Extracto
cromosomas hora dobles (DMS) tienen implicaciones importantes para la progresión del cáncer, porque con frecuencia oncogenes amplificados en ellos. previamente hemos detectado un gen funcionalmente indefinido amplificada en DM, ribosomal L22-comparables1 (
RPL22L1
). La relación entre el
se desconoce RPL22L1
y la progresión del cáncer. Aquí,
RPL22L1
se caracterizó por su papel en el cáncer de ovario (CO) metástasis y su mecanismo subyacente se examinó. el número de copias de ADN y la expresión del ARNm de
RPL22L1 Hoteles en células OC se analizó utilizando datos obtenidos a partir del Genoma del Cáncer Atlas y la base de datos Gene Expression Omnibus. Se realizó un análisis inmunohistoquímico de muestras OC clínicos y se evaluaron las relaciones entre el nivel de expresión y los factores clínico-patológicos. Además,
in vivo
y
in vitro se realizaron ensayos de
para entender el papel de los
RPL22L1
en OC. RPL22L1 expresión fue mayor en las muestras de anticonceptivos orales que en los tejidos normales, y su nivel de expresión se correlaciona positivamente con la invasión y la metástasis de ganglios linfáticos (
P Hotel & lt; 0,05).
RPL22L1
mejora de forma significativa el desarrollo de tumores de xenoinjertos intraperitoneal sobreexpresión en ratones desnudos y promovido la invasión y la migración
in vitro
. Además,
RPL22L1
desmontables células UACC-1598 inhibió notablemente la invasión y migración. Además,
RPL22L1
sobreexpresión regulada hasta el marcadores mesenquimales vimentina, fibronectina, y α-SMA, reducción de la expresión de los marcadores epiteliales E-cadherina, α-catenina y β-catenina.
RPL22L1
inhibición de la reducción de expresión de vimentina y N-cadherina. Estos resultados sugieren que
RPL22L1
induce epitelio-mesenquimal transición (EMT). Nuestros datos muestran que las MD gen amplificado
RPL22L1
es fundamental en el mantenimiento del fenotipo agresivo de la CO y en el desencadenamiento de la metástasis de células mediante la inducción de la EMT. Podría emplearse como un marcador pronóstico novela y /o diana terapéutica eficaz para OC
Visto:. Wu N, Wei J, Wang Y, Yan J, Qin Y, Tong D, et al. (2015) ribosomal L22-comparables1 (
RPL22L1
) promueve la metástasis del cáncer de ovario mediante la inducción de la transición epitelio-mesenquimal. PLoS ONE 10 (11): e0143659. doi: 10.1371 /journal.pone.0143659
Editor: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 5 de Agosto, 2015; Aceptado: 6 de Noviembre de 2015; Publicado: noviembre 30, 2015
Copyright: © 2015 Wu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: número de copias de ADN datos de análisis se pueden obtener de oncomine.org (https://www.oncomine.org/resource/main.html) y todos los pasos detallados están dentro del papel. Todos los demás datos pertinentes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Programa de Changjiang eruditos y Equipo de investigación innovadora en la Universidad (Grant No. IRT1230 a YJ), el Nacional Natural Fundación de Ciencias de China (subvención No. 81371617 a YJ), la fundación Joven Sobresaliente de la provincia de Heilongjiang de China (subvención Nº JC201215 a YJ)
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia.
Introducción
el cáncer de ovario (CO) es la segunda neoplasia ginecológica más frecuente y la primera causa de muerte [1]. metástasis del cáncer, en lugar de los tumores primarios, son responsables de la mayoría de las muertes por cáncer [2]. Debido a la falta de síntomas tempranos definitivos y marcadores apropiados para el diagnóstico OC en una etapa temprana, la mayoría de los pacientes son diagnosticados con la fase tardía de OC acompañado de metástasis, que normalmente tiene una tasa de supervivencia a 5 años de & lt; 30% [3]. Es fundamental comprender los mecanismos moleculares implicados en la metástasis del OC, y determinar dianas moleculares eficientes, específicos y sensibles que se pueden aplicar al diagnóstico de metástasis, el pronóstico y el tratamiento individual.
