Extracto
Objetivos
El objetivo fue investigar el valor pronóstico de los pacientes RRM1 en GC.
Métodos
Un total de 389 pacientes evaluables GC con la información clínico-patológica y la supervivencia se inscribieron desde la Ciudad de la esperanza (COH, n = 67) y la Universidad de Zhejiang (ZJU, n = 322). expresión de la proteína RRM1 se determinó por inmunohistoquímica en muestras de tejido FFPE. Los análisis de Kaplan-Meier y Cox se utilizaron para medir la supervivencia. la actividad y la invasión ensayos de Ras /Raf se utilizaron para evaluar el papel de RRM1 en líneas celulares de GC.
Resultados
in vitro
experimentos demostraron RRM1 activa Ras /Raf /MAPK transducción de señales y la proliferación celular GC promovido. Mientras tanto, la expresión RRM1 se asoció significativamente con el compromiso de los ganglios linfáticos, tamaño del tumor, la expresión de Ki67, subtipo histológico y el grado histológico de las muestras de tejido GC (
p Hotel & lt; 0,05). El análisis de Kaplan-Meier ilustra que la expresión de alto RRM1 predijo pobre supervivencia en pacientes con cáncer gástrico en el COH y cohortes ZJU (log-rank
p Hotel & lt; 0,01). En el análisis multivariante de Cox, los índices de riesgo de RRM1 para la supervivencia global fueron 2,55 (IC del 95% 1.27 a 5.15) y 1,51 (IC del 95% 1.7 a 2.13) en el COH y ZJU establece, respectivamente. En particular, RRM1 predijo específicamente los resultados de los GC avanzada con pobre diferenciación y alta capacidad proliferativa. Además, la inhibición de RRM1 por siRNA redujo significativamente la piscina dNTP, Ras /Raf y MMP-9 actividades y los niveles de p-MEK, p-ERK y NF-kappa B, dando como resultado el retraso del crecimiento y la reducción de la invasión en AGS y NCI-N87 las células.
Conclusiones
sobreexpresión RRM1 predice pobre supervivencia en pacientes con cáncer gástrico en etapa avanzada TNM. RRM1 podría servir como biomarcador pronóstico y diana terapéutica para los GC
Visto:. Wang Q, Liu X, Zhou J, Huang Y, Zhang S, Shen, J., et al. (2013) La ribonucleótido reductasa subunidad grande M1 predice la supervivencia de los pobres debido a la modulación de la proliferativa y la capacidad invasiva de cáncer gástrico. PLoS ONE 8 (7): e70191. doi: 10.1371 /journal.pone.0070191
Editor: Hiromu Suzuki, de la Universidad Médica de Sapporo, Japón
Recibido: April 9, 2013; Aceptado: 15 de Junio de 2013; Publicado: July 29, 2013
Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue parcialmente apoyado por los Institutos nacionales de Salud (NIH) subvenciones (R01, CA127541), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (SNCF) 81101659 /H1609, Naturaleza Fundación de Ciencias de la provincia de Zhejiang, China (NSFZ) Y2110073. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el adenocarcinoma gástrico (cáncer gástrico, GC) es la segunda causa principal de mortalidad asociada al cáncer en todo el mundo, especialmente en los países asiáticos y en desarrollo, donde aproximadamente un millón de casos se diagnostican cada año [1] - [2]. La mortalidad más alta (28,1 por 100.000 hombres, 13,0 por 100.000 mujeres) del GC se ha informado en el Este de Asia, que incluye a China, Japón y Corea [2]. modalidades de tratamiento convencionales, incluyendo la cirugía, quimioterapia y radioterapia, han demostrado un beneficio de supervivencia para los pacientes con cáncer gástrico [3] - [6]. Sin embargo, la tasa de supervivencia a 5 años sigue siendo decepcionante, y la mayoría de los pacientes mueren de GC complicaciones de la enfermedad y la recaída [3], [7] - [8]. Varios biomarcadores están siendo investigados con el objetivo de predecir la supervivencia y mejorar los resultados en pacientes con GC [9]. Hasta ahora, pocos de los biomarcadores son ampliamente utilizados clínicamente para GC.
