Extracto
Casi todos los cánceres de próstata responden al tratamiento de privación de andrógenos pero muchos se repiten. Postulamos que el riesgo de fuga y en frecuencia de la hormona se demore influenciados por las modalidades de terapia hormonal. Más, terapias hormonales inducen cambios biológicos cruciales que implican receptores de andrógenos; algunos podrían ser dianas para la prevención de fuga. Se investigó la relación entre el tratamiento de privación de andrógenos y el riesgo de recurrencia usando ratones desnudos que llevan el alto grado, dependiente de hormonas de próstata humano de xenoinjerto de cáncer PAC120. los ratones portadores del tumor fueron tratados por luteinizante-hormona liberadora de hormona antagonista (LHRH) solo, régimen continuo o intermitente, o combinarse con el receptor de andrógenos (AR) antagonistas (bicalutamida o flutamida). El crecimiento tumoral se monitorizó. Los cambios biológicos se estudiaron en cuanto a alteraciones genómicas, mutaciones AR y la expresión de proteínas en una gran serie de los tumores recurrentes de acuerdo con modalidades de terapia hormonal. Terapias dirigidas Her-2 AKT o se ensayaron en combinación con castración. Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras. El crecimiento tumoral se inhibe por la administración continua de la degarelix antagonista de LH-RH (castración), pero 40% de los tumores se repitió. castración intermitente o bloqueo completo inducidos por degarelix y antiandrógenos combinación, inhibe el crecimiento tumoral, pero aumentó el riesgo de recurrencia (RR) en comparación con la castración continua (RR
intermitente: 14.5, RR
bloqueo completo: 6,5 y 1,35). Todos los tumores recurrentes que aparecen
nuevas alteraciones genéticas cuantitativos y AR mutaciones, cualesquiera que sean las modalidades de tratamiento. amplificación de AR fue encontrado después de bloqueo completo. expresión de Her-2 /neu con el aumento de la activación de ERK /AKT frecuentes se detectó en todas las variantes. La combinación de la castración con un inhibidor de Her-2 /neu se redujo el riesgo de recurrencia (0.17) y la combinación con un inhibidor de mTOR impedido. tratamientos anti-hormonales influyen en el riesgo de recurrencia, aunque la inhibición del crecimiento del tumor fue inicialmente similar. Los tumores recurrentes muestran inestabilidad genética, mutaciones AR, y las alteraciones de las vías de fosforilación. Hemos postulado que Her-2 /Akt permite salvamento de las células tumorales bajo la castración y hemos demostrado que su inhibición impidió la recurrencia del tumor en nuestro modelo
Visto:. Guyader C, CERALINE J, E Gravier, Morin A, Michel S, Erdmann E, et al. (2012) riesgo de fuga hormonal en un modelo de cáncer de próstata humano depende de Terapia modalidades y se puede reducir mediante inhibidores de tirosina cinasa. PLoS ONE 7 (8): e42252. doi: 10.1371 /journal.pone.0042252
Editor: Irina Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: Enero 16, 2012; Aceptado: July 5, 2012; Publicado: 6 Agosto 2012
Copyright: © Guyader et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por la ARC y la Ligue contre le cancer (París, Francia). Estos proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y el análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. ARTIC financió la edición de Inglés
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes conflictos: Un autor es empleado por BioMérieux. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
receptor de andrógenos (AR) controla la proliferación celular y la supervivencia en los carcinomas de próstata y de próstata normales (PCA). Por lo tanto privación de andrógenos es el tratamiento de primera línea del CaP. La terapia hormonal incluye la castración logrado farmacológicamente con agonistas de la hormona luteinizante (hormona liberadora de LH-RH) o antagonistas, antagonistas de AR como flutamida o bicalutamida o nuevas modalidades de tratamiento tales como el inhibidor de 17-20 liasa (acetato de abiraterona, TAK700) o MDV3100 [1] . Los tratamientos se dan de forma continua o intermitente, por LH-RH monoterapia con inhibidores, en monoterapia o combinados antiandrógeno que se refiere el bloqueo androgénico completo.
Cualquiera que sea la terapia hormonal, la mayoría de los tumores responden entonces adquirir la independencia de andrógenos y se repita [2], [ ,,,0],3]. Se han propuesto varios mecanismos de [4], [5].
i.