cromosomas dobles diminutos (DMS) son características citogenéticas de amplificación de genes [4]. DM aparecen en diversos tipos de células cancerosas humanas, pero no en las células normales [5]. Como elementos extra-cromosómico que llevan amplificaciones de secuencias de ADN genómico, de modalidades contribuyen a la formación y progresión del cáncer, oncogenes son a menudo presentes en las secuencias amplificadas y las proteínas que codifican son a menudo expresada sobre-[6]. Los ejemplos de genes amplificados en los DM incluyen
MYC Hoteles en el cáncer de colon [7],
MYCN
en el neuroblastoma [8],
EGFR
en los gliomas [9], y
EIF5A2
[10, 11] en el cáncer de ovario [12]. Como DM son vehículos de genes amplificados incluyendo muchos oncogenes, los estudios funcionales de genes que se amplifican en los DM es una buena manera de explorar los oncogenes candidatos.
Nuestro equipo 3q26.2 previamente identificado como un origen de DM en el ser humano línea celular de cáncer de ovario UACC-1598, y una serie de genes que se co-amplificado en los mismos de modalidades de ovario, incluyendo
MYCN
,
EIF5A2
, y
RPL22L1
[13 ]. Tanto
MYCN
y
EIF5A2
juegan un papel importante en la progresión del cáncer. Sin embargo, la relación entre el
RPL22L1
y el cáncer no se conoce.
En este estudio, hemos demostrado que
RPL22L1
es comúnmente sobreexpresado en individuos OC clínica y su expresión nivel está fuertemente relacionada con la invasión tumoral y la metástasis. Un
in vivo
experimento mostró que la expresión forzada de
RPL22L1
promueve el desarrollo de tumores de xenoinjertos intraperitoneal en ratones desnudos, y aumenta la migración celular y la invasión
in vitro
. Por otra parte, golpeando hacia abajo con pequeños ARN de interferencia (siRNA) inhibe la migración y la invasión
in vitro
. Durante este proceso,
RPL22L1
sobre-expresión dio lugar a una elevada expresión de marcadores mesenquimales como la vimentina y α-SMA, y la disminución de la expresión de marcadores epiteliales, tales como E-cadherina, α-catenina y β-catenina , lo que indica que la inducción de la transición epitelio-mesenquimal transición (EMT) puede explicar el aumento observado en la motilidad y la invasión capacidad para la metástasis. Nuestros datos muestran que
RPL22L1
juega un papel importante en el proceso de metástasis OC.
Materiales y Métodos
declaración ética
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad médica de Harbin, con el siguiente número de referencia, HMUIRB20150023. Los microarrays de tejidos de cáncer de ovario (TMA) para inmunohistoquímica fueron adquiridos de los Estados Unidos BIOMAX (ov951, ov1912, ov6161; Rockville, MD, EE.UU.) y Xin Chao (Hova-Can90PT-01; Shanghai, China). Ambas empresas proporcionados enunciados éticos para confirmar que los comités de ética local aprobó sus procedimientos de consentimiento, todos los participantes presentaron sus consentimientos informados por escrito y se han hecho todos los esfuerzos para proteger la privacidad y el anonimato del paciente. Las declaraciones éticas proporcionados por las empresas y el protocolo del experimento habían sido comprobado cuidadosamente y aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Harbin (HMUIRB20150023). Cuatro semanas de edad, los ratones Balb /c hembras (de patógenos específicos libre) fueron adquiridos de SLAC (Shanghai, China) y se alojaron en el Laboratorio Animal de la Universidad Médica de Harbin. Los animales fueron alojados en condiciones de luz controlada estandarizados a temperatura ambiente (24 ° C) y 50% de humedad, con acceso libre a comida y agua. Los experimentos con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de las Guías de Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica de Harbin. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Harbin (HMUIRB20150023) y todos los esfuerzos se hicieron para minimizar el sufrimiento.
Líneas celulares y cultivo celular
línea celular de cáncer de ovario humano UACC-1598, SKOV3, HO-8910, y HO-8910PM se adquirieron de la Colección de Cultivos Tipo de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china). Todas las células se cultivaron siguiendo los métodos descritos por la ATCC (Manassas, VA, EE.UU.), y se autentican en el año 2012 en la Empresa Genética de lectura-Micro (Pekín, China) con un breve análisis de repetición en tándem.