La ribonucleótido reductasa (RNR) se considera una diana terapéutica para el tratamiento del cáncer. RNR es una enzima de tiempo limitado que cataliza la conversión de difosfatos de ribonucleósido de desoxirribonucleósido difosfatos a través de
de novo
metabolismo de los nucleótidos endógenos [10]. inhibidores de RNR, tales como hidroxiurea, han sido ampliamente utilizados para tratar la leucemia y tumores sólidos [11] - [13]. Sin embargo, la aplicación de los inhibidores de RNR se ha limitado debido a la baja eficacia, resistencia a los fármacos y efectos secundarios [14]. La mayoría de las limitaciones de los inhibidores de RNR son causados por la orientación no específica. RNR humana se compone de tres subunidades, la subunidad grande M1 (RRM1) y dos pequeñas subunidades M2 y M2B. Cada subunidad pequeña puede complejo con RRM1 para formar una holoenzima activa [10]. nivel M2 predice un mal pronóstico en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de pulmón, cáncer de páncreas y GC [15] - [18]. M2B parece jugar un papel en la supresión de tumores malignos y se asocia con una mejor supervivencia en los cánceres colorrectales, de acuerdo con nuestra investigación anterior [19] - [20]. Sin embargo, las funciones biológicas de RRM1 no son idénticos entre estos tipos de cáncer. Hemos investigado los niveles de mRNA de RRM1 en el cáncer y las correspondientes secciones de tejidos normales usando la base de datos Oncomine (www.oncomine.com). En condiciones seleccionadas (
p Hotel & lt; 0,05, doble cambio & gt; 2, el rango gen = 10% superior, todos los tipos de datos), el ARNm RRM1 fue hasta reguladas en 39 análisis únicos y abajo-regulada en 11 únicas análisis. RRM1 aumentó principalmente en las secciones de vejiga, cervical, colorectal, de cabeza y cuello, cáncer de hígado y pulmón, así como el melanoma y el sarcoma. Mientras tanto, RRM1 se había reducido regulado en el cáncer de mama, leucemia y linfoma. La subunidad de mamífero RNR R1 (similar a RRM1 en humanos) desempeña un papel en la supresión malignidad mediante la inactivación de la vía de señalización /Raf /MAPK Ras en Ras-transformado células 3T3 (ratones) [21] - [22]. Otros estudios de resultados han demostrado que la expresión de alto RRM1 (junto con ERCC1 o PTEN regulación) es un factor determinante de la supervivencia óptima en el cáncer de pulmón no microcítico en estadio temprano (CPNM) [23] - [26]; Sin embargo, otros estudios han mostrado resultados aparentemente conflictivos [27] - [29]. RRM1 sobreexpresión se relaciona con la resistencia a la gemcitabina en NSCLC y cáncer de páncreas, lo que resulta en un mal resultado [30]. Estos estudios indican que el papel de RRM1 en el cáncer sigue siendo controvertido, incluso en el mismo tipo de cáncer en diferentes etapas o bajo diferentes terapias [31] - [32]. RRM1 se ha sugerido que tienen otras funciones biológicas además de formar holoenzimas RNR para convertir NDP a dNDP, lo que podría explicar en parte la baja eficacia de los inhibidores de RNR en el tratamiento del cáncer. Por lo tanto, ampliamente investigar los papeles de RRM1 sería útil en el desarrollo de nuevos inhibidores de RNR para tratar el cáncer en particular. GC es uno de mayoría de los cánceres comunes en el mundo, pero los inhibidores de RNR, tales como la hidroxiurea y gemcitabina, no se han utilizado comúnmente debido a su baja eficacia. Por otro lado, el impacto de RRM1 en el resultado GC nunca se ha examinado. Por lo tanto, sería valioso para explorar el papel biológico de RRM1 en células de GC y evaluar el significado clínico de RRM1 sobreexpresión en pacientes GC
. En este estudio, los papeles de RRM1 en la regulación de la proliferación celular y la invasión a través de la Ras /Raf vía de señalización en las líneas celulares de GC fueron investigados. Mientras tanto, también se determinó la expresión de proteínas RRM1 y el resultado de 67 pacientes GC de City of Hope National Medical Center (COH). Los resultados fueron validados en 322 pacientes con cáncer gástrico desde el Run Run Shaw Hospital Afiliado señor de la Universidad de Zhejiang (ZJU). Nuestros hallazgos sugieren que predice la supervivencia RRM1 pobres en GC y podría servir como un biomarcador pronóstico y diana terapéutica en pacientes con cáncer gástrico.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
El protocolo de este estudio fue revisado y aprobado por la junta de revisión institucional (IRB) de la Ciudad de la esperanza Centro Nacional de Medicina y la Universidad de Zhejiang, respectivamente. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes incluidos en este estudio. Las muestras de GC elegibles se obtuvieron de City of Hope Centro Nacional de Medicina (conjunto COH) y el Run Run Shaw Hospital Afiliado Sir, Universidad de Zhejiang (conjunto ZJU), respectivamente.
