Extracto
Antecedentes
El cáncer de páncreas es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en los países occidentales, con la tasa de supervivencia a 1 año más bajo entre los comúnmente cánceres diagnosticados. biomarcadores fiables para el diagnóstico de cáncer de páncreas faltan y se necesitan con urgencia para permitir la cirugía curativa. Como microARN (miARN) surgió recientemente como biomarcadores candidatos para esta enfermedad, hemos explorado en el presente estudio piloto de las diferencias en los perfiles de microARN salivales entre los pacientes con tumores pancreáticos que no son candidatos a la cirugía, lesiones precancerosas, enfermedad inflamatoria o sin cáncer pacientes, una potencial herramienta de diagnóstico precoz.
Métodos
Dichas muestras procedentes de pacientes con cáncer de páncreas (n = 7), pancreatitis (n = 4), TPMI (n = 2), o controles sanos (n = 4) se obtuvieron durante el examen endoscópico. Después del aislamiento de ARN total, la expresión de miRNAs 94 candidatos se proyectó por q (RT) PCR utilizando Biomark Fluidgm. las células de cáncer de páncreas humano derivado eran xenoinjerto en ratones atímicos como modelo experimental de cáncer de páncreas.
Resultados
identificado hsa-miR-21, hsa-miR-23a, HSA-miR 23b y miR-29c como siendo significativamente upregulated en la saliva de los pacientes de cáncer de páncreas en comparación con el control, que muestra la sensibilidad de 71,4%, 85,7%, 85,7% y 57%, respectivamente y excelente especificidad (100%). Curiosamente, hsa-miR-23a y HSA-miR23b se sobreexpresa en la saliva de pacientes con lesiones precursoras de cáncer de páncreas. Se encontró que hsa-miR-210 y let-7c se sobreexpresa en la saliva de los pacientes con pancreatitis en comparación con el grupo control, con una sensibilidad de 100% y 75%, y la especificidad de 100% y 80%, respectivamente. Última hsa-miR-216 se upregulated en pacientes con cáncer en comparación con los pacientes con diagnóstico de pancreatitis, con una sensibilidad de 50% y especificidad de 100%. En modelos experimentales de PDAC, detección de microARN salival precede a la detección sistemática de marcadores células cancerosas.
Conclusiones
Nuestros nuevos hallazgos indican que la saliva miARN son discriminatorias en pacientes con cáncer de páncreas que no son candidatos a la cirugía. Además, se demuestra en modelos experimentales que salivales detección de miRNA precede a la detección sistemática de marcadores células cancerosas. Este estudio se deriva del uso de la saliva miARN como biomarcador para el diagnóstico precoz de los pacientes con cáncer de páncreas resecable
Visto:. Humeau M, Vignolle-Vidoni A, Sicard F, F Martins, Bournet B, Buscail L, et al. (2015) salival microARN en el cáncer pancreático pacientes. PLoS ONE 10 (6): e0130996. doi: 10.1371 /journal.pone.0130996
Editor: Kandiah Jeyaseelan, Universidad Nacional de Singapur, SINGAPUR
Recibido: Diciembre 10, 2014; Aceptado: 27-may de 2015; Publicado: 29 Junio 2015
Derechos de Autor © 2015 Humeau et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
financiación:.. Estos autores no tienen ningún soporte o financiación reportar
Conflicto de intereses: los autores han presentado una patente sobre el "uso de microARN salivales para el diagnóstico de cáncer de páncreas ". Un proyecto ha sido escrito en colaboración con el departamento de propiedad intelectual (INSERM Transfert), y depositado bajo el#EP15305020.8 pero todavía no está disponible en línea. No obstante, esto no altera la adhesión de los autores a todos PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales. Los autores no tienen otras declaraciones relacionadas con el empleo, consultoría, patentes, productos en desarrollo o productos modificados.
Introducción
pancreático ductal adenocarcinoma (cáncer de páncreas, PDAC) es el cuarto líder causa de muerte por cáncer en los países occidentales, con los cinco años más respecto [1] y la supervivencia a 1 año [2] tasas entre los cánceres diagnosticados comúnmente. Se prevé el cáncer de páncreas para pasar a la segunda causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo en 2020, en ausencia de mejoras en el tratamiento [3]. Actualmente no hay medios para el diagnóstico fiable de las primeras etapas de cáncer de páncreas. En consecuencia, la gran mayoría de los pacientes (85%) que se vea una enfermedad avanzada que resulta en una tasa de resección baja (15% de los pacientes) que conduce a una supervivencia media general deprimente de 4 a 6 meses. Por lo tanto, el descubrimiento de biomarcadores para el diagnóstico precoz del cáncer pancreático pueden favorecer la gestión y el pronóstico de los primeros pacientes
.
