Extracto
Antecedentes
La activación de vías de señalización embrionarias en reposo en el páncreas adulto es una característica del cáncer pancreático (PC). Estos descubrimientos han conducido al desarrollo de nuevos inhibidores de vías tales como Notch y la señalización Hedgehog que están actualmente en ensayos clínicos de fase temprana en el tratamiento de varios tipos de cáncer. señalización retinoide es también esencial para el desarrollo de páncreas, y la terapia con retinoides se utiliza con éxito en otras enfermedades malignas como la leucemia, pero se sabe poco acerca de señalización retinoide en PC.
Metodología /Principales conclusiones
Hemos investigado el papel de los retinoides señalización
in vitro
y
in vivo Hoteles en páncreas normal, la lesión pancreática, la regeneración y el cáncer. señalización retinoide es activa en células ocasionales en el páncreas adulto, pero está marcadamente aumentada en todo el parénquima durante la lesión y regeneración. Ambos modelos de ratón inducidos químicamente y de ingeniería genética de exhibición de la PC a la falta de actividad de señalización retinoide en comparación con el páncreas normal. Como consecuencia, se investigó celular retinoide Binding Protein 1 (CRBP1), un regulador clave de la señalización de retinoide sabe que juega un papel en el desarrollo del cáncer de mama, como una diana terapéutica potencial. Pérdida, tratamiento o regulación a la baja significativa de CRBP1 estuvo presente en el 70% de PC humano, y fue evidente en las lesiones precursoras más tempranas (PanIN-1A). Sin embargo,
in vitro
ganancia y pérdida de función de los estudios y los ratones knockout CRBP1 sugieren que la pérdida de expresión CRBP1 por sí sola no era suficiente para inducir la carcinogénesis o para alterar la sensibilidad PC para terapias basadas retinoides.
Conclusiones /Importancia
en conclusión, la señalización retinoide parece desempeñar un papel en la regeneración pancreática y la carcinogénesis, pero a diferencia de cáncer de mama, no está mediada directamente por CRBP1
Visto:. Colvin EK, Susanto JM , Kench JG, Ong VN, Mawson A, Pinese M, et al. (2011) retinoide de señalización en cáncer de páncreas, lesiones y Regeneración. PLoS ONE 6 (12): e29075. doi: 10.1371 /journal.pone.0029075
Editor: G. Hidayatullah Munshi, Northwestern University, Estados Unidos de América
Recibido: 24 de octubre 2011; Aceptado: noviembre 20, 2011; Publicado: December 29, 2011
Derechos de Autor © 2011 Colvin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Instituto de cáncer de Nueva Gales del Sur (CINSW), el Nacional de Salud y Consejo de Investigación médica de Australia (# 427655), el Consejo de cáncer de Nueva Gales del Sur, Fundación Clínica de San Vicente, el Real Colegio australiano de Cirujanos, el australiano Fundación de Investigación del cáncer, la Fundación Avner Nahmani cáncer de páncreas, y la RT Salón de confianza. AVB, CJS, DKC, EAM y EKC son apoyados por becas de la CINSW (06 /RSA /1-05; 08 /RSA /1-15; 07 /MID /1-28; 09 /MID /2-40; 10 /CRF /1-01). SPI es un compañero Senior Principal de la NHMRC y titular de la Cátedra de Petre Breast Cancer Research. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
aumento de la evidencia apoya un papel fundamental para el desarrollo de vías de señalización Notch tales como [1] y el erizo [2], [3], [4] en el cáncer de páncreas, con inhibidores de estas vías actualmente en ensayos clínicos de fase temprana . Notch y hedgehog también están implicados en la lesión pancreática, la regeneración y la reparación [5], las condiciones que se sabe que predisponen al cáncer. señalización retinoide es vital para la formación de páncreas embrionario [6], [7], [8], pero se sabe poco sobre su posible papel en el cáncer de páncreas.