Preparación de los diferenciales en metafase y la fluorescencia
in situ
hibridación (FISH) análisis
las células se recogieron para la preparación de propagación de metafase de acuerdo con los métodos descritos en estudios anteriores [14, 15] y se tiñeron con Giemsa. Dos clones BAC, GFP-RP11-355H10, que cubre específicamente el
MYCN gratis (amplificado en UACC-1598 y se encuentra en la DM [13]), y Cy3-RP11-726H11 para
RPL22L1
, fueron seleccionados como sondas de ADN y se hibridaron a los diferenciales de metafase de células como se describe anteriormente [16]. Los cromosomas se contratiñeron con DAPI (4, 6-diamidino-2-fenilindol). Las imágenes fueron capturadas utilizando un microscopio de fluorescencia Leica DM5000 B (Wetzlar, Alemania), y se analizaron utilizando el Sistema de MetaMorph Imaging (Universal Imaging Corporation, West Chester, NY, EE.UU.).
número de copias de ADN y análisis de la expresión génica
Los número de copias de ADN Oncomine Conjuntos de datos (https://www.oncomine.org/resource/main.html) incluye datos depositados en el Atlas del Genoma del cáncer (TCGA ovárico 2 Conjunto de datos, http: //TCGA-datos. nci.nih.gov/tcga/) se utilizó para determinar las diferencias en el número de copias de ADN entre OC y tejidos de ovario de sangre /normales. Se analizaron 607 cystadenocarcinoma de ovario seroso, 431 arterial normal, y 130 muestras de tejidos normales de ovario. Los datos fueron obtenidos a través de los siguientes pasos: Nombre del gen de tipo:
RPL22L1
en el cuadro de búsqueda y en el árbol de navegación seleccione filtros primarios & gt; Conjuntos de datos type & gt; Conjuntos de datos de ADN de copia de número. El resultado de TCGA ovárico 2 está directamente en el primero, y el gráfico estaba a la izquierda. Haga clic en el botón de histograma en la esquina superior izquierda del título del gráfico para obtener un gráfico de histograma. En los filtros de grupo por encima del título del gráfico, haga clic en el símbolo del triángulo, en el menú seleccionado "El cáncer y el tipo normal" para hacer el análisis agrupado por el cáncer y las muestras normales. Acceso a los datos requiere una cuenta de correo electrónico académico. Los autores deberían ser contactados para obtener información de inicio de sesión si es necesario.
Se utilizaron dos genes independientes de microarrays de expresión de datos. Ambos conjuntos de datos se generaron utilizando el Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 plataforma Array (Santa Clara, CA, EE.UU.). Los archivos raw.CEL para los dos conjuntos de datos fueron descargados de la Expresión Génica Omnibus (GEO) sitio web (GSE27651 y GSE28450) [17, 18], y se normalizaron utilizando el RMA (sólida de múltiples matrices promedio) algoritmo [19].
QRT-PCR
el ARN total para cada línea celular se extrajo utilizando el Alto Pure RNA Kit de aislamiento (Roche, Basilea-Ciudad, Suiza) siguiendo las instrucciones del fabricante. PrimeScript
® se utilizó RT kit de reactivos perfecto en Tiempo Real (Takara, Dalian, China) a transcripción inversa del ARN total. El cDNA se cuantificó utilizando LightCycler
® 480 SYBR Green I Master (Roche) en un LightCycler
™ 480 II Sistema de Tiempo Real (Roche). Los cebadores específicos para personas
RPL22L1
y
GAPDH
fueron los siguientes: imprimación
RPL22L1
cebador directo, 5'-AGAAGGTTAAAGTCAATGG-3 'y revertir, 5'-ATCACGAAGATTGTTCTTC- 3 ';
GAPDH
cebador directo, 5'-ATCACTGCCACCCAGAAGAC-3 'y el cebador inverso, 5'-TTTCTAGACGGCAGGTCAGG-3'. La expresión de
RPL22L1
en las muestras se normalizó a la de
GAPDH Opiniones y factor de cambio en la expresión se calculó utilizando la 2
-ΔΔCt método.