Cambios genómicos se producen durante la progresión tumoral, pero su función aún no está claro, aunque las anomalías cromosómicas clonales se han encontrado en el CP [6], [7].
ii.
Alteración de la expresión AR es frecuente debido a la amplificación de genes [8], el aumento de la transcripción, o la estabilización de la proteína de AR a través de la fosforilación de residuos específicos AR [9], [10], las mutaciones AR que amplían la espectro de ligando [8], alteraciones en receptores nucleares coactivators y independiente de ligando de unión de AR al ADN [2], [11]. La prevalencia y la influencia de las alteraciones en la progresión de la enfermedad AR no se conocen debido a la variabilidad en los regímenes de tratamiento, el acceso limitado a los materiales de los pacientes y por lo tanto pocos estudios exhaustivos de secuenciación.
III.
La activación de las vías de supervivencia está implicado en la hormona de escape [12], como Her-2 /neu (un factor de crecimiento tirosina quinasa del receptor), mTOR /AKT (diana de la rapamicina /AKT), o ERK1 , 2 (extracelular señal-quinasa regulada), todos implicados en la fosforilación de AR [5], [10]. Her-2 /neu expresión es generalmente baja en el CaP. Sin embargo, los altos niveles de Her-2 /neu se encuentran asociados con tiempos de supervivencia más corta en un subgrupo de pacientes con CaP [13], [14]. Más, artesanía
et al.
Mostró que obligó a Her-2 /neu expresión modula la señalización AR y conduce a la independencia de andrógenos [15]. Una ruta AKT alterada se asocia con la progresión del CaP y la aparición de tumores de IA [16]. Por otra parte, Graff
et al.
Mostró que la sobreexpresión forzada de AKT en la línea celular LNCaP se aceleró el crecimiento del tumor [17]. AKT podría ser una forma alternativa por el cual Her-2 /neu lleva a prohibir la activación AR [18].
Una cuestión clave es si en las clínicas de modalidades de tratamiento hormonal afectan de manera diferente el riesgo de escape. Para responder a esta cuestión crítica, se utilizó un modelo experimental de una hormona dependiente de cáncer de próstata humano (PAC120), derivado directamente de un paciente y en crecimiento en ratones inmunodeficientes. Se evaluó el efecto de diferentes modalidades de tratamiento hormonal en la respuesta inmediata y en el riesgo de recurrencia; los cambios biológicos asociados con diferentes tratamientos, como alteraciones del genoma,
Se estudiaron AR
mutaciones, y la expresión del factor de crecimiento /activación. La implicación de las vías de fosforilación en la fuga de la hormona nos llevó a probar la combinación de inhibidores de la tirosina cinasa con la castración farmacológica para reducir el riesgo de recurrencia del tumor.
Métodos
xenoinjertos de tumores de próstata
PAC120, un ser humano-en-ratón CaP xenoinjerto dependiente de hormonas, [19] mantenida por el trasplante de serie en la almohadilla de grasa interescapular de ratones desnudos hombres suizos (Crl: NU (Ico) -Foxn
lnu) de Charles River (L 'Arbresle, Francia) fue utilizado entre los pasajes 47 y 51. Las piezas de tumor de 20 mm
3 ± 5 (± 20. 10
6 células) donde trasplantado. Todos los protocolos siguen las pautas institucionales, presentada por el Comité de Ética francés.
Tratamientos
degarelix (Firmagon® conocido como FE 200486 durante el mismo desarrollo, Ferring Investigación Institute Inc., San Diego, CA) [20] inyecta por vía subcutánea mensualmente a 10 mg /kg [19], la bicalutamida (Casodex®, Astra Zeneca, Francia) y la flutamida (Eulexine®, Schering-Plough, Kenilworth, NJ) dada a 50 mg /kg, por vía oral, 5 días por semana. Trastuzumab (Herceptin®, Roche, Francia) inyectó semanalmente en 10 mg /kg mediante administración intraperitoneal. Everolimus (Afinitor®, Novartis Pharma AG, Suiza) da por vía oral a 2 mg /kg, 3 días por semana. Definimos la castración continua como la inyección de degarelix solo una vez al mes. Los ratones se mantuvieron bajo tratamiento hasta la recaída del tumor (tumor tuvo que llegar a un 1.500 mm
3). castración intermitente consistía en 2 inyecciones de degarelix en días 0 y 28 (un ciclo), luego se detuvo el tratamiento hasta que el tumor se remontan 2 veces el volumen inicial. El bloqueo androgénico completo es la asociación de mensual de degarelix en combinación con el inhibidor del receptor del antiandrógeno (ya sea bicalutamida o flutamida). Figura S1 representa un diagrama esquemático de las modalidades de tratamientos.