Los retinoides son de origen natural o de análogos sintéticos de la vitamina A, que tienen ha utilizado con éxito en el tratamiento de la leucemia promielocítica aguda (APL) [9]. A pesar del éxito de tratamiento con retinoides en APL, el tratamiento de tumores sólidos ha tenido un éxito limitado [10], [11], y alguna evidencia sugiere que esta resistencia a la terapia con retinoides puede ser debido a las aberraciones en la señalización de retinoide. Regulación a la baja de los receptores de retinoides se ha reportado en muchos tipos de cáncer, como el de mama, pulmón, próstata y cáncer de esófago [11], y regulación a la baja de los componentes aguas arriba implicadas en el metabolismo y almacenamiento de los retinoides están surgiendo como posibles reguladores clave de la carcinogénesis y colaboradores a la resistencia a retinoide Las terapias basadas
.
celular retinoide proteína de unión 1 (CRBP1) juega un papel importante en la señalización de la vitamina a y la regulación a la baja de la expresión se produce en CRBP1 de mama [12], de próstata [13], gástrico [14] y de ovario [15] tipos de cáncer. La pérdida de expresión CRBP1 en el epitelio de mama conduce a la pérdida de la diferenciación y la progresión del tumor mediante la interferencia con el almacenamiento de retinoides y su metabolismo en el metabolito activo, el ácido retinoico, produciendo una deficiencia retinoide localizada [16], con alteración de la capacidad de respuesta retinoide [17] y la transformación celular .
el cáncer de páncreas (CP) es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en las sociedades occidentales con una tasa de supervivencia global a 5 años de menos del 5% [18]. Los avances en los regímenes de quimioterapia neoadyuvante y adyuvante han dado lugar a una cierta mejora en los resultados, pero pancreatectomía sigue siendo la modalidad de tratamiento más eficaz para la PC, y ofrece la única posibilidad de curación. Sólo el 20% de los pacientes se presentan con enfermedad localizada, no metastásico, que es adecuado para la resección [19]. Los que se sometieron a resección y recibir terapia adyuvante tienen una supervivencia media de 12-22 meses y una supervivencia a 5 años del 20-25% [20]. Existentes terapias sistémicas son sólo moderadamente eficaces y la mediana de supervivencia para los pacientes con enfermedad metastásica permanece 6 meses. En consecuencia, existe una gran necesidad de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para el cáncer de páncreas.
Aquí identificamos un papel potencial para la señalización de retinoide en el cáncer de páncreas y la regeneración de páncreas y como consecuencia puede constituir un mecanismo objeto de orientación para el desarrollo de nuevos estrategias terapéuticas. La pérdida de CRBP1, un regulador clave de la señalización retinoide e importante en el cáncer de mama, aunque frecuente en PC, a diferencia de cáncer de mama no era en sí mismo suficiente para inducir la transformación.
Métodos
Ética Declaración
la aprobación ética para la experimentación animal se obtuvo del Comité de Ética Animal del Instituto Garvan (los números de homologación 09/53; 07/10). Multicéntrico aprobación ética se obtuvo de los Comités de Ética de Investigación Humanos de la Universidad de la enseñanza de los hospitales: Hospital Westmead, Hospital Concord, Royal Prince Alfred Hospital y Campus Hospital de St. Vincent de Sydney para la adquisición de tejido fresco y de archivo y registro de datos clínico-patológicas de los pacientes con la diagnóstico de cáncer de páncreas. Consentimiento informado, se obtuvo de todos los pacientes.
ratones RARO-lacZ ratones
RARO-LacZ contiene un transgén LacZ controlado por un elemento de respuesta al ácido retinoico (RARE). Las células con AR activa tinción positiva para la señalización de β-galactosidasa (β-gal). Los animales no tratados (n = 8) fueron sacrificados a las 10-12 semanas de edad y sus páncreas cosechadas para la tinción β-gal.
murino pancreatitis Modelo
Un ceruleına inducida modelo de pancreatitis crónica era utilizado similar a los modelos anteriores [21]. Los ratones (n = 16) fueron tratados con inyecciones repetidas intra-peritoneal de ceruleına (MP Biomedicals, Solon, OH) cinco veces al día, dos veces por semana durante 10 semanas. En este modelo se informa de la regeneración de las células acinares completa a producirse a las 6 semanas después de la interrupción del tratamiento ceruleına. Por lo tanto los ratones fueron sacrificados a las 0, 2, 4 y 6 semanas después del cese de las inyecciones caerulein y sus páncreas recogieron con el fin de investigar la señalización de RA en diversos puntos temporales durante el período de recuperación.
modelos murinos del cáncer pancreático
ratones RARO-LacZ (n = 10) de 10 semanas de edad fueron tratados con 7,12-dimetilbenzoantraceno (DMBA; Sigma-Aldrich, St Louis, MO), como se describe anteriormente [22]. Los ratones fueron sacrificados cuando se manifestaron signos de enfermedad o 9 meses de tratamiento y recogida de tejidos para la tinción β-gal post-DMBA.