Western blot El análisis
Las células se lisaron a 4 ° C en RIPA (8990, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.). Los lisados celulares que contienen 40μg de proteína total de cada muestra se cargaron en 12% geles de poliacrilamida dodecilsulfato de sodio y se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). Después de bloquear en solución de bloqueo 10% (Roche), las membranas se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios seguidos de 1 h de incubación con anti-ratón /anticuerpo secundario anti-conejo (200-332-263 /610-132-007 , Rockland Immunochemicals, Limerick, PA, EE.UU.) a temperatura ambiente. Las imágenes se obtuvieron utilizando el Sistema de Odyssey Infrared Imaging (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, EE.UU.) y cortadas utilizando Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems Inc, San Jose, CA, EE.UU.), representativos de cinco experimentos independientes. GAPDH se utilizó como control. Los detalles de los anticuerpos primarios se proporcionan en el texto complementario materiales S1
microarrays de tejidos
The OC microarrays de tejidos (TMA) fueron adquiridos de los Estados Unidos BIOMAX (ov951, ov1912, ov6161;. Rockville, MD, EE.UU.) y Xin Chao (Hova-Can90PT-01; Shanghai, china). Se obtuvo la aprobación para este estudio antes de que se inició desde el comité local de ética regional. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes.
La inmunohistoquímica se realizaron
La inmunohistoquímica (IHC) los estudios que utilizan PowerVision
™ Two-Step Histostaining Reactivo (Zhongshan Golden Bridge, Pekín, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, TMA secciones se deparaffinized y rehidratada. Para la recuperación de antígenos, TMA diapositivas fueron tratados con microondas en tampón de citrato 10 mM (pH 6,0) durante 8 min. La actividad peroxidasa endógena fue bloqueada con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 min. Las diapositivas TMA se incubaron con una dilución 1:50 de anticuerpos monoclonales contra RPL22L1 humano (1:50) durante la noche a 4 ° C en una cámara húmeda. Los portaobjetos se incubaron a continuación secuencialmente con anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo conjugados con peroxidasa de rábano picante-anticuerpo durante 30 minutos a 37 ° C, y diaminobencidina 3'-3 'se utilizó como sustrato cromógeno. Por último, todas las diapositivas se counterstained para núcleos con hematoxilina, se deshidrataron y se montaron. Para el control negativo, el anticuerpo primario fue sustituido con IgG de conejo normal. RPL22L1 inmunoreactividad en las muestras de TMA fue evaluada por tres patólogos. La intensidad de la inmunorreactividad de TMA se clasifica en una escala de 0 a 3 sobre la base de un consenso de los tres investigadores.
Vectores
RPL22L1
-OR ^ fue amplificado por PCR y clonado en el vector de expresión pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). El siRNA (h) y el control de siRNA fueron adquiridos de RiboBio (Q000200916-1-B, Guangzhou, China). El plásmido indicador de luciferasa pGL4.17 fue proporcionado amablemente por el Dr. Zhong ZH (Departamento de Microbiología de la Universidad Médica de Harbin, Harbin, China).
La transfección
Todos los plásmidos y siRNAs fueron transfectadas en células utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante.
modelo de xenoinjerto de tumor de ratón desnudo
los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad médica de Harbin (HMUIRB20150023) y se realizó de acuerdo con el directrices de Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad médica de Harbin. Cuatro semanas de edad BALB /c desnudos ratones hembra se aleatorización asignado en cada grupo, cinco ratones por grupo. Cada ratón se inyectó con 1 × 10
6 células (en 200μl de solución salina tamponada con fosfato [PBS]). El crecimiento del tumor se midió dos veces por semana a través de imágenes de bioluminiscencia. Los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal con 150μg /g D-luciferina (Biosynth, Naperville, IL) en PBS y se anestesiaron con 2,5% de isoflurano. Los fotones emitidos desde los ratones fueron registrados por IVIS Lumina (Advanced Molecular Vision, Lincolnshire, Reino Unido) y se presentan como imágenes pseudo-de color superpuestas una imagen corporal en escala de grises. Todos los ratones fueron sacrificados por CO
2 inhalación de 30 días después de inyectarse. Para asegurarse de la muerte después de CO
2 asfixia, se realizó la dislocación cervical.
Ensayos
migración celular y la invasión
migración celular y la invasión Transwell ensayos se realizaron con insertos Corning 8,0 mm Transwell (8 tamaño de poro -μm, placa de 24 pocillos) y BD BioCoat
™ Matrigel
™ invasión Chambers (Corning Incorporated Ciencias de la vida, Tewksbury, MA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante.
la cicatrización de heridas ensayo de
La monocapa celular se rascó con una punta de pipeta de 10 l (en una placa de 6 pocillos). Las fotografías (ampliación, × 40) se tomaron inmediatamente y en cada 24 h después de la herida hasta que las heridas fueron curadas, obviamente. Para cada ensayo, los experimentos se realizaron a nueve posiciones diferentes y todo el ensayo se repitió tres veces.