Evaluación del Crecimiento Tumoral
Seguimiento del crecimiento del tumor se realizó de acuerdo a Marangoni et al. [21]. La recurrencia se define como el tiempo en días requeridos para los tumores de lograr un aumento de 5 veces de volumen inicial.
fragmentos de tumor de xenoinjerto PAC120 se implantaron aleatoriamente en 204 ratones machos. Tan pronto como los tumores alcanzaron un volumen medio de 63 a 250 mm
3, los ratones fueron asignados al tratamiento (
n
indican en la Tabla S1). Después de la regeneración del tumor, los tumores AI fueron trasplantadas en ratones machos castrados farmacológicamente y caracterizados en los pasajes tempranos (1 a 4).
RT-PCR Análisis mRNA
ARN total fue extraído tal como se publicó anteriormente [21 ]. Las secuencias de los cebadores se indican en los métodos S1.
Funcional AR Mutación de detección por ADE2 reportero de ensayo
Se utilizó un ensayo funcional en la cepa de levadura EJ250 para detectar mutaciones AR [22].
receptor de andrógenos (AR) ensayo de actividad de base de levadura.
Un ensayo de actividad de AR se realiza en la cepa de levadura recombinante EJ250 (MATa ade2-101 his3 leu2-D200-D1 lys2-801 trp1 ura3-D1 -52 URA3: SON-ADE2 [pRS /AREAde2]) se utilizó para muestras tumorales detección de mutaciones AR como se describe anteriormente [22], [23]. En esta cepa de levadura EJ250, la expresión del gen informador ADE2, necesario para la biosíntesis de adenina, se colocó bajo el estricto control de un promotor dependiente de andrógenos [22]. En consecuencia, el crecimiento de levadura EJ250 se basa en la actividad transcripcional de un receptor de andrógenos ligando-activado. Después de la transformación con un plásmido de expresión de AR como se describe anteriormente [22], la levadura se sembraron en medios selectivos empobrecido de la adenina y que contiene ya sea la dihidrotestosterona (DHT), dehydroepiandrostenedione, β-estradiol, progesterona, 17a-hidroxiprogesterona, flutamida o acetato de ciproterona (Sigma Aldrich , St Quentin Fallavier, Francia) a la concentración indicada. También se incluyeron un control negativo (vehículo) y un control positivo (complementado con adenina). Cuando se aplica a muestras de tumores, las variantes mutadas AR se pueden distinguir de AR de tipo salvaje en función de su respuesta a los esteroides o molécula no esteroideo añadido en el medio.
Detección de receptor de andrógenos (AR) mutaciones en muestras de tumores.
En pocas palabras, el ARN total fue preparado a partir de muestras de tumores (RNeasy Midi Kit, Qiagen, Courtaboeuf, Francia). La transcripción inversa se realizó con el kit de transcripción inversa Omniscript (Qiagen) a partir de 1 g de ARN total. AR fragmentos de ADNc fueron amplificados con el delantero (5'-TGCGGCGGCGCAGTGCCGCTAT-3 ') (nucleótidos 2310-2339) e inverso (5'-GGTGCCATGGGAGGGTTAGATAGGGAG-3') (nucleótidos 4.075-4.101) cebadores que flanquean los exones 1-8 (GenBank NM_000044. 2, los nucleótidos 2310-4101). A partir de entonces, 100 ng fragmentos AR cDNAs se insertan en una expresión de levadura "reparación brecha" plásmido por recombinación homóloga, y después de la siembra y de la incubación a 30 ° C durante 72 h, las colonias de levadura se obtuvo [22]. El AR de tipo salvaje Se sometió a ensayo en paralelo como control experimental. El andrógeno crecimiento de la levadura dependiente del receptor en respuesta a los esteroides o antiandrógeno añadido al medio de colonias se evaluó mediante la puntuación. Los datos se presentan como histogramas correspondientes a la relación del número de colonias de levadura marcados con el número de colonias obtenidas en presencia de 100 nM DHT. Para mutaciones AR caracterización, el plásmido de expresión de AR fue rescatado de células de levadura para la secuenciación. Brevemente, las levaduras se lisaron con 150 a 212 micras perlas de vidrio lavados con ácido (Sigma Aldrich) y el ADN plasmídico se extrajo con el plásmido kit Nucleospin (Macherey-Nagel, Hoerdt, Francia) y se procesaron para secuenciación (GATC Biotech AG, Konstanz, Alemania ).
