dos veces. Después de la incubación del tratamiento, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% (en PBS) durante 15 min y luego se bloquearon con 1% de BSA (en PBS) durante 1 h a temperatura ambiente, las células se incubaron con el anticuerpo primario de la glicoproteína P-a 4 ° C durante la noche, después se lavó dos veces adicionales. La permeabilización con Triton X-100 no se incluyó puesto que la proteína diana, P-gp, es una proteína transmembrana. Después de la incubación durante la noche, las células se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con FITC durante 2 h a temperatura ambiente. DAPI (0,5 mg /ml) se utilizó para contrateñir los núcleos y se almacenó a 4 ° C antes de la microscopía.
Proteína lisados, transferencia Western, inmunoprecipitación y
Las células se sembraron en placas de 100 mm estériles durante 24 o 48 h y se expusieron a varias concentraciones de 21α-MMD. Para determinar los niveles de expresión de proteínas diana, se prepararon extractos de células enteras. Tratadas o se lisaron las células no tratadas y las cuantificaciones de proteína se determinó usando el ensayo de Bradford [25]. Las proteínas se aislaron mediante tampón de lisis (Beyotime, China) [20 mmol /L Tris (pH 7,4), 250 nmol /L de NaCl, 2 mmol /L EDTA (pH 8,0), 0,1% de Triton X-100, 0,01 mg /ml de aprotinina , 0,005 g /ml de leupeptina, 0,4 mol /L de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, y 4 mmol /L Navo
4] seguido de la hilatura de los lisados a 14.000 rpm durante 10 min utilizando Thermo Sorvall Leyenda Micro 21R Centrifugadora refrigerada (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) para eliminar el material insoluble y se mide utilizando el espectrofotómetro Nanodrop 1000 (Thermo, EE.UU.). Las células se rompieron por sonicación y se extrajeron a 4ºC durante 30 min. Los homogeneizados se centrifugaron a 14.000 rpm durante 30 min para eliminar las mitocondrias y otros fragmentos insolubles y los sobrenadantes se centrifugaron de nuevo como anteriormente para asegurar la eliminación completa de las mitocondrias. Los sobrenadantes de lisados de células enteras se recogieron y se mantuvieron a -80ºC. La proteína total (100 g) en cada lisado celular se resolvió en varios porcentajes de geles emparejaron con los pesos moleculares de los objetivos de proteínas por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y se transfirió a membranas de electro-PVDF de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron con tampón de bloqueo (leche en polvo al 5% sin grasa en tamponada con fosfato salino-0,1% de Tween 20, PBST, pH 8,0) durante 2 h a temperatura ambiente y se incubaron adicionalmente con anticuerpos específicos diluido en TBST durante la noche a 4ºC . Después de lavar con TBST tres veces, las membranas se incubaron con peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con anticuerpos secundarios durante 1 h a temperatura ambiente. Visualización de los inmunocomplejos se realizó utilizando el PowerOpti-ECL-kit (Animal Genetics Inc., Corea) y un Imager LAS 4000 (Fuji Film Corp., Tokio, Japón).
La extracción de RNA y en tiempo real-Reverse Transcription-PCR
RT-PCR en tiempo real y RT-PCR se llevaron a cabo para evaluar MDR1 mRNA, ciclina e, y las expresiones de genes CDK2 de ARNm después de tratamiento con o sin 21α-MMD o siRNA como se indica. Las células a una densidad de 1 x 10
5 células /placa en placas de 100 mm fueron tratadas con 21α-MMD para diversos cursos de tiempo. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con PBS, y luego se lisaron con el reactivo TRI para la etapa inicial de ARN aislado. El ARN se extrajo mediante la adición de cloroformo, y el ARN aislado se precipitó con alcohol isopropílico. Los sedimentos de ARN se lavaron con 70% de etanol, se secó al aire, y después se disolvió en agua libre de nucleasa. La absorbancia se midió a 260 y 280 nm para determinar la concentración y pureza del ARN. El ARN total (1 a 2 g) se sometió a transcripción inversa utilizando AMV transcriptasa inversa y oligo (dT) 15 cebador inverso. Una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se llevó a cabo en una mezcla de reacción que contiene ADNc, mezcla de dNTP 0,2 mM, 10 pmol de cebadores específicos de la diana con secuencias que figuran los siguientes: MDR1 (adelante: 5'-3'-CCCATCATTGCAATAGCAGG; inverso: 5 ' -GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3 '), mTOR (adelante: 5'-3'-ACTCGCTTCTATGACCAACTGA; inversa: 5'-3'-TTGAAGGTCTCAAACATGAT), ciclina E (hacia adelante: 5'-3'-CGGGTCCACAGGATGCGAAGGA; inversa: 5'-CAGGTGTGGGGATCAGGGAGCA- 3 '), CDK2 (adelante: 5'-3'-CATTCCTCTTCCCCTCATCA; inversa: 5'-3'-CAGGGACTCCAAAAGCTCTG), y 0,25 U de Taq ADN polimerasa usando el sistema de PCR GeneAmp 2400 (Applied Biosystems, Foster, CA, EE.UU.) a amplificar el ADNc. El ciclo umbral se determinaron los valores (Ct). Los niveles de expresión relativos de ARNm se normalizaron a cualquiera de β-actina (adelante: 5'-3'-AGGCACCAGGGCGTGAT; inversa: 5'-3'-GCCCACATAGGAATCCTTCTGAC) o GAPDH (adelante: 5'-3'-ATCCCATCACCATCTTCCAG; inverso: 5 ' -CCATCACGCCACAGTTTCC-3 '), como se indica, dividiéndolo por los valores medios de Ct del control interno para esa muestra (Δ-Ct). Los niveles de transcripción normalizados se expresaron en relación a la muestra obtenida a partir del control de DMSO (ΔΔ - Ct), y el nivel de expresión de ARN relativo se presentó como 2-Δ-Ct [26]. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa 2%. El gel se tiñó con solución de tinción SYBR seguro de 10.000 veces diluido y se visualizó bajo un transiluminador UV (Alpha ImagerYM, Alpha Innotech Corp., EE.UU.). PCR en tiempo real se llevó a cabo utilizando un sistema de MiniOpticon (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.), utilizando 5 l de producto de transcripción inversa, 10 l de iQTMsupermix (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.), 0,5 l de cebadores y sondas en un volumen total de 20 mL. Se emplearon condiciones termociclador estándar de la siguiente manera: 95 ° C durante 5 min antes del primer ciclo, 95 ° C durante 10 s, 56ºC durante 30 segundos, se repite 40 veces