Inmunofluorescencia tinción
Las células se fijaron en metanol y se bloquearon durante 1 h con 10% normales suero de cabra, 0,3% de albúmina de suero bovino, 0,05% de saponina, y 0,3% de Triton X-100 en PBS. Se añadieron los anticuerpos primarios y se incubaron a 4 ° C durante la noche. Las células se lavaron después con PBS y se incubaron con anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. Se utilizó un microscopio de fluorescencia (Leica) para capturar las imágenes.
Estadísticas
Los RPL22L1 niveles de expresión de proteínas de TMA se analizaron mediante pruebas de rangos con signo de Wilcoxon. Se utilizó la χ
2 de prueba para examinar las asociaciones entre la expresión génica y los parámetros clínicos. Otros datos se expresaron como media ± SD, y se evaluó la significación estadística de las diferencias entre los dos grupos usando-Student de dos colas independientes
t-pruebas
. La significación estadística se declaró si
P Hotel & lt; 0.05. Los cálculos se realizaron con el programa SPSS 13.0. (IBM, Armonk, Nueva York, EE.UU.)
Resultados
RPL22L1
se amplificó a través de modalidades y sobre-expresado en las células UACC-1598
la línea celular OC UACC-1598 contenía genes amplificados en forma de DM. amplificación Oncogene en DMS es representativa de la tumorigénesis, pero no se produce en las células normales (Fig 1A). El uso de un análisis FISH, que hemos detectado regiones de
RPL22L1 amplificado Windows que co-localizada con
MYCN
en DM (Figura 1B). Además, se detectó la amplificación de
RPL22L1
en los tejidos ováricos normales, los linfocitos humanos, y UACC-1598 células por medio de PCR (Figura 1C). También se examinó la amplificación de
RPL22L1
en otras tres líneas celulares de cáncer de ovario (S1) Fig. RT-PCR confirmó la expresión de
RPL22L1
en diferentes muestras (Figura 1D). Estos resultados indican que
RPL22L1
se amplificó a través de modalidades en las células UACC-1598.
(A) imágenes representativas de los cromosomas en metafase de UACC-1598 y linfocitos humanos normales. Las flechas indican los DM en células UACC-1598 (magnificación, × 1.000). (B) Imágenes representativas de análisis FISH. se detectaron los cromosomas en metafase de UACC-1598 y linfocitos humanos con sondas de ADN. (A) El color rojo indica la sonda
RPL22L1
y (b) la sonda verde indica
MYCN
; (C) ambas sondas se encuentran en el mismo locus en DM como se indica por las flechas, (d) la sonda roja indica
RPL22L1
en linfocitos humanos normales (magnificación, × 1000). (C) los niveles de amplificación de ADN de
RPL22L1
ha detectado por PCR, (D) resultado de RT-PCR de ARNm de los niveles de expresión de
RPL22L1
en diferentes muestras.
el número de copias de ADN y el nivel de expresión de
RPL22L1 Hoteles en muestras clínicas OC
Para determinar la amplificación de
RPL22L1 Hoteles en clínica, se utilizó la base de datos Oncomine (https: //www .oncomine.org) para analizar los perfiles de número de copias de ADN de la
RPL22L1
en un conjunto de datos de ovario TCGA (TCGA ovárico 2, http://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/) [20 , 21]. Este conjunto de datos indica claramente un aumento significativo en el número de copias de ADN de
RPL22L1
en OC comparación con la sangre normal y tejidos de ovario, umbral por
P
& lt; 10
4 (figura 2A).
(A) número de copias de ADN perfiles de
RPL22L1
en un conjunto de datos de ovario seroso cystadenocarcinoma registrada en la base de datos Oncomine (TCGA ovárico 2 Conjunto de datos) . Dos independientes conjuntos de datos de microarrays de expresión génica (B) GSE29405 y (C) GSE27651 de la página web GEO se utilizaron para examinar el nivel de expresión de
RPL22L1
en OC. Los archivos raw.CEL para las dos bases de datos se descargan y se normalizaron RMA.