Expresión de proteína analizados por Western Blot
AKT, fosfo-AKT (S473), ERK1 /2 (Cell Signaling Technology, Ozyme, Saint Quentin en Yveline, Francia) y PSA ( Dako) se utilizaron en 1:1000. Her-2 /neu (Señalización Celular), AR (Upstate, Millipore, Saint Quentin en Yveline), y p-ERK1 /2 (sistemas RnD, Lille, Francia) se utilizaron en 1:500. Anti-beta-actina se utilizó en 1:5000 (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francia). Los protocolos se detallan en Métodos S1.
Hibridación Genómica Comparativa matrices
procedimiento se publicó anteriormente [24]. Se realizó co-hibridación entre el ADN extraído de las variantes de IA y los de PAC120p47. Se identificaron alteraciones mínimas comunes [25]. La agrupación jerárquica se realizó en perfiles basados en regiones mínimas. distancia euclidiana se utilizó como medida de similitud y el algoritmo de Ward, como el método de aglomeración. La separación en grupos fue propuesto sobre la base de la estructura del dendrograma.
Histología
microscopio óptico estudios histológicos utilizados en formol-4 micras de espesor secciones incluidas en parafina fijadas de PAC120, PAC120 tumores residuales y AI variantes teñidas con hematoxilina y eosina Safran.
Análisis estadístico
Se utilizó la prueba de Mann-Whitney, de Kaplan-Meier gráficos de supervivencia, log-rank pruebas, y la prueba exacta de Fisher, según a los respectivos experimentos como se detalla en Métodos S1.
resultados
en vivo
de respuesta al tratamiento hormonal regímenes
castración continua por degarelix detenido el crecimiento de todos PAC120 tumores. No se observaron recidivas en 8/20 ratones, en una demora media de 274 días [rango de 211 a 323] (Figura 1A). castración intermitente se ensayó de acuerdo con el siguiente protocolo: La primera administración de degarelix reduce el volumen del tumor en todos los animales (14/14, 100%). La segunda administración se administra una vez volvía a crecer tumor de dos veces en el volumen, en una demora media de 119 días. Seis tumores tales tratados no respondió (6/14, 43%) y 8 mostraron una baja respuesta o estabilización. El análisis de Kaplan-Meier mostró un aumento del riesgo relativo de recurrencia de 14,5 (IC del 95%: 2,98 a 70,9,
p Hotel & lt; 0,001, prueba de log-rank) (Figura 1 y Tabla S2). Por lo tanto, el bloqueo androgénico intermitente aumenta el riesgo de recurrencia y reduce el tiempo de progresión en comparación con la castración continua.
A) Análisis de Kaplan-Meier de supervivencia libre de escapar hormonal después continua (cuadrado blanco, línea continua), intermitente (cuadrado blanco, línea punteada) degarelix, bicalutamida, más degarelix (triángulo negro, línea continua) o flutamida más degarelix (triángulo negro, línea punteada). B) las curvas de crecimiento del tumor como una función del tiempo en el control (cercle blanco, línea continua), bicalutamida (triángulo blanco, línea continua), flutamida (triángulo blanco, línea punteada), degarelix (cuadrado blanco, línea continua), bicalutamida, más degarelix (triángulo negro, línea continua) y flutamida más degarelix (triángulo negro, línea de puntos); C i) PAC120 xenoinjerto [x200], tumor PAC120 residual (300 días) ii) [x100], iii) [x400], AI variantes con características adenoides (iv) [x100], características anficrinos (v) [x200], y características mucosecretant (vi) [x200]
La flutamida o bicalutamida retrasado significativamente el crecimiento del tumor (
p = 0,03
, y
p Hotel & lt; 0,001, respectivamente). (Figura 1B). bloqueo androgénico completo (degarelix además bicalutamida) detenido el crecimiento del tumor en 30 casos tratados, pero se repitió 24 tumores. Las recurrencias ocurrieron antes de lo que después de la castración sola (Tabla S2) con un mayor riesgo relativo de recurrencia (riesgo relativo de 6,55; IC del 95%: 2,41 a 17,8,
p Hotel & lt; 0,001, prueba de log-rank) (Figura 1A y en la Tabla S2). bloqueo androgénico completo con degarelix más flutamida llevó a 8/11 tumores recurrentes y un tiempo medio de la hormona de escape de 253 días [intervalo de 43 a 337] (Tabla S2); aumento del riesgo de recurrencia no fue estadísticamente significativa en comparación con degarelix solo (
p = 0,561
, log-rank test).