Pacientes
Los criterios de inclusión para que los participantes se incluye lo siguiente: (i) adenocarcinoma gástrico con un diagnóstico patológico; (Ii) el consentimiento informado o renuncia de consentimiento proporcionada por el paciente; y (iii) el seguimiento de la información disponible. Se excluyeron los pacientes con GC (i) falta de consentimiento informado; (Ii) no adenocarcinoma o múltiples tipos de cáncer; (Iii) ninguna de las muestras de tejido obtenidas; (Iv) la pérdida de contacto después de la cirugía; o (v) GC estadio IV sin cirugía paliativa. El conjunto COH incluyó una serie de 67 pacientes con cáncer gástrico elegibles que recibieron cirugía con R0 (58 casos), R1 (8 casos) o R2 (1 caso) la resección en la ciudad, del Centro Médico Nacional de la Esperanza a partir de enero de 1989 a diciembre de 2006. Los participantes en el el conjunto COH constaba de 51 blancos, 2 afroamericanos y los asiáticos 14. En el conjunto ZJU, se reclutaron 322 pacientes elegibles GC (242 casos con resección R0, 67 casos con resección R1 y R2 con 13 casos de resección). Se obtuvieron su operación quirúrgica durante los años 1997 a 2001. Todos los pacientes GC en el conjunto ZJU eran asiáticos (China). En el conjunto ZJU, 153 de 322 pacientes tenían después de la cirugía la quimioterapia adyuvante. Los regímenes de quimioterapia de combinación incluyen ácido folínico, 5-fluorouracilo y oxaliplatino (FOLFOX6; 73 casos); epirubicina, oxaliplatino y capecitabina (EOX; 12 casos); 5-fluorouracilo, mitomicina C y epidoxorubicina (FEM; 9 casos); etopósido, leucovorina y 5-fluorouracilo (ELF; 38 casos); mitomicina C y 5-fluorouracilo (MF; 4 casos); y otros (por vía oral S-1 /x, basada en docetaxel y otros protocolos; 17 casos). Todos los pacientes fueron seguidos hasta enero de 2012. Se actualizaron los detalles de la información demográfica y clínico-patológica. Los datos por etapas TNM para los participantes se obtuvieron a partir de los diagnósticos clínicos y patológicos y determinan de acuerdo con las guías de la NCCN para GC (Version 2, 2011). Las muestras de tejidos humanos examinados en este estudio se obtuvieron de la cirugía y se almacenan a temperatura ambiente después de fijado en formol y paraffinization. resultado de la correlación que se muestra el tiempo de almacenamiento no afectó la expresión RRM1 en la significación estadística (
p Hotel & gt; 0,05).
Diseño del estudio
Este fue un estudio retrospectivo de los resultados. El tamaño de la muestra se calculó utilizando nQuery Asesor 6,01 (Statistical Solutions Ltd, Saugus, MA, EE.UU.) de software. Sobre la base de este cálculo, un tamaño de muestra de 300 participantes alcance el 95% de la potencia del estudio (dos caras α = 0,05). La información demográfica y clínico-patológico se extrajeron mediante revisión de las historias cuidado. Todos los pacientes fueron seguidos periódicamente para datos de supervivencia; pacientes con operaciones curativas también fueron seguidos por la supervivencia libre de recidiva. El período de seguimiento se calculó a partir de la fecha de la cirugía a la fecha del último contacto. La supervivencia libre de enfermedad se definió como el tiempo desde la cirugía inicial para la recurrencia del tumor. Metástasis o recidiva local fue considerado evidencia de recidiva tumoral. Sólo las muertes por GC se consideró el punto final de la supervivencia específica de la enfermedad. Las variables evaluadas incluyeron la fecha de nacimiento, sexo, fecha de diagnóstico, la fecha y el tipo de operación, tipo de quimioterapia, el estadio TNM, la recaída /estado de la metástasis, la fecha de la recaída /metástasis y el estado clínico en el último seguimiento.
se utilizó inmunohistoquímica (IHC) para determinar la expresión de proteínas en RRM1, (FFPE) muestras de tejidos humanos incluidos en parafina fijado en formol. Para evitar sesgos sistémicos, los anticuerpos fueron validados, y las condiciones de IHC se optimizaron utilizando un tablero de tejido de control. Para normalizar las condiciones de reacción, todas las muestras de tejido FFPE del conjunto ZJU se vuelven a montar en múltiples arrays de tejido. Además, una placa de múltiples tejidos de control FFPE se incluyó para cada tinción IHC. Para reducir el sesgo de lectura de imágenes, se empleó un sistema automatizado de imágenes para obtener imágenes digitales de las secciones teñidas para análisis cuantitativos posteriores. Cada muestra fue evaluada por dos investigadores independientes en forma de doble ciego.