RPL22L1
fue más altamente expresado en OC que en el tejido normal del ovario (*
P Hotel & lt; 0,05, de Student independiente
t-test
). imágenes representativas de la expresión de proteínas en RPL22L1 (D) OC y (E) acertaron el tejido normal adyacente por IHC (ampliación, × 400).
Además, hemos obtenido públicamente disponibles GEO expresión de datos para analizar la expresión de
RPL22L1 Hoteles en muestras de OC. Dos conjuntos de datos GEO basadas en el Affymetrix Human Genome U133 Plus 2,0 Array se utilizaron para evaluar
RPL22L1
los niveles de expresión de ARNm en OC y tejidos ováricos normales. En cada uno de los dos conjuntos de datos,
RPL22L1
expresión fue significativamente mayor en OC que los tejidos ováricos normales (Figura 2B y 2C,
P Hotel & lt; 0,05, prueba t de Student).
a fin de examinar el nivel de expresión de la proteína de
RPL22L1 Hoteles en muestras clínicas, cuatro OC TMA se utilizaron para los análisis IHC. intensidad de la tinción se estimó utilizando un índice de 0 a 3 en el núcleo celular y el citoplasma (Fig S2). RPL22L1 se expresó claramente más alta en el citoplasma OC que en el de los tejidos adyacentes normales (figura 2D y 2E) (
P = 0,008
, prueba de rangos con signo de Wilcoxon).
Hemos examinado la asociaciones entre los niveles de expresión de proteínas RPL22L1 y variables clínico-patológicas. RPL22L1 expresión en citoplasma de las células OC está fuertemente asociada con la etapa, invasión y metástasis en los ganglios linfáticos (
P Hotel & lt; 0,05, χ de Pearson
2 test, Tabla 1). Estos resultados indican que la expresión de
RPL22L1
es comúnmente mayor en los especímenes clínicos de OC, y su nivel de expresión está asociada con la progresión del tumor, especialmente con la invasión y la metástasis de los ganglios linfáticos.
RPL22L1
mejorado intraperitoneal el desarrollo de tumores de xenoinjertos
in vivo
Para detectar el papel de alto nivel
RPL22L1
en la progresión tumoral, seleccionamos una línea celular con OC baja expresión RPL22L1, SKOV3, para realizar nuevos estudios funcionales (figura 3A). SKOV3 eran transfección estable con luciferasa previamente y después de la transfección estable con
RPL22L1 gratis (figura 3B y 3C). Para explorar el papel de
RPL22L1
en la progresión tumoral
in vivo
, se inyectaron células de control por vía intraperitoneal SKOV3-RPL22L1 y en ratones desnudos. Los tumores xenoinjertados se midieron usando la bioluminiscencia en la 30
TH días después de la inyección, el área de tumor de xenoinjerto en ratones con células SKOV3-RPL22L1 inyectados era más grande que la de las células control inyectados (figura 3D). El resultado sugiere que el alto nivel de
RPL22L1
contribuyen al desarrollo de tumores.
(A) Expresión de RPL22L1 en UACC-1598 y SKOV3 se examinó mediante transferencias Western. La expresión de
RPL22L1 Hoteles en células SKOV3-RPL22L1 y de control fue examinado por (B) y transferencias Western (C) QRT-PCR. (D) de cuatro semanas de edad por vía intraperitoneal ratones desnudos fueron inyectados con células SKOV3-RPL22L1 o de control y las imágenes de bioluminiscencia se tomaron después de 30 días. (Bar: media ± desviación estándar; *
P Hotel & lt; 0,05, de Student independiente
t-test
).
RPL22L1
promovido OC la migración celular y la invasión
Para confirmar el papel de
RPL22L1 Hoteles en células de OC, las células UACC-1598 fueron tratados con tres siRNAs específicos contra el
RPL22L1 gratis (siRNA-1, siRNA -2, y siRNA-3). Desde siRNA-2 mostró la caída más eficiente de endógena de
RPL22L1
, fue elegido para análisis posteriores (Fig S3). Excepto las células de control SKOV3-RPL22L1 y, utilizamos otras dos líneas celulares OC HO-8910 y HO-8910PM con menor
RPL22L1
expresión transitoria transfectadas con
RPL22L1
para su posterior estudio funcional (S3 Higo). El efecto de
RPL22L1
sobre la motilidad celular se caracteriza por la curación de heridas, la migración transwell, y ensayos de invasión de Matrigel. Desmontables de
RPL22L1 Hoteles en células UACC-1598 (1598-siRPL22L1) causó clara resión de la migración de las células y la invasión. La sobreexpresión de la
RPL22L1 Hoteles en células SKOV3-RPL22L1, HO-8910 (8910-RPL22L1), y HO-8910PM (8910PM-RPL22L1) podría mejorar significativamente la migración y la invasión de las células (
P
& lt; 0,05, Fig 4). tasa de crecimiento celular se analizó mediante un ensayo de MTA,
RPL22L1
no tenía ninguna influencia sobre la proliferación celular (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que el alto nivel de
RPL22L1
mejora la migración de las células y la invasión de OC.