histológico y molecular alteraciones asociadas a la Independencia de andrógenos
PAC120 tumores residuales bajo la castración mostraron áreas necróticas, numerosas mitosis y no hay cuerpos apoptóticos (Figura 1C
ii & amp; iii
). Independientes de andrógenos (AI) variantes muestra los cambios histológicos, tales como características de diferenciación mucinosa adenoides, neuroendocrino similar, o (Figura 1C IV-VI). Todas las variantes de AI muestran patrones mixtos, con predominio de diferenciación mucinosa o /y la diferenciación apocrina y numerosas células multinucleadas. Ninguno características son específicas de ningún tipo de tratamiento hormonal en particular
.
La estabilidad cromosómica de los tumores PAC120 a través del tiempo y los pasajes se ha demostrado anteriormente [24]. Estamos co-hibridizada ADN AI con el ADN PAC120 los padres para revelar las nuevas alteraciones. Treinta y cinco regiones mínimas fueron alterados en al menos 5 (20%) del 26 AI variantes estudiadas. Sorprendentemente, ninguna de las alteraciones eran comunes a todas las variantes de IA. Las ganancias y pérdidas de copias de genes se detallan en la Tabla S3. Las 26 variantes de AI se agruparon por regiones alteradas en cinco grupos distintos utilizando un análisis de agrupamiento jerárquico (Figura 2). Sin embargo, no encontramos ningún patrón-tratamiento específico de las alteraciones asociadas con las recurrencias (prueba exacta de Fisher y Benjamini y Hochberg corrección para ajustar las múltiples pruebas). Estos resultados muestran que la privación de andrógenos genera una diversidad aleatoria de nuevas alteraciones genéticas pero no patrón específico se podría atribuir al tipo de régimen de tratamiento. Estas alteraciones fueron adquiridos de manera estable (datos no mostrados).
No hubo relación entre las alteraciones del número de copias de genes y el tipo de tratamiento hormonal. La columna de la izquierda indica numerada AI variantes mediante tratamiento donde
de
denota degarelix,
de-un
degarelix más antiandrógeno (bicalutamida o flutamida),
de-t
degarelix plus trastuzumab. colores verdes y rojos corresponden a pérdidas y ganancias de número de copias del gen, respectivamente. Amarillo corresponde ausencia de diferencia en términos de número de copias de genes entre las variantes de IA y el ADN PAC120 los padres.
AR
se observó amplificación de genes en el 15% (4/26) de la IA variantes y se produjo sólo en la IA deriva después del bloqueo completo (aide-a) grupo (Tabla S3). La frecuencia de la amplificación del gen después de bloqueo androgénico completo fue significativamente mayor que después de la castración sola (
p =
0,01, prueba exacta de Fisher). En estos casos AR niveles de mRNA se aumentaron de 10 a 20 veces, al igual que los niveles de ARNm de PSA intratumoral (Figura S2).