LSL-Kras
G12D /+, LSL-Trp
53R172H /+ ratones, y Pdx1-Cre se obtuvieron a partir de los modelos de ratón de cáncer Consorcio humana en el Instituto Nacional del cáncer (Frederick, MD). Para generar tumores pancreáticos en el que la actividad de señalización RA se pudo evaluar los ratones RARO-LacZ se cruzaron con LSL-Kras
G12D /+; LSL-Trp
53R172H /+; ratones Pdx1-Cre para generar LSL-Kras
G12D /+; LSL-Trp
53R172H /+; Pdx1-Cre; RARO-LacZ descendencia (n = 8). ratones transgénicos cuádruples se quedaron con la edad hasta los tumores formados momento en el que fueron sacrificados y se recogieron los tejidos para la tinción β-gal.
tinción β-galactosidasa
se encera-des 4 micras secciones pancreáticas y rehidratadas antes se logró desenmascarar el uso de solución de recuperación de destino (S2367, pH 9,0: Dako Corporation, Carpenteria, CA) en un baño de agua hirviendo durante 20 minutos. La actividad peroxidasa endógena se inactivó con peróxido de hidrógeno al 3% en metanol. Las secciones se incubaron durante 1 hora con 1:50 anti-β-galactosidasa (AB616) anticuerpo policlonal de conejo (Abcam, Cambridge, UK). Un sistema de detección de anti-conejo marcado con peroxidasa de rábano picante polímero se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Envision + anti-conejo; DAKO Corporation, CA). 3,3'-diaminobencidina se utilizó como sustrato. Contra-tinción se realizó con hematoxilina de Mayer (Dako Corporation, Carpenteria, CA).
cohorte de pacientes
Se identificó una cohorte de 90 pacientes que fueron sometidos a resección pancreática o biopsia de estos hospitales. Esta cohorte representa un subconjunto de un grupo previamente descrita de 348 pacientes [23], [24].
CRBP1 inmunohistoquímica
pancreáticos tejido micro-arrays (4 micras secciones) fueron encerados de-y rehidrata antes de desenmascaramiento se logró utilizando solución objetivo de recuperación de (S1699, pH 6,0: DAKO Corporation, Carpenteria, CA) en una olla a presión durante 5 minutos. La actividad peroxidasa endógena se inactivó con peróxido de hidrógeno al 3% en metanol. Las secciones se incubaron durante 1 hora con anti-1:50 CRBP1 (FL-135) anticuerpo policlonal de conejo (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Un sistema de detección de anti-conejo marcado con peroxidasa de rábano picante polímero se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Envision + anti-conejo; DAKO Corporation, Carpenteria, CA). 3,3'-diaminobencidina se utilizó como sustrato. Counter-tinción se realizó con hematoxilina de Mayer (DAKO Corporation, Carpenteria, CA).
Hasta tres muestras separadas de páncreas fueron examinados por paciente. La tinción se evaluó por dos observadores independientes para cada caso (E.K.C. y S.A.O.). La normalización de la puntuación se logró mediante la comparación de las puntuaciones entre los observadores, y por conferencias, donde las discrepancias se resolvieron por consenso. Las puntuaciones se dan como un porcentaje de células con tinción citoplásmica positiva dentro del área representativa del tejido base de la micro-array, y la intensidad absoluta de tinción citoplásmica en una escala de 0 a 3 (0 representa la ausencia de tinción, 1 representa heterogéneo tinción citoplásmica, 2 en representación homogénea tinción citoplasmática, y 3 en representación de una intensa tinción citoplasmática homogénea). Una puntuación positiva para CRBP1 se dio sobre la base de los siguientes criterios:. & Gt; 50% de células que tienen homogénea tinción citoplásmica, con una intensidad de & gt; 1
El análisis de supervivencia se realizó mediante análisis de Kaplan-Meier, con diferencias en la supervivencia evaluado mediante la prueba de log-rank utilizando Statview 5.0 Software (Abacus Systems, Berkeley, CA):
líneas celulares pancreáticas
se utilizaron seis líneas celulares de cáncer de páncreas:. AsPC-1, BxPC -3, Capan-2, HPAC, MiaPaca2 y Panc1 (ATCC, VA, EE.UU.). Estas líneas celulares se cultivaron de acuerdo a los protocolos de ATCC. células pancreáticas humanas de epitelio ductal (HPDE y HPDE-EcoR) se utilizaron como un control normal (amablemente proporcionado por Ming-Sound-Tsao, Ontario Cancer Institute) y se cultivaron como se ha descrito anteriormente [25].