Los microARN (miRNA) han surgido recientemente como una nueva clase de biomarcadores robustos para el diagnóstico de cáncer, incluyendo PDAC [4]. Estas potentes reguladores de la expresión génica se puede cuantificar a fondo en diversos tejidos y fluidos, debido a su alta estabilidad inherente en comparación con las proteínas y ARN mensajeros. De importancia, miRNAs se puede cuantificar en cantidades muy bajas de material, incluyendo micro-biopsias, y en muestras muy degradadas. Informes recientes ampliamente demostrado que los perfiles de miARN pueden discriminar con éxito normal a partir de tejido pancreático canceroso, y también pueden predecir el pronóstico o la respuesta al tratamiento del cáncer [4]. La estabilidad de miRNAs se ha puesto de relieve una vez más como miARN perfiles en plasma se demostró recientemente para diferenciar pacientes PDAC de controles sanos [4]. Tales hallazgos abren el camino para el uso de miRNAs circulantes como biomarcadores PDAC mínimamente invasivos.
Varios otros fluidos corporales como la orina, semen y saliva se han considerado recientemente como repositorios para el diagnóstico del cáncer [5,6]. La saliva tiene la ventaja superior como la recogida de muestras es simple, no invasiva, causa poca ansiedad por parte de los pacientes y se puede repetir. La saliva se ha demostrado que contienen proteínas /péptidos, ácidos nucleicos, electrólitos, y hormonas que se originan a partir de fuentes tanto locales como sistémicos y estudios recientes han impulsado interés en el uso de saliva como fuente de biomarcadores. De acuerdo con ello, el uso de saliva para la detección de enfermedades orales se ha demostrado ampliamente [7], y la saliva recientemente surgido como una fuente rica de miRNAs, como tiene-miR-31, para el diagnóstico de cáncer oral [8-11]. Por otro lado, el uso de saliva para la enfermedad sistémica es en gran medida poco clara. En los últimos años, metabólicas [12], transcriptómica [13] y la microbiota [14] Los perfiles salivales se demostró poseer poder discriminatorio para la detección de PDAC, con una alta especificidad y sensibilidad.
A nuestro entender, el uso de miRNAs salivales para el diagnóstico de cáncer de páncreas no resecable no se ha informado hasta la fecha. En consecuencia, el objetivo de este estudio fue explorar la evidencia científica y proporcionar una justificación para el uso de saliva para la detección PDAC no resecable que representa la gran mayoría de los pacientes diagnosticados con este tipo de cáncer. En este estudio piloto, se encontró que cuatro miRNAs salivales (HSA-mir-21, hsa-miR-23a, hsa-miR-23b y hsa-miR-29c) de los pacientes PDAC correctamente segregados de los donantes libres de cáncer, mientras que hsa-mir -210 y let-7c indican pancreatitis y hsa-miR-216 discrimina pancreatitis por cáncer. Además, se demuestra en el presente documento en modelos experimentales de PDAC que salivales detección de miRNA precede a la detección de células cancerosas marcadores sistémicos. Tomados en conjunto, se presentan datos preliminares que muestran diferencias significativas en los perfiles de miARN entre la saliva de pacientes con PDAC y la saliva de los pacientes que son libres de tumor. Los biomarcadores descubiertos poseen potencial discriminatorio inherente para una herramienta de diagnóstico no invasivo para el PDAC, en pacientes que no son candidatos a la cirugía.
Materiales y Métodos
Los pacientes
Este protocolo fue aprobado por el Comité ético (
Comité de Protección des Personnes Sud-Ouest et Outre Mer N ° 1 |,
número 10/01/21
). Para evitar la contaminación de la sangre, se pidió a los pacientes que no cepillarse los dientes dentro de los 45 minutos anteriores a la recogida de muestras. La saliva se recogió utilizando puntas estériles y micropipetas durante la exploración endoscópica bajo anestesia general con propofol. La saliva se colocó inmediatamente en tubos pre-refrigerados 1,5 ml de microcentrífuga que contiene y un volumen igual de Saliva proteger reactivo (Qiagen) y se almacenó a -80 ° C hasta que esté listo para su uso. En este estudio piloto, se incluyeron pacientes mayores de & gt; 18 años que habían dado su consentimiento informado por escrito. Otros criterios de inclusión fueron sin contraindicaciones para la anestesia general o la ecografía endoscópica. material de aspiración con aguja fina se utiliza para histológicos, citológicos y moleculares (análisis de mutación KRAS activación [15]) el diagnóstico de pancreatitis o cáncer de páncreas. Veintiún pacientes fueron incluidos en este estudio; 7 fueron diagnosticados con cáncer de páncreas localmente avanzado, no resecable, 4 fueron diagnosticados con pancreatitis (aguda o crónica) y 4 tenían enfermedades digestivas no relacionados (grupo control) (Tabla 1). Los pacientes con diagnóstico de neoplasia intraductal papilar mucinoso (IPMN) (n = 2) también fueron incluidos. Los pacientes no fueron tratados antes de la recogida de saliva.