AR
mutaciones se detectaron utilizando un ensayo basado en la levadura funcional como descrito anteriormente [22]. Sin funcionales
AR
se encontraron mutaciones en el tumor PAC120 pero aparecieron en el 28% (10/36) de los tumores variantes de AI. Un ejemplo del perfil que hemos obtenido para Aide-A4 se muestra en la Figura S3. Las mutaciones se produjeron en 46%, 17% y 25% después del bloqueo completo, antiandrógenos y degarelix, respectivamente (Tabla S4). AR cDNA secuenciación reveló 30 diferentes
AR
mutaciones (Figura 3, Tabla 1), de los cuales el 70% se localizaron en la región bisagra (HR) o en el dominio de unión a ligando (LBD), el 27% dio lugar a una AR proteína truncada. Algunas variantes de AI muestra varias mutaciones. Sólo Q693X era común a todos los diferentes tratamientos hormonales. La mutación Q693X, así como los otros codones de parada prematura de la Tabla 1, conduce a una variante AR truncada que carece del dominio de unión a ligando y AF-2. La variante Q693X AR también se ha detectado en tumores de cáncer de próstata humano (datos no publicados). AR variantes truncadas demuestran transcripcional actividades constitutivos como se informó anteriormente [23]. Ellos han sido asociados con la castración-resistencia, ya que pueden promover el crecimiento de células de cáncer de próstata en cultivos de células in vitro y modelos animales de tumores en ausencia de andrógenos (Figura S4). La mayoría de las mutaciones eran novedosos.
completa subraya muestran mutaciones encontradas en más de un tumor tratado con el mismo agente. Las mutaciones que aparecen con un fondo azul, verde o rojo se han descrito previamente en PAIS, CAIS y CP, respectivamente.
El nivel de proteína AR (normalizado por actina) se incrementó en todas las variantes AI (Figura 4). Estos datos sugieren que las alteraciones AR son acontecimientos clave en la recurrencia del tumor después de la privación de andrógenos, necesarios para la supervivencia de células de cáncer de próstata.
actina se utilizó como control para la proteína de carga. B) Histogramas que representan la cuantificación de AR, Her-2 /neu y proporciones de pAKT /AKT y pERK /ERK normalizado a la actina y la media de PAC120 procedentes de varios pasajes (expresado unidades arbitrarias). AR (barras negras) se expresó en PAC120 y variantes todas AI y Her-2 /neu (barras grises de puntos) se sobreexpresa en todas las variantes de AI. De cualquier p-AKT /AKT (barras grises con línea continua) o Perk /ERK (barras blancas) se activaron en las variantes de la influenza aviar. Las abreviaturas utilizadas para identificar las variantes se explican en la leyenda de la Figura 2.
proteína HER-2 /neu se sobreexpresa en todas las variantes AI (
n =
17) ensayado en comparación con PAC120 (Figura 4). Además, AKT o ERK1,2 o ambas vías se activaron en la mayoría de las variantes de IA, mostrando que una activación de este tipo se asocia con el escape a la privación de la hormona, y participa mecanismos de compensación de la activación de AR. El papel clave de estas vías de fosforilación se demostró indirectamente por el fuerte efecto de su inhibición.
Efectos de la castración Combinación con inhibidores de tirosina cinasa
El degarelix combinado con trastuzumab significativamente y reduce drásticamente el riesgo relativo de recurrencia de 0,17 (IC del 95%: 0,04-0,67,
p = 0,005
, prueba de log-rank) (Figura 5), y se prolongó el tiempo medio para la hormona de escape de 274 a 351 días (Tabla S2) frente la castración con degarelix solo. Se observó recurrencia del tumor en sólo el 17% (4/24) de los animales que recibieron el tratamiento combinado. Trastuzumab como agente único no tuvo efecto sobre el crecimiento del tumor.
curvas B) de crecimiento tumoral como una función del tiempo en el grupo de control (cercle blanco, línea continua) y en los grupos que recibieron everolimus 2 mg /kg tres veces a la semana (forma de diamante blanco, línea punteada), degarelix 10 mg /kg mensual (cuadrado blanco, línea continua), trastuzumab más degarelix (cruz, línea continua) o everolimus más degarelix (negro con forma de diamante, línea continua).
el degarelix combina con everolimus previno completamente la hormona de escape de los 17 tumores tratados. A medida que el crecimiento del tumor retardado everolimus agente único y los TGI
36 días fue del 59% (
p = 0,001
, Mann-Whitney) (Figura 5B).
Estos resultados demuestran un superior efecto de la castración cuando se combina con HER-2 /neu anticuerpos o inhibidor de mTOR orientación.