Western Blot
los extractos de proteínas se visualizaron utilizando 4-12% Bis-Tris geles prefabricados (Invitrogen, Victoria, Australia) y transferidos a membranas de PVDF de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los filtros se bloquearon con 5% de leche descremada en tampón TBST. anticuerpo anti-CRBP1 (FL-135) se utilizó a 1:500 durante la noche. Las membranas se incubaron con inmunoglobulina anti-G de conejo (IgG) conjugado con peroxidasa de rábano picante (1:2000) (Amersham, (GE Healthcare), NSW, Australia) durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido por el reactivo de quimioluminiscencia (Perkin Elmer, Waltham , MA).
extracción de RNA y la síntesis de ADNc
ARN a partir de líneas de células pancreáticas se extrajo utilizando Trizol® reactivo (Invitrogen, Victoria, Australia) según las instrucciones del fabricante. cDNA se sintetizó usando ABgene® Reverse-IT ™ RTase Blend (ABgene, Surrey, Reino Unido) con una mezcla de Oligo dT y hexámeros al azar utilizando el Método de síntesis de la primera cadena. Después de la desnaturalización del ARN a 70 ° C, la transcripción inversa (RT) las reacciones se realizaron en un motor de dyad ADN termociclador ™ (MJ Research, Waltham, MA) con el programa paso a paso de 25 ° C durante 10 minutos, 35 ° C durante 30 minutos, 47 ° C durante 45 minutos, luego 75 ° C durante 10 minutos.
cuantitativo PCR en tiempo real (qPCR)
TaqMan ® ensayos de expresión génica (Applied Biosystems, Victoria, Australia) de CRBP1 (Hs00161252_m1) se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. GAPDH (4326317E, TaqMan® control endógeno) se utilizó como control endógeno. reacciones TaqMan® qPCR se realizaron por triplicado utilizando el sistema ABI Prism 7900HT de detección de secuencias (Applied Biosystems, Victoria, Australia). Las curvas de calibración se incluyeron para asegurar que las reacciones se realizaron en el intervalo lineal y se utilizaron para ajustar la eficacia de la reacción. Las condiciones de los ciclos incluidos paso de desnaturalización a 95 ° C durante 4 minutos, seguido de 95 ° C (30 segundos) y 72 ° C (30 segundos) durante 60 ciclos.
Desmontables de CRBP1 en las células HPDE
Dos ARN corto horquilla (shRNA) Construye-revueltos siCRBP1 focalización CRBP1, siCRBP1-a y siCRBP1-B, así como un control mezclado,, (proporcionado amablemente por Nicoletta Sacchi, Roswell Park Cancer Institute, Nueva York) se transfectaron en células Phoenix utilizando reactivo de transfección FuGENE (Roche, NSW, Australia). sobrenadantes retrovirales se recogieron y se usaron para infectar células HPDE-EcoR. Puromicina (1 mg /ml) se utilizó para seleccionar las células infectadas con éxito. knockdown exitosa de CRBP1 se determinó mediante Western blot.
cultura 3D de células HPDE
células HPDE-EcoR infectado con shRNA fueron cultivadas en portaobjetos de cámara recubiertos con factor de crecimiento reducido Matrigel (BD Biosciences, San manguera, CA) en medio libre de suero de queratinocitos (Invitrogen, Victoria, Australia) suplementado con factor de crecimiento epidérmico, extracto de pituitaria bovina, suero de ternera fetal al 10% y 2% de Matrigel durante 20 días. El medio se cambió cada 4 días. estructuras 3D se recuperaron a los 3, 7, 10, 15 y 20 días usando solución de recuperación celular BD (BD Biosciences, San manguera, CA) y proteína extraída de western blot.