Todos los datos demográficos, información clínico-patológica, y los resultados de IHC fueron codificados y entró en una base de datos de GC. Doble entrada de datos y la lógica de los controles se utilizaron para la reducción de errores. Microsoft Office Access ® se utiliza para crear las bases de datos. Los casos que faltan se marcaron con el "perdido" código apropiado. JMP 8,0 Software (SAS Institute, Cary, NC, EE.UU.) y GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc, La Jolla, CA, EE.UU.) se utilizó para el análisis estadístico y la trama curva de supervivencia. modelos de regresión logística multivariante se utilizan para ajustar los efectos de covarianza en el odds ratio (OR). El análisis de Kaplan-Meier y un modelo de riesgos proporcionales de Cox se aplicaron para la supervivencia global (SG) y la supervivencia libre de progresión (SLP) analiza. Los análisis multivariados y la estratificación se aplica para reducir el impacto de los efectos de confusión en la estimación de los coeficientes de riesgo (HR).
cuantitativos IHC Ensayos
IHC se utilizó para investigar la expresión de proteínas RRM1. La precisión de IHC fue validado por RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR) en dos muestras paralelas. En resumen, después de deparaffinization, la actividad de la peroxidasa endógena fue bloqueada con H
2O
2 (peróxido de hidrógeno) 3%. Las diapositivas de la matriz se incubaron después con suero normal de cabra durante 20 minutos, y luego el anticuerpo primario se aplicó durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de 7 minutos de H
2O
2 de tratamiento, las diapositivas de la matriz se incubaron con los anticuerpos correspondientes marcados con peroxidasa de rábano durante 30 minutos. DAB (3,3 '-Diaminobencidina; 0,05 g DAB y 100 ml de 30% de H
2O
2 en 100 ml de PBS) se aplicó durante 5 minutos y otra vez durante 10 minutos. A continuación, cada diapositiva se contraste con hematoxilina (Dako). PBS se utilizó como control negativo.
Los anticuerpos
Un anticuerpo monoclonal de ratón producido en el comercio se utilizó contra RRM1 humano en este estudio. La producción de anticuerpos RRM1 se basa en nuestro protocolo estándar anterior [33]. hibridomas productores de anticuerpos Anti-hRRM1 se primaria rastrearon mediante ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Los clones fueron elegidos en base a sus actividades en los tejidos humanos incluidos en parafina. RRM1 expresión se cuantificó mediante un sistema de clasificación visual basado en el grado de tinción. Se evaluó la inmunorreactividad Tanto en el núcleo y el citoplasma. Cada imagen se obtuvo sobre la base de las siguientes categorías: la localización subcelular (por ejemplo, el citoplasma vs. núcleo), intensidad de la tinción (por ejemplo, densidad óptica integrada), y /o el porcentaje de células teñidas (por ejemplo, la superficie total o el porcentaje de células positivas). Sobre la base de la intensidad de la señal, la expresión RRM1 se clasificó como negativo (0), débilmente positivo (1), positivo (2) o fuertemente positiva (3). Una puntuación RRM1 de 0 ó 1 fue designado RRM1-baja, y una puntuación de 2 o 3 se clasificó como RRM1-alta. Debido a que nuestros datos mostraron resultados consistentes entre RRM1 citoplasmática y nuclear RRM1, hemos considerado ya sea un alto nuclear o una puntuación más alta frente al citoplasma como análisis RRM1-alta en el método de Kaplan-Meier y Cox.
Los anticuerpos contra p-MEK, p -ERK, NF-kB, Ras, Sp-1 y Ki67 se obtuvieron de Cell Signaling Technology, Santa Cruz, Invitrogen, Millipore, Abcam y BD Bioscience, respectivamente.
Construcción del plásmido y transfección
El plásmido hRRM1 (pEBG-RRM1) se construyó y se informó en nuestro estudio anterior [34]. El plásmido se transfectó con X-treme GENE HP reactivo de transfección de ADN (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante para las células AGS. Brevemente, 2 g de plásmido se mezclaron con 6 l X-treme GENE HP en 200 medio libre de suero l después de la incubación a temperatura ambiente durante 15 minutos. La mezcla se añadió a 2 × 10
5 pre-chapado en células AGS en una placa de 6 pocillos. Después de la transfección durante 48 horas, se recogieron las células.