Discusión
Hemos llevado a cabo un
in vivo
estudio experimental del efecto de diferentes tratamientos hormonales en el riesgo de escape de la hormona. Establecimos una gran serie de variantes de AI para estudiar la diversidad de eventos genéticos y moleculares que ocurren después de la fuga de la hormona. Hemos utilizado un xenoinjerto humano dependiente de hormonas CaP (PAC120) [19]. PAC120 deriva directamente de un tumor primario de un paciente. PAC120 mostró golpear la estabilidad del cariotipo, mantiene la dependencia hormonal estable [24] y la falta de
AR
mutaciones, después de varios pasajes [19].
continua detenciones castración farmacológica crecimiento del tumor, los escapes se producen en el 40% de los casos. monoterapia antiandrógeno se ralentizó el crecimiento del tumor. Esto refleja las observaciones clínicas. En nuestro modelo, el bloqueo androgénico completo aumenta el riesgo de escape hormonal, en comparación con la castración sola. Parece que el bloqueo androgénico completo ejerce una alta presión sobre la vía de señalización de AR, lo que lleva a la activación de varias vías de supervivencia. Los grandes estudios aleatorizados y meta-análisis mostraron que el bloqueo completo no prolongó el tiempo hasta la progresión en la mayoría de los pacientes [26]. Fase II y III de los estudios que comparan intermitente en comparación con la castración continua en el cáncer de próstata se asociaron con un mayor riesgo de escape de la hormona en el caso de la castración intermitente, pero la supervivencia general no se acortó después de la privación androgénica intermitente en comparación con un programa continuo con una mejor calidad de vida y menos coste [27], [28]. La discrepancia con nuestros datos podría explicarse por la agresividad de PAC120 (Gleason 9), mientras que los estudios clínicos incluyen una gran diversidad de tumores de próstata de bajo y alto grado. Más, la hora elegida para reiniciar el tratamiento se basa en un parámetro unic, el volumen del tumor, es decir, mientras que en la clínica se consideran varios parámetros (testosteronemia, PSA). terapia intermitente podría no ser adecuado para todos los casos de cáncer de próstata.
cambios biológicos
AI variantes representada. La histología de los tumores menores de la castración mostró numerosas mitosis y áreas de necrosis, lo que sugiere un equilibrio entre la mitosis /supervivencia celular /muerte y descartando cualquier estado latente del residuo tumoral. AI variantes muestra patrones mixtos, mucinosos o /y la diferenciación apocrina similares al tumor parental y ninguno cuenta específica para la modalidad de tratamiento hormonal.
comprobó que el cariotipo profundamente alterada de PAC120 permaneció bastante estable a través del trasplante y el tiempo [24 ], y demostramos que la castración dio lugar a una ola de nuevas alteraciones genómicas. Además, estas alteraciones adquiridas son estables (datos no mostrados) tal que explican por qué la independencia de la hormona fue adquirido de forma irreversible. Sorprendentemente ninguno de los nuevos alteraciones eran comunes a las 26 variantes de AI. La inestabilidad genética es conocido por estar relacionado con la progresión del cáncer, nuestra observación sugiere un mecanismo tal progresión [29], [30]. A continuación, se realizaron búsquedas de alteraciones que implican la expresión del RA, la amplificación de genes o mutaciones genéticas.
amplificaciones de genes AR
, se detectaron después de bloqueo androgénico completo tal como se encuentra en los pacientes [31].
AR
mutaciones que contribuyen a la fuga hormona proporcionando una receptividad mayor de AR a otros ligandos [8], afectar a varios procesos AR-dependientes [2], [32]. Steinkamp
et al.
Informado de que las muestras tumorales CaP hormonas ingenuo tenían muy pocos
AR
mutaciones que sugieren que estas mutaciones ofrecieron poca ventaja de crecimiento y eran de hecho al azar "pasajeros" mutaciones [33]. El ensayo se utilizó específicamente selecciona para
AR
mutaciones que afectan a la función del receptor [22]. Se ha observado una gran diversidad de privación de andrógenos inducidas por la terapia
AR
mutaciones, aunque muy pocos eran comunes a todas las variantes de AI y la mayoría no se han descrito [34]. En total, las variantes de AI ilustran la diversidad putativa de eventos biológicos asociados con la hormona de escape y subrayaron que un control AR-dependientes sigue siendo central en los cánceres de próstata. nuevos enfoques terapéuticos dirigidos a las vías AR mediante la inhibición de ya sea la liasa 17-20 o la translocación del receptor hacia el núcleo subrayados este punto clave [1]. Nuestro último conjunto de datos es otra alternativa de bloquear las vías de AR que podrían tratarse en clínicas.