Protocolo experimental
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices éticas nacionales para la investigación y el protocolo experimental fue aprobado por el comité de ética regional de Anexplo UMS 006 para la experimentación animal y se llevaron a cabo de conformidad con la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio (Institutos nacionales de Salud de Estados Unidos). PACA-2 células Mia derivados del cáncer pancreático humano que expresan secretada Lucia luciferasa [16,17] se cultivan en medio RPMI suplementado con 10% de suero fetal de ternera, L-glutamina, un antibiótico, un cóctel antimicótica (Life Technologies), y Plasmocin ( InvivoGen) en un incubador humidificado a 37 ° C en 5% de CO
2. Seis de dos semanas de edad /nu hembra nu se anestesiaron por inyección intraperitoneal de pentobarbital (80 mg /kg) diluido en 0,9% de NaCl, complementada con anestesia oral usando oxígeno /isofluorano (2,5 mezcla) y PACA-2 células Lucía Mia se implantaron en la cola del páncreas como se ha descrito anteriormente [16,17]. la secreción de la saliva no se vio estimulado por la pilocarpina. La saliva se obtuvo de la cavidad oral por micropipeta y se colocó inmediatamente en pre-refrigerados tubos de 1,5 ml de microcentrífuga que contiene y un volumen igual de Saliva proteger reactivo (Qiagen). Collection se completó en 20 minutos y las muestras se almacenaron a -80 ° C hasta su análisis. Para el seguimiento no invasivo de crecimiento del tumor, la sangre se muestreó por colección retro-orbital y se centrifugó a 1.000 ×
g
durante 10 min en tubos de microcentrífuga tratados con EDTA. producción Lucia se midió en 5μl de plasma usando coelenterazina (50 micras) como sustrato. Para los estudios de cuantificación miARN, los tumores fueron congelados en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. Al final de los experimentos, los ratones se mataron mediante la inyección de una dosis letal de pentobarbital.
ARN extracción
Antes de que se utilizan muestras de saliva, que se descongelaron en hielo y se centrifugaron durante 15 minutos a 2600 x
g
a 4 ° C. El sobrenadante libre de células se recogió a partir del sedimento y se usó inmediatamente en la siguiente etapa. ARN total fue aislado de 250 l sobrenadante de la saliva y los tumores utilizando reactivo Trizol LS (Life Technologies) y el kit de extracción de miRNAeasy (Qiagen), respectivamente. DNasa I tratamiento (DNasa I, Qiagen) fue utilizado para eliminar la contaminación de ADN durante la extracción de RNA. La concentración de ARN total se midió usando Nanodrop N-100.
miARN cuantificación
salival total, ARN celular o tumor (20 ng) se sometió a transcripción inversa y pre-amplificado utilizando el kit de síntesis de ADNc universal (Exiqon), seguido de la amplificación de la diana específica (STA) utilizando TaqMan PreAmp Master Mix (Life Technologies) y se agruparon 94 microARN LNA PCR conjuntos de cebadores (Exiqon, que se enumeran en la Tabla S1). Después de 15 ciclos pre-amplifaction, reacciones STA se diluyeron 1:10 en agua libre de nucleasa. qPCR Ensayo mezcla consistió en la expresión TaqMan genes Master Mix (Life Technologies), ADN de fijación de colorante de carga de muestras Reactivo (Fluidigm), EvaGreen (BioRad), de avance y retroceso mezcla de cebadores (Exiqon) y Ensayo de Carga de reactivos, y preparado según las recomendaciones del fabricante . Las muestras y la muestra de la mezcla se cargó en un chip Fluidigm (Fluidgm) y la reacción de PCR cuantitativa en tiempo real se realizó a 95 ° C durante 10 minutos, seguido de 30 ciclos a 95 ° C durante 10 segundos y 60 ° C durante 1 minuto en el Fluidigm plataforma (Fluidgm). El valor del ciclo de cuantificación (Cq) se define como el número de ciclo en la emisión de fluorescencia, que supera a la de un umbral fijo. Un Cq de 15 a 30 se considera alta expresión y un Cq de 35 se considera baja expresión. Un valor Cq más de 40 se considera como indetectable miARN. La normalización de datos se realizó mediante el administrador de RQ 1.2.1 y datos de contribución v3.0 de Applied Biosystems.