Cultivo de células y la interferencia de ARN
El GC humano líneas de células AGS y NCI-N87 se obtuvieron de American Type Culture Collection y se cultivaron en F- medio 12K (AGS) o medio RPMI-1640 (NCI-N87) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) suplementado con 10% de suero fetal bovino (MP Biomedicals, Costa Mesa, CA, EE.UU.) y 1% de penicilina y estreptomicina en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2 a 37 ° C.
RRM1 siRNA (SC-37640) y scramble siRNA (SC-44233) fueron adquiridos de Santa Cruz Biotechnology Inc. Las transfecciones se llevaron a cabo con Lipofectamine ™ RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante.
in vitro Ensayo de proliferación
Un
in vitro
ensayo de proliferación se llevó a cabo de acuerdo con nuestro estudio anterior [15]. En pocas palabras, 0,5 × 10
4 AGS y 2.0 × 10
4 células NCI-N87 fueron pre-sembraron en pocillos de un dispositivo de 16 pocillos compatibles con un tiempo real de detección electrónica de células W200 (RT-CES) Analizador y 16 × estación (ACEA Biosciences, San Diego, CA, EE.UU.). El "índice de celda" (impedancia normalizada) se calculó periódicamente (típicamente, cada 30 minutos) de acuerdo con el crecimiento de células en cada pocillo. A menos que se indique lo contrario, se realizaron cuatro repeticiones para cada grupo de tratamiento siRNA. RRM1 inhibición se midió por el Western Blot.
in vitro
Invasión Ensayo
cámaras de invasión de Matrigel se compraron de BD Biosciences (Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.). En primer lugar, una membrana de policarbonato de 8 mm de porosidad se cubrió con 1 ml de medio libre de suero que contenía 1 × 10
5 células por pocillo. Las placas se incubaron a continuación con una quimio-atrayente (20% de medio FBS) durante 24 horas a 37 ° C en un 5% CO
2 incubadora. Después se retiró el medio, y las células no invasoras se raspó suavemente con un raspador de células. El filtro se lavó dos veces con PBS y se tiñeron con 0,5% de azul de metileno durante 4 horas. Las células que pasan a través del filtro y se adhiere a la superficie inferior se contaron mediante microscopía óptica.
Gelatina Zymography
Un ensayo de gelatina zymography se realizó para investigar la influencia de RRM1 sobre la secreción de activos MMP-9. Brevemente, las células fueron cultivadas a 70% de confluencia, se lavaron dos veces con 1 x PBS, y se incubaron en medio libre de suero. Después de 24 horas, se recogió el medio acondicionado y se concentró con un filtro centrífugo (Millipore, MA, EE.UU.) con 6000 g durante 15 minutos. muestras concentradas se prepararon de la no-reducción de tampón de muestra (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Las proteínas (20 l /carril) se separaron usando SDS-PAGE en geles que contienen 1 mg /ml de gelatina (Novex 10% de gelatina Gel, Invitrogen). Los geles se renaturalizaron durante 1 hora a temperatura ambiente en 1 x tampón de renaturalización (Invitrogen). A continuación, los geles se incubaron durante la noche a 37 ° C en 1 x tampón de desarrollo (Invitrogen). El gel se tiñó con azul de Coomassie. El brillo de las bandas claras, donde se ubicaba MMP9 y la gelatina se degrada, se analizaron mediante densitometría.
Ras Ensayo de actividad
actividad
Ras se midió utilizando un kit de Ras Ensayo de actividad (Millipore, MA, EE.UU.). En primer lugar, Ras activa (unida a GTP Ras) se une al dominio de unión Raf-1-Ras (RBD) conjugado a perlas de agarosa mediante la incubación de lisados de células a 4 ° C durante 45 minutos. A continuación, la Ras activada se libera en el tampón de muestra SDS-PAGE después de un lavado extensivo de las perlas de agarosa (tres veces) con tampón de lavado (HEPES 25 mM (pH 7,5), mM MgCl 10
2, NaCl 150 mM, 1 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, mM Na 1
3Vo
4, 10% de glicerol, 10 mg /ml de leupeptina, 10 mg /ml de aprotinina y NaF 25 mM). Se detectó la cantidad de Ras con anticuerpo pan-Ras monoclonal.