Hemos examinado Her-2 /neu y la expresión de p-AKT en PAC120 AI variantes para determinar si la quinasa y la fosforilación de las vías estaban involucrados en el escape de la hormona, como se muestra por otros [15], [18]. En las muestras clínicas, Her-2 /neu expresión fue elevado en los tumores de IA [14], [35] y se expresa como un evento temprano en la dependencia de andrógenos a la independencia interruptor [36]. El mecanismo propuesto para el papel de Her-2 /neu en la fuga de la hormona es que esta quinasa activa la fosforilación de AR (a través de la vía MAPK o vía de AKT) [18], [37], que a su vez mantiene la integridad de AR y, por tanto, su función en ausencia de testosterona. Lin HK et al., Mostró que PI (3) K /Akt, pero no PI (3) vía de señalización de K /p70S6K puede modular la transactivación AR. Mediante el uso de Herceptin, bloqueamos la PI (3) K vía ascendente que podría explicar la reducción de la fuga del tumor [38].
Otras alteraciones pueden contribuir a una activación independiente de ligando de AR. La pérdida de PTEN, la mutación PI3K, AKT1 y amplificación AKT2 puede activar AKT quinasa. se detectó aumento de los niveles de fosfo-AKT en bicatulamide tratados con CaP [39]. En nuestras variantes de AI, Her-2 /neu y la expresión /activación de p-AKT se incrementó y el efecto preventivo de trastuzumab- o everolimus- degarelix tratamientos combinados de escape de la hormona demuestra su papel clave. HER-2 /AKT y mTOR vías son objetivos accesibles a nuevos inhibidores; trastuzumab ha demostrado su eficacia en Her-2 /neu cáncer de mama-amplificado [40]. Wang et al demostraron en línea celular de cáncer de próstata que la inhibición de mTORC1 y AR vías por una combinación de rapamicina y bicatulamide condujo a la apoptosis y podría ser un valor terapéutico en el tratamiento del cáncer de próstata [41]. Un estudio reciente mostró en LNCaP y un experimento a corto plazo en beneficio del bloqueo de la señalización AR en combinación con los mTOR [42]. Nos informan de que se requieren estos agentes en combinación con castración reducido en gran medida la independencia de andrógenos, la co-administración. Además, un fuerte apoyo provienen de un estudio en el everolimus combina con una mejoría en la supervivencia libre de progresión inhibidor de la aromatasa en pacientes con cáncer de mama avanzado con receptores hormonales positivos previamente tratados con inhibidores de la aromatasa no esteroides [43].
Nuestros datos confirmar que AR sigue siendo un actor central en la supervivencia celular CaP, y nuestros datos sugieren que los receptores de andrógenos puede ser activado por vías alternativas que resultan en la independencia de andrógenos. Por último, hemos demostrado que el tratamiento combinado de la castración con la terapia molecular dirigida reduce significativamente el riesgo de escape de la hormona. Este estudio podría tener una gran implicación en el tratamiento del cáncer de próstata dependiente de andrógenos y la inhibición dual vale la pena explorar en el ámbito clínico.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Representación esquemática de los
in vivo
regímenes de tratamiento.
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figura S2.
expresión relativa del mRNA de receptor de andrógenos (AR) (barras negras) y específico de la próstata intratumoral antígeno (PSA) (barras blancas) en independientes de andrógenos (AI) variantes. * Indica variantes con amplificada
AR
número de copias del gen. Las abreviaturas utilizadas para identificar las variantes se explican en la leyenda de la Figura 2.
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Figura S3. perfil de respuesta de la hormona
en el tumor resistente a la castración Aide-A4. La capacidad de respuesta de la AR en el tumor resistente a la castración AIDE-a4 se evaluó usando el ensayo funcional basado en la levadura y se compara con la de la AR de tipo salvaje como se describe en Material y Métodos. Los histogramas representan las respuestas aberrantes obtenidos con 100 nM de β-estradiol (E2) y 1 mM de acetato de ciproterona (CPA) en comparación con el AR de tipo salvaje
doi:. 10.1371 /journal.pone.0042252.s003 gratis (TIF )
figura S4.
La actividad constitutiva de la variante del receptor de andrógenos Q693X. La mutación sin sentido Q693X conduce a una variante truncada del receptor de andrógenos, que se elimina de todo el dominio de unión a ligando y AF-2.