La transfección estable de células MiaPaca2
cuatro clones diferentes de células MiaPaca2 que expresan diferentes niveles de CRBP1 (MP2
células CRBP1) y sus respectivos controles fueron creados para evaluar el efecto de la expresión CRBP1 en células MiaPaca2. Las células fueron creados usando el pcDNA ™ 6.2 /GFP plásmido (Invitrogen, Victoria, Australia) y el plásmido pQCXIP (Clontech Laboratories, Montaña, Vista, CA) que contiene el gen CRBP1. Los vectores se transfectaron usando Amaxa Nucleofector® Tecnología (Lonza AG de Colonia, Colonia, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células transfectadas con pcDNA ™ plásmido 6.2 /GFP se clasificaron adicionalmente para la expresión de GFP mediante citometría de flujo para enriquecer la población de células que expresan GFP /CRBP1. La expresión de CRBP1 en cada población se confirmó por Western blot. Las células se trataron con 2, 5 o 10 mM de todo-
trans
-retinoico (ATRA; Sigma-Aldrich, St Louis, MA) en el Día 1. Las células se cosecharon y se contaron en el día 1, 2, 4 y 6 para medir la proliferación celular.
extracción de ADN
1 mm núcleos de tejido fueron retirados de muestras de PC humana incluidas en parafina fijadas en formalina y se extrajo el ADN usando el kit de tejido Gentra Puregene (Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante. ADN de líneas de células se extrajo usando un kit de extracción de ADN (Stratagene, Santa Clara, CA) según las instrucciones del fabricante.
tratamiento bisulfito
tratamiento bisulfito se llevó a cabo usando los métodos descritos anteriormente [ ,,,0],26] con modificaciones menores. En resumen, 1 g de ADN se desnaturalizó por tratamiento con NaOH 0,3 M y modificado con bisulfito de sodio 3 M durante 6 horas. ADN modificado se purificó utilizando QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA). tratamiento con bisulfito se terminó mediante la adición de 5,5 ml de NaOH 3 M, se precipitó con etanol, y se resuspendió en 50 ml de solución de ADN de hidratación (Tissue Kit Gentra Puregene, Qiagen, Valencia, CA).
metilación específica de PCR (MSP )
patrones de metilación del ADN en la isla CpG de CRBP1 en líneas de células pancreáticas humanas y muestras humanas se determinaron mediante MSP utilizando cebadores publicados anteriormente [26], [27]. Las amplificaciones por PCR se realizaron en 12,5 l de mezclas de reacción que contienen 1 a 5 l de ADN tratado con bisulfito, dNTPs (cada uno a 200 mM), cebadores (0,4 mM cada reacción), MgCl 1,5 mM
2, 0,75 unidad de ADN AmpliTaq Gold® polimerasa (Applied Biosystems, Victoria, Australia), y 1 × PCR Buffer II (Applied Biosystems, Victoria, Australia). MSP se llevó a cabo usando las siguientes condiciones: 95 ° C (30 segundos), 58 ° C (30 segundos), 72 ° C (30 segundos) durante 40 ciclos. Las condiciones de los ciclos incluyeron un paso inicial de desnaturalización a 95 ° C durante 10 minutos y elongación final a 72 ° C durante 10 minutos. Todos los productos de PCR se visualizaron utilizando 1,5% en gel de agarosa. cebadores MyoD [28] se utilizaron como control de la calidad del ADN tratado con bisulfito. Estos cebadores contienen secuencias CpG
5-Aza y TSA tratamiento
se trataron las células
MiaPaca2 de la siguiente manera:. (1) tratados en el día 1 con 300 mM de 5-aza-2'deoxycytidine (5-AZA) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) y se recogieron en el día 4; (2) tratados en el día 1 con 100 nM de tricostatina A (TSA) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) y se recogieron en el día 4; (3) trataron en los días 1 y 3 con TSA y se recogieron en el día 4; (4) tratados en el día 1 con 5-AZA, los días 2 y 3 con TSA y se cosecha en el día 4; (5) tratados en el día 1 con 5-AZA, Días 2, 3 y 5 con TSA y se recogieron en el día 6. Las células no tratadas y MiaPaca2 HPDE se utilizaron como controles. Durante el tratamiento, el medio se cambió cada día, y las células se lavaron dos veces con PBS frío antes de ácido y /o la extracción de proteínas nucleico.