Medición de la piscina dNTP
Este ensayo se realizó de acuerdo con el método de Sherman y Fyfe [35]. El volumen total de reacción fue de 50 mL. La mezcla de reacción contenía MgCl 10 mM
2, 0,25 M de plantilla /cebador, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), DTT 5 mM, 1,25 mM [
3H] dATP (para el dCTP, dGTP, y dTTP ensayo) o [
3H] dTTP (para el ensayo de dATP) y 0,2 unidades de Sequenase (2.0). La mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos, y luego se detuvo la reacción en hielo. Después de la reacción, 40-mu l alícuotas fueron retirados y manchas en redonda (diámetro 2,4 cm) papeles Whatman DE81 de intercambio iónico. Los papeles se secaron, se lavó (3 x 10 minutos) con 5% Na
2HPO
4, y se lavaron una vez con agua destilada y una vez más con 95% de etanol. Cada papel se secó y se deposita en un tubo de ensayo pequeño; 7 ml de Ecolume continuación, se añadió a cada tubo. Un contador de centelleo líquido (Beckman Coulter, Inc. Brea, CA, EE.UU.) se utilizó para contar los dNTPs marcados con tritio. Las muestras estándar fueron 0,25, 0,5, 0,75 y 1,0 pmol.
Resultados
Validación de la especificidad de los anticuerpos RRM1 en las muestras de adenocarcinoma gástrico
La especificidad de la RRM1 anticuerpos fue validado mediante un ensayo de bloqueo péptido. Se diluyeron los anticuerpos (1:1000), pre-incubadas con el péptido RRM1 recombinante (1 mg /ml) a 4 ° C durante la noche, y luego se visualizaron mediante análisis Western. En la Fig. 1
A una señal dominante de un anticuerpo RRM1 elegibles
, podría ser visto por Western blot y se disminuyó con la caída RRM1 en células AGS. Mientras tanto, la señal fue bloqueada específicamente por el péptido RRM1 recombinante, lo que indica la especificidad de los anticuerpos RRM1.
Un
. ensayo de bloqueo de péptidos se llevó a cabo en los anticuerpos RRM1 para la tinción IHC, todos los anticuerpos estaban en dilución 1:1000 y se incubaron con el péptido RRM1 recombinante (1 mg /ml) a 4 ° durante la noche. Anticuerpo#2 mostró señal más específica y más fuerte que otros anticuerpos (datos no muestran), por lo que la utilizaron como anticuerpo para la tinción IHC.
B Opiniones. fraccionamiento nuclear se emplea en las células AGS. células AGS se mueren de inanición durante 96 horas y volver a complementaron con medio de crecimiento normal durante 12 horas. Entonces se recogieron las células y fraccionado para la proteína nuclear. Western blot se aplicó a revelar la localización subcelular de RRM1, GAPDH y Sp-1 fueron utilizados como marcadores citoplásmicos y nucleares.
C
. Translocación de RRM1 del citoplasma al núcleo fue observada por citoquímica de inmunofluorescencia. células AGS se mueren de inanición durante 48 horas y volver a complementaron con medio de crecimiento normal durante 12 horas. A continuación, las células se fijaron y se incubaron con anticuerpos primarios y secundarios. se observó la translocación de RRM1 bajo microscopía de fluorescencia.
D
. RRM1 se expresó de forma heterogénea entre los subtipos adyacentes de tejido normal y histológicas (JGCA clasificación v.2011), incluyendo papilar, tubular, mucinoso y de células en anillo de sello y el adenocarcinoma indiferenciado.
Debido a los diferentes patrones de expresión de RRM1 se han reportado , se procedió a investigar la localización de RRM1. En las células normales, RRM1 se expresa predominantemente en el citoplasma (Fig. 1
B Opiniones). Un ensayo de fluorescencia de etiquetado también confirmó que la proteína RRM1 acumula en el citoplasma después de 48 horas de privación de suero. Sin embargo, RRM1 transloca en el núcleo en respuesta a suero re-suplementación durante 12 horas (Fig. 1
C
). Por lo tanto, tomamos tanto citoplasma y tinción nuclear de RRM1 en cuenta en la interpretación de la tinción IHC.
RRM1 se expresó de forma heterogénea entre los subtipos de tejido GC (Fig. 1
C
). RRM1 se expresa preferentemente en el tejido canceroso (47,0% RRM1-alta) en los tejidos normales adyacentes de muestras de GC (25,4% RRM1-alta). Según la clasificación JGCA [36], adenocarcinoma gástrico se clasificó en cinco subtipos histológicos. RRM1 fue altamente expresado en el papilar (61,9%), tubular (59,6%) y adenocarcinomas indiferenciadas (55,4%), pero relativamente menor en el mucinoso (34,4%) y los subtipos de adenocarcinoma de células en anillo de sello (14,3%).