(A-D) imágenes representativas de ensayo de cicatrización de heridas de las células (ampliación, × 40). (E-H) migración de las células se detectó mediante ensayo de migración transwell, y (I-L) la invasión de células se evaluó usando una cámara de invasión de Matrigel. Los ejemplos de células que migraron a través de la membrana (panel izquierdo), las columnas indican los experimentos por triplicado (magnificación, × 100, Bar: media ± SD *
P Hotel & lt; 0,05, de Student independiente
t CD - prueba).
el nivel de expresión de
RPL22L1
influencias OC EMT línea celular
se ha vuelto cada vez más claro que la EMT es un componente integral de la progresión de células epiteliales -derivado tumores [22, 23]. Encontramos que las células SKOV3-RPL22L1 exhibieron una morfología en forma de huso y fibroblástica mientras que las células 1598-siRPL22L1 expuestas formas de contracción y una mayor adhesión célula-célula (Fig S4). Por lo tanto, se examinó si
RPL22L1
EMT inducida podría dar cuenta de la
RPL22L1
mediada por cambios en las células de la motilidad y la invasión. características bioquímicas de EMT incluyen la pérdida de expresión de proteínas marcadoras epiteliales y aumento simultáneo de la expresión de marcadores mesenquimales [22, 24]. Western blots y los análisis de inmunofluorescencia se utilizaron para evaluar la expresión de marcadores epiteliales y mesenquimales. Después ectópico sobreexpresión de
RPL22L1 Hoteles en células SKOV3, la expresión de los fabricantes epiteliales, tales como E-cadherina, β-catenina, y α-catenina se redujo, mientras que la expresión de vimentina, α-SMA, y fibronectina aumentó (Fig 5A y 5B). En 1598-siRPL22L1 células, los niveles de expresión de la vimentina marcadores mesenquimales y N-cadherina se degradaron (Figura 5C). Estos resultados sugieren que el nivel de expresión de
influencias RPL22L1
EMT en células OC.
(A) transferencias de Western mostró menores niveles de marcadores epiteliales (E-cadherina, β-catenina, y α- catenina) y mayores niveles de marcadores mesenquimales (vimentina, α-SMA, y fibronectina) en SKOV3-RPL22L1 en comparación con células de control en. (B) Si el análisis mostró disminución de los niveles de marcadores epiteliales (α-catenina y la β-catenina) y el aumento de los niveles de marcadores mesenquimales (vimentina y fibronectina). (C) Análisis de transferencia Western mostró que desmontables de
RPL22L1 fotos: por siRNA dado lugar a una disminución del nivel de marcadores mesenquimales (vimentina y N-cadherina) en las células UACC-1598.
Discusión
Los DM son marcadores citogenéticos malignas y están estrechamente correlacionados con la progresión del tumor [4]. Anteriormente, se determinó que
RPL22L1
amplificaron en DM, pero su función no está claro. Muchos oncogenes son amplificadas a través de modalidades en las células tumorales malignas [34.38.39], como
EIF5A2
y
MYCN
, ambos de los cuales están ubicados en el mismo lugar como
RPL22L1
en MD. Inferimos que la
RPL22L1
pueden estar implicados en la progresión del OC, y verificado esto en una serie de
in vitro y Hoteles en
in vivo
ensayos.