Resultados
señalización retinoide en páncreas normal, lesión pancreática y la regeneración
retinoico elemento de respuesta ácido (RARE-LacZ) reportero ratones que marcan las células con retinoide activo de señalización [29] mostró que en el páncreas normal, la señalización retinoide activo se limita a los islotes de Langerhans y rara sola, o pequeños conglomerados de las células exocrinas acinares con una o centro-acinares basado en la ubicación y morfología (Figura 1). Repetida inyecciones intraperitoneales de la caerulein análogo de la colecistoquinina [30] induce pancreatitis crónica en ratones con cambios morfológicos tales como la pérdida de masa celular acinar y un aumento de la fibrosis pancreática similar a la observada en la condición humana. Para investigar la señalización de retinoide en la fijación de la lesión pancreática y la regeneración, se indujo la pancreatitis en ratones RARE-lacZ. Los ratones fueron tratados durante 10 semanas con inyecciones intraperitoneales de ceruleına, sacrificados tras el cese del tratamiento, o dejaron recuperar durante 2, 4 o 6 semanas. Ratones sacrificados inmediatamente después de la inyección final de caerulein (en el momento de la lesión aguda) tenía páncreas significativamente menor debido a la atrofia de las células acinares y fibrosis con la formación de "complejos tubulares", una manifestación de acinar a ductal metaplasia, los cambios morfológicos más tempranos asociados con la carcinogénesis pancreática (Figura 2A) [31], [32].
actividad de señalización AR en páncreas de ratones RARO-LacZ tratados con ceruleına (e), y la posterior recuperación durante 2 semanas (F) , 4 semanas (G) y 6 semanas (H). se observó aumento de la actividad de señalización retinoide en una proporción significativa de células acinares inmediatamente después del cese del tratamiento caerulein (E), con actividad retinoide alcanzando un máximo de 2 semanas (F), disminuyendo a las 4 semanas (G) y volviendo a niveles casi normales después de 6 semanas de recuperación (H).
a las 2 semanas siguientes al cese del tratamiento ceruleına, la regeneración exocrina había comenzado con un aumento en la masa de células acinares, pero con complejos tubulares residuales y un infiltrado inflamatorio persistente (Figura 2B ). A las 4 y 6 semanas, páncreas exocrino había cerca totalmente, pero no completamente regenerado, con unidades acinares ocasionales todavía exhiben Lumena ampliada y un infiltrado inflamatorio suave circundante (Figuras 2C y 2D). tinción de β-galactosidasa de páncreas de caerulein-ratones tratados RARE-LacZ demostró una mayor actividad de señalización retinoide en una gran proporción de las células acinares inmediatamente después del cese del tratamiento caerulein (Figura 2E). actividad retinoide alcanzó su punto máximo a las 2 semanas y disminuyó a las 4 semanas con niveles casi normales a las 6 semanas (Figuras 2F, G, H).
señalización retinoide en el cáncer de páncreas
Para determinar si la señalización en retinoide el páncreas se alteró durante la carcinogénesis se investigó la actividad de retinoides de señalización en inducida químicamente (DMBA) [22] y modelos de ratón genéticamente modificados de cáncer de páncreas [33]. DMBA ratones tratados RARE-lacZ desarrollados pobremente diferenciado, tumores sarcomatoides (Figura 3A) con una ausencia distinta de cualquier célula que exhibieron señalización retinoide activo a pesar de examen de múltiples secciones (Figura 3B). Páncreas promotor específico impulsada Cre recombinasa (Pdx1-Cre) expresión inducida de KRas activados y p53 mutante dentro del páncreas son actualmente el modelo murino de ingeniería genética más adecuada de cáncer de páncreas. Estos LSL-Kras
G12D /+ /LSL-Trp53
R172H /+ /Pdx1-Cre ratones desarrollan lesiones precursoras pancreáticas (PanIN) que el progreso de adenocarcinoma ductal pancreático altamente invasiva y metastásica en el momento de una mediana de 5 meses [33 ]. Estos ratones fueron cruzadas con ratones reportero lacZ-RARE para generar LSL-Kras
G12D /+ /LSL-Trp53
ratones R172H /+ /Pdx1-Cre /RARA-LacZ. Los tumores pancreáticos, que eran predominantemente moderadamente diferenciados y contenían abundante estroma desmoplásico formado en todos los ratones. Hubo una vez más una ausencia completa de actividad de señalización retinoide en estos tumores y en las lesiones precursoras a pesar de seccionamiento múltiple y evaluación por 2 observadores independientes, uno de los cuales era un patólogo especialista de páncreas (Figura 3D, E, F).