RRM1 promueve el crecimiento celular a través de la Ras /Raf /MAPK vía de señalización en GC
el mamíferos RNR subunidad grande R1 (R1) suprime la malignidad en Ras transformado células 3T3 de ratón [21]. p-ERK es un importante componente de transporte regulado por la transducción de señales Ras /Raf. Por lo tanto, para estudiar la relación entre RRM1 y agresividad GC, que mide p-ERK en muestras de parafina 32 GC pacientes. La tinción IHC indica que la expresión RRM1 se asoció en forma concordante con el nivel de p-ERK en muestras de GC (Figura 2
Un
,
panel izquierdo
). La correlación fue estadísticamente significativa (Figura 2
Un
,
panel de la derecha
). Por otra parte, la transferencia de genes experimento indicó que el aumento de la expresión RRM1 aumento de la expresión de p-ERK en células AGS (Figura 2
B Opiniones,
panel superior
) y promovió el crecimiento celular
in vitro
(figura 2
B Opiniones,
panel inferior
). Para determinar si RRM1 regula la señalización de Ras /MAPK /Raf, se redujeron reguladas expresión RRM1 de siRNA en células AGS y NCI-N87. Scramble siRNA se utilizó como control negativo. El análisis de transferencia Western indicó que RRM1 se redujo específicamente por el siRNA correspondiente (Fig. 2
C
). Junto con una reducción de RRM1, las señales para p-MEK, p-ERK y NF-kB se redujo significativamente; la actividad de Ras /Raf también se redujo notablemente en ambos AGS y células NCI-N87. Las observaciones anteriores ilustran que RRM1 puede promover la proliferación celular GC mediante la activación de la señalización de Ras /Raf /MAPK.
Un
, se encontró sobreexpresión RRM1 que ir acompañada de una alta expresión de p-ERK en GC pacientes (
p Hotel & lt; 0,01, n = 32), ventanas 1-4 muestran imágenes representativas de p-ERK y RRM1 de corresponsabilidad en 2 tinción de tejidos cancerosos de dos pacientes representativos (Pic 1-2: GC No1; pic 3-4: GC No2).
B Opiniones, sobreexpresión de RRM1 (tanto ectópico y endógena RRM1) a través de la transfección de pRRM1 (pEBG-RRM1) promueve el crecimiento de células AGS; p-ERK fue también hasta reguladas posteriormente.
C
, RRM1 se había reducido regulado con siRNA en dos líneas celulares de GC, AGS y NCI-N87. Las células se recogieron y se analizaron con Western blot y Ras actividad kit (Millipore, MA). La actividad de Ras-Raf fue severamente disminuida y así eran las proteínas aguas abajo p-MEK, p-ERK y c-NFkB.
Expresión RRM1 se asocia con el cáncer gástrico La agresividad
Para explorar más a fondo las conclusiones anteriores, la expresión de proteínas RRM1 se midió en las muestras de GC. Sobre la base de la tinción IHC, 22 de 67 en el conjunto de los GC COH y 156 de 322 en el conjunto de los GC ZJU eran o citoplasmática o nuclear RRM1-alta (Tabla 1). En el COH y conjuntos ZJU, RRM1-alta fue más frecuente en hombres que en mujeres y más probabilidades de llegar a la significación estadística en el conjunto ZJU (
p Hotel & lt; 0,01). Hubo más proximal GC (44,8%) en el conjunto de la HOC, pero más distal GC (52,5%) en el conjunto ZJU. RRM1 expresión fue significativamente mayor en los GCs proximales (
p Hotel & lt; 0,05) en el conjunto de la HOC, y se observó una tendencia similar en el conjunto ZJU (
p = 0,31
). Mientras tanto, RRM1 se asoció con el número de ganglios linfáticos involucrados, el tamaño del tumor, la expresión de Ki67, subtipo histológico y el grado histológico en el conjunto ZJU (
p Hotel & lt; 0,05 para cada uno). Debido al tamaño pequeño de la muestra, no se observó significación estadística de los factores mencionados en el conjunto de la HOC, pero es evidente que se podía ver tendencias similares.
Para investigar más a fondo si RRM1 se asoció con la agresividad GC, una se realizó un análisis multivariante logística no condicional. Aquí, el estadio TNM se considera que es la salida (estadio III & amp; IV frente a estadio I & amp; II), y el odds ratio (OR) para RRM1 (RRM1-alta vs. RRM1-bajo) se ajustó para los co-factores, incluyendo edad, sexo, localización del tumor y el grado histológico. La OR ajustada para RRM1 (IC del 95%: 1,09 a 2,94) 1,78 en el conjunto ZJU. Estos resultados indican que la expresión de alto RRM1 se asoció con el estadio TNM avanzada en GC.