Uso a disposición del público del TCGA y GEO expresión de datos que encontramos tanto en el número de copias de ADN y la expresión del ARNm de
RPL22L1
fue significativamente mayor en los tejidos OC que en los tejidos ováricos normales. expresión de la proteína de
RPL22L1
fue examinado por IHC usando cuatro OC TMA. Hemos encontrado que la expresión RPL22L1 era con frecuencia más alta en los tejidos OC comparación con el tejido ovárico normal adyacente (
P = 0,008
, prueba de rangos con signo de Wilcoxon). Además, encontramos el nivel de expresión se correlacionó significativamente con el estadio de la enfermedad (81,7% en el estadio 2-4 frente al 64,5% en la etapa 1) profundidad de invasión (81,9% en T2-T4 frente al 64,5% en T1), y la metástasis de los ganglios linfáticos (86,6 % con frente a 70,3% sin metástasis), lo que sugiere que el alto nivel de RPL22L1 en células OC puede facilitar el fenotipo invasivo /metastático. Estos resultados ponen de relieve un papel potencialmente importante de
RPL22L1
como un mecanismo biológico subyacente en el desarrollo y la progresión de la CO.
Los resultados del análisis de IHC indicaron que
RPL22L1
Mayo estar involucrados en la patogénesis de la progresión OC especialmente en la metástasis. Para confirmar esta hipótesis, xenoinjerto de tumor de ratón desnudo, cicatrización de heridas, la migración transwell, y ensayos de invasión de Matrigel se llevaron a cabo para investigar el papel de
RPL22L1
en la regulación de las células OC motilidad, invasión. La sobreexpresión de la
RPL22L1
obviamente promovió el desarrollo de tumores
in vivo
y el aumento de la capacidad de la migración y la invasión de tres líneas celulares OC
in vitro
. la migración Por otra parte, la caída de endógena de
RPL22L1 fotos: por siRNA en células UACC-1598 inhibió y la invasión
in vitro
. Migración y la invasión son dos fases importantes en la metástasis del tumor [25], y estos ensayos funcionales sugieren fuertemente que
RPL22L1
juega un papel importante en la promoción de la metástasis del tumor a través de la mejora de la migración celular y la invasión.
Muchos procesos biológicos están asociados con la migración y la invasión incluyendo EMT, un evento clave en la invasión tumoral y la metástasis [26]. La sobreexpresión de la
RPL22L1
redujo la expresión de proteínas marcadoras epiteliales (E-cadherina, β-catenina, y α-catenina) y el aumento de la expresión de marcadores mesenquimales (vimentina, α-SMA y fibronectina), las cuales son características bioquímicas de la EMT [24, 27, 28]. Sin embargo, después de la caída de
RPL22L1 Hoteles en células UACC-1598, fueron, obviamente, las reguladas al marcadores mesenquimales vimentina y N-cadherina. EMT juega un papel crítico en la promoción de la metástasis y durante este proceso las células obtienen capacidades de migración y de invasión, que promueven la metástasis [29, 30]. Por consiguiente, inferimos que la EMT sobre-expresión de
RPL22L1 probable
inducido a promover la invasión de células y la metástasis.
RPL22L1 es un parálogo de rpl22, que es un componente de la proteína de unión al ARN de la 60S subunidad ribosómica. Ribosomal proteínas son los principales componentes de los ribosomas, donde se sintetizan las proteínas celulares. Hasta la fecha, se han identificado aproximadamente 80 proteínas ribosomales. Además de su papel clave en la síntesis de proteínas, algunas proteínas ribosomales están involucrados en funciones extra-ribosomal, tales como la reparación del ADN, la apoptosis, la regulación de la transcripción, y la regulación de la traducción [31-36]. Un número creciente de informes han sugerido que las proteínas ribosómicas tienen potencial oncogénico [37-39]. Recientemente,
rpl22
se ha encontrado para mutarse o hacia abajo-regulada en varios tipos de cáncer, incluyendo leucemia linfoblástica aguda T-, carcinoma de mama invasivo, y el adenocarcinoma de pulmón. Además,
rpl22
directamente reprime la expresión de
RPL22L1
ARNm, y la falta de rpl22 provoca un aumento compensatorio en RPL22L1 [40, 41]. Estos estudios ORT nuestra conjetura con respecto al papel de
RPL22L1 Hoteles en la progresión del cáncer.
En conjunto, nuestros resultados sugieren que
RPL22L1
juega un papel importante en la progresión OC mediante la mejora de la célula invasión y metástasis a través de la inducción de la EMT. Como
RPL22L1
es un gen amplificado llevado a DM, nuestros datos podrían ayudar a explicar la función de los DM en el cáncer.