en los tumores de ratones tratados con DMBA RARE-lacZ, se observó una ausencia distinta de cualquier células que muestran la señalización de retinoide activo (B). En LSL-KrasG12D /+; LSL-Trp53R172H /+; Pdx1-Cre; tumores pancreáticos RARO-LacZ y lesiones precursoras, también había una ausencia completa de actividad retinoide señalización (D y F, respectivamente) guía empresas
la pérdida de expresión CRBP1 es un evento común y temprano en el cáncer de páncreas
celular retinoide Binding Protein 1 (CRBP1), se cree que un regulador clave de la señalización de la vitamina a para jugar un papel importante en la carcinogénesis de mama [16], [34]. Observaciones preliminares también identificaron regulación a la baja de los niveles de transcripción CRBP1 en PC [35] y PanIN [36]. Como consecuencia, se determinó la pérdida de CRBP1 como una posible causa de la disminución de la señalización de la vitamina A en el PC, y un papel en la carcinogénesis pancreática.
En una cohorte de 90 pacientes, inmunohistoquímica mostró regulación a la baja significativa de la expresión de la proteína en el 70 CRBP1 %, con pérdida completa de expresión en 50% de ellos (35% del total; Figura 4A, B, C, D). Pérdida, tratamiento o regulación a la baja de la expresión CRBP1 ocurrieron temprano en el desarrollo de PC y estuvo presente en el 100% de PanIN-1A y 1B lesiones de los pacientes que tenían una expresión aberrante dentro de su cáncer (Figura 4E, F). La pérdida de expresión CRBP1 también ocurrió en 50% de las lesiones tempranas precursoras (PanIN1A y 1B) asociados con pancreatitis crónica, un conocido factor de riesgo para PC. Ni la pérdida, ni regulación a la baja de la expresión se asoció con el resultado del paciente (log-rank
P = 0,3539
; Figura S1). Además, 4 de las 6 líneas celulares PC demostraron pérdida o regulación a la baja de la expresión CRBP1 (Figura 5A y B).
Restauración
(C) CRBP1 estado de metilación en líneas celulares de PC y (D) de CRBP1 expresión con el tratamiento de combinación de células MiaPaca2 con 5-Aza y TSA. (E) CRBP1 desmontables en las células transfectadas de forma estable HDPE-EcoR. (F) HPDE células cultivadas en 3D demuestran ningún cambio en la morfología entre las células siCRBP1 y revueltos control.
La pérdida de expresión CRBP1 se asocia con el promotor hipermetilación reversible
PCR específica de metilación (MSP ) y bisulfito de secuenciación genómica (BSG) identificó promotor hipermetilación CRBP1 en el 27,3% de las 33 muestras de PC humanos que carecen de expresión CRBP1 en contraste con 5 de 5 muestras de páncreas normales de la misma que no se metilado. CRBP1 hipermetilación del promotor se detectó en células MiaPaca2 (Figura 5C), y el tratamiento con el agente de desmetilación 5-AZA solo, o en combinación con el inhibidor de HDAC TSA, expresión inducida de CRBP1 mRNA (Figura 5D). La capacidad para revertir CRBP1 silenciar farmacológicamente presentó la oportunidad potencial de uso de retinoides y los inhibidores de HDAC como terapias de combinación para apuntar terapéuticamente CRBP1.
regulación a la baja de la expresión CRBP1 en líneas celulares y modelos de ratón
Para evaluar la papel de CRBP1 regulación a la baja en la carcinogénesis pancreática, inmortalizado las células pancreáticas humanas ductal epiteliales que expresan el receptor ecotrópico retroviral ratón (HPDE-EcoR) fueron transducidas con retrovirus con dos shRNA orientación construcciones CRBP1, así como un control revuelto. Las células fueron cultivadas en cultivo 3D durante 20 días. transferencia de Western demostró 50% desmontables de expresión CRBP1 (Figura 5E), sin embargo, no hubo diferencia discernible en la morfología en comparación con los controles (Figura 5F). Además, los páncreas de los ratones 12 meses de edad CRBP1 knockout [37] (proporcionado amablemente por el Prof. Pierre Chambon) no reveló diferencias morfológicas obvias en comparación con los ratones control (datos no mostrados).
sobreexpresión CRBP1 en células MiaPaca2
con el fin de examinar los efectos de la restauración de la expresión CRBP1, células MiaPaca2, que normalmente no expresan CRBP1 fueron transfectadas de forma estable para generar varios clones que expresan diferentes niveles de CRBP1 (baja, media, alta y muy alta) con ningún efecto sobre las tasas de proliferación en comparación con el control de vector vacío (Figura S2A) y no alteraron la sensibilidad a la terapia con retinoides cuando se tratan con todo-trans retinoico (ATRA) (figuras S2 B y S2C).