RRM1 sobreexpresión se asocia a peor supervivencia en pacientes GC
Debido a RRM1 se asocia con el estadio TNM avanzada de GC, Kaplan se emplearon -Meier análisis y un modelo de riesgos proporcionales de Cox para determinar el impacto de RRM1 sobre los resultados de GC. En el conjunto de la HOC, el tiempo más largo de seguimiento fue de 228 meses; 53 de 67 pacientes con cáncer gástrico muerto a causa de los trastornos relacionados con GC-y 34 pacientes tuvieron una recurrencia. En el conjunto ZJU, el tiempo más largo de seguimiento fue de 179 meses; un total de 175 322 pacientes murieron a causa de GC GC, y 87 pacientes tuvieron una recurrencia. Resultados consistentes con los fueron vistos por RRM1 citoplasmática (HR = 1,62; IC del 95% 01/20 a 02/20) y RRM1 nuclear (HR = 1,61; IC del 95% 1.19 a 2.18). Por lo tanto, cualquiera de las expresiones RRM1 nuclear citoplasmática o alto alta se consideró en el siguiente análisis.
El análisis de Kaplan-Meier indicó que RRM1-alta fue significativamente relacionada con la mala SG y SLP en el COH y conjuntos ZJU (log rank
p Hotel & lt; 0,01 o
p
= 0,03) (figura 3
Un CD -
D
).. El tiempo medio de supervivencia para el subconjunto RRM1 de baja fue de 28 meses en el conjunto COH y 42 meses en el conjunto ZJU. Para el subconjunto RRM1-alta, el tiempo medio de supervivencia fue significativamente reducida a 12,5 y 23 meses en el COH y ZJU establece, respectivamente. Se obtuvieron resultados similares en el análisis PFS. RRM1-alta aumentó significativamente el riesgo de recurrencia de GC en ambos conjuntos (log rank
p Hotel & lt; 0,01 en el conjunto de COH y
p = 0,03
en el conjunto ZJU)
Un
. El análisis de Kaplan-Meier para el sistema operativo se muestra como RRM1-alta
vs.
RRM1 bajo para mejorar la potencia del estudio en conjunto COH.
B Opiniones, El análisis de Kaplan-Meier para el sistema operativo se realizó en conjunto ZJU. El análisis de Kaplan-Meier de la SSP se realizó en
C gratis (conjunto COH) y
D gratis (conjunto ZJU). El análisis multivariante de Cox para el sistema operativo de GC se muestra en
E
y
F Opiniones de COH y ZJU establecer respectivamente. La razón de riesgo (HR) de RRM1 se basó en RRM1-alta
vs
RRM1-baja.; la localización del tumor fue proximal
vs
. cuerpo
vs
. distal & amp; Todo; Ki67 fue positivo
vs
. negativo; El estadio tumoral fue Etapa I & amp; II
vs
. III & amp; IV; El grado del tumor fue baja
vs
. moderada
vs
. alto; Sexo masculino fue
vs
. hembra; La edad se basa en los cambios por unidad. El "*" se utiliza para indicar la significación estadística (
p Hotel & lt; 0,05) guía empresas
Para evitar los efectos de factores de confusión, un análisis multivariante de Cox se realizó usando el COH y ZJU fija (. Fig. 3
e y 3F
). En el conjunto de la HOC, los factores TNM etapa, la localización del tumor, el grado del tumor, el nivel de Ki67, sexo y edad se aplicaron para ajustar la FC. Como se ilustra en las Figs. 3
E y 3F
, RRM1 y el estadio TNM se asociaron significativamente con un mal sistema operativo de pacientes con cáncer gástrico en el COH y conjuntos ZJU. Los CRI para la RRM1 fueron 2,55 (IC del 95% 1.27 hasta 5.15) y 1,51 (IC del 95% 1.7 a 2.13) en el COH y ZJU establece, respectivamente. Ki67 ha sido ampliamente utilizado como un biomarcador para la proliferación de células de cáncer, pero no para predecir el resultado de GC en el COH y ZJU fija.
El rendimiento pronóstico de RRM1 en GC Advanced
Para evaluar aún más el rendimiento pronóstico de RRM1 en los subgrupos de GC, se llevó a cabo un análisis de la estratificación. En este sentido, no reportamos los resultados de estratificación del conjunto COH debido al tamaño pequeño de la muestra (un total de 67 casos). En la Fig.