Discusión
el nuevo papel de las vías de señalización embrionarias disregulados como Notch y Hedgehog [4] está proporcionando oportunidades para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para el cáncer de páncreas. señalización retinoide es indispensable para el desarrollo embrionario normal, incluyendo la formación del páncreas nacientes [6], [7], [8]. Nuestros datos muestran que la actividad de señalización en el páncreas normal se restringe a los islotes pancreáticos y células raras en el páncreas exocrino, muchos de los cuales se parecían a células Centro-acinar, las células madre putativas del páncreas. Un estudio reciente identificó que las células en el páncreas que expresan la enzima RA-sintetizar, aldehído deshidrogenasa 1 (ALDH1), son células centroacinares que exhiben características de células progenitoras [38]. Este patrón de actividad es similar a la expresión del factor de transcripción Pdx1 que también se cree que marcar progenitor exocrina o "tallo" células. lecturas funcionales de
in vivo
actividad de señalización retinoide usando ratones reportero en nuestro estudio sugieren que la señalización aumentada juega un papel en la regeneración pancreática después de la lesión. señalización activo, normalmente restringido a determinados tipos de células se generaliza hasta la diferenciación de nuevo acinos exocrinas se ha completado. El tratamiento de ratones con dosis repetidas de resultados caerulein en un aumento dramático en las células ALDH1-positivo, que se supone que representa el aumento de señalización [38], más el apoyo a nuestros hallazgos retinoide.
señalización retinoide Desregulado se ha identificado en muchos tipos de cáncer [11], y aunque estudios previos han identificado la expresión aberrante de los componentes del retinoide de señalización, así como objetivos de abajo en PC [35], [39], [40], [41], [42], [43], poco se sabe sobre la actividad de señalización retinoide. La evaluación de la actividad del indicador de señalización retinoide tanto en el cáncer de páncreas inducido químicamente, y en modelos de ingeniería genética en nuestro estudio demostró una falta de señalización retinoide. Basándose en estas observaciones, la hipótesis de que la falta de señalización de ácido retinoico puede impedir la diferenciación normal en respuesta a estímulos cancerígenos y contribuir a la carcinogénesis pancreática, y que la restauración de la señalización de retinoide puede proporcionar una opción terapéutica.
Como en consecuencia, se investigó el papel de CRBP1, un componente clave de la señalización de la vitamina a, y se cree que juega un papel importante en la carcinogénesis de mama [16], [34]. Se identificaron pérdida o regulación a la baja de la expresión CRBP1 (lo que podría conferir pérdida de actividad de señalización retinoide) en el 70% de las muestras de cáncer de páncreas, con una alta proporción debido a la metilación del promotor. La pérdida o regulación a la baja de la expresión CRBP1 estaba presente en las lesiones precursoras más tempranos de PC, tanto en asociación con PC y en la pancreatitis crónica, un factor de riesgo para el desarrollo de PC. Sin embargo, desmontables de expresión CRBP1 en las células epiteliales ductales pancreáticas inmortalizadas no indujo la transformación. Del mismo modo, los ratones knockout CRBP1 no demostraron un fenotipo de páncreas en más de 12 meses de edad. Además, la reintroducción de CRBP1 en células PC deficientes en CRBP1 no alteró la insensibilidad a la terapia con retinoides. Es importante destacar que los datos recientes sugieren que las células estrelladas pancreáticas pueden jugar un papel clave en la señalización de la vitamina A y la resistencia a la terapia con retinoides
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[44]. Esto debe ser tenido en cuenta, especialmente en lo que los datos aquí presentados se centraron en el componente epitelial de páncreas.
En resumen, la lesión pancreática induce actividad de señalización retinoide dentro del páncreas, que está muy extendida durante la lesión y regeneración y puede desempeñar un papel importante en este proceso.