El análisis estadístico
Los valores de expresión génica basada en qPCR entre los diferentes grupos se compararon mediante la no paramétrico Wilcoxon la suma de rangos. miRNAs Candidato biomarcadores fueron seleccionados sobre la base de P & lt; 0.05
Resultados
Identificación de páncreas cáncer-específica miRNAs salivales
En este estudio piloto, 94 miRNAs fueron seleccionados de la literatura de la siguiente manera:. Biomarcadores previamente reportados para el cáncer, biomarcadores previamente reportados para el cáncer de páncreas, que se detectó en la sangre de pacientes con cáncer o detectado en la saliva de los pacientes con cáncer (S1 tabla). La expresión de miRNAs candidatos se proyectó por q (RT) PCR utilizando Biomark Fluidgm en pacientes con cáncer de páncreas (n = 7), pancreatitis (n = 4), intraductal neoplasia mucinosa papilar (TPMI, n = 2) o sin cáncer (n = 4) (Tabla 1).
de los 94 miRNAs, 23 miRNAs fueron indetectables en todas las muestras analizadas (S2 Tabla). Se encontró que 4 miRNAs (HSA-mir-21, HSA-miR23a, hsa-miR-23b y hsa-miR-29c) se expresaron de manera significativa en la saliva de pacientes con cáncer de páncreas (n = 7), mientras que no detectable en la saliva de pacientes de control (n = 4; prueba de Wilcoxon, 0,001 & lt;
p
& lt; 0,03) (Fig 1 y la Tabla 2). La expresión de los miRNAs candidatos era estrictamente específico de cáncer pancreático (100%) con una excelente sensibilidad (que van desde 57% a 86%, Tabla 2). Los miRNAs candidatos también se detectaron en la saliva de los pacientes diagnosticados con otros tipos de cáncer (n = 2, Tabla 2), mientras que hsa-miR23a y hsa-miR-23b se detectaron en la saliva de los pacientes diagnosticados con IPMN, una lesión precursora bien caracterizado del PDAC. Es de destacar que hsa-miR-21, HSA-miR23a, hsa-miR-23b y hsa-miR-29c se pudo detectar en la saliva de los pacientes con pancreatitis (figura 1).
Los resultados se presentan como las barbas caja (mín-máx) y la media (+) se indica. El
valor de p gratis (no paramétrico de Wilcoxon la suma de rangos) se indica.
La pancreatitis es una inflamación del páncreas común. A pesar de modernas técnicas de imagen, persisten las dificultades para diferenciar PDAC por enfermedades benignas tales como la pancreatitis crónica, especialmente en su forma seudotumoral [15]. Tal consideración es crítica para evitar la resección innecesaria de lesiones benignas (tales como lesiones focales de la pancreatitis crónica o pancreatitis autoinmunitaria) o retrasar el tratamiento de PDAC en un subconjunto de pacientes. Hemos demostrado anteriormente que las firmas de ARN [18] o
KRAS
análisis de mutación [15,19] puede ser útil para el diagnóstico. En el presente trabajo, hemos explorado si salival miARN puede representar un método de cribado no invasivo para la detección de la pancreatitis. Se encontró que la saliva hsa-miR-216 puede ayudar a discriminar la pancreatitis del PDAC, con una excelente especificidad (100%), pero con baja sensibilidad (50%) (Tabla 3). Por otro lado, hsa-miR-210 y let-7c se sobreexpresa en la saliva de los pacientes con diagnóstico de pancreatitis, pero no se pudieron detectar en la saliva de los pacientes de control (Tabla 4). Además, hsa-miR-210 presenta notable especificidad y sensibilidad para la pancreatitis, ya sea crónica o aguda (100%, Tabla 3). Por otro lado, hsa-miR-210 se detectó en la saliva de los pacientes con PDAC. Tomados en conjunto, nuestro estudio piloto sugiere fuertemente que los miRNAs salivales podrían ser útiles para el diagnóstico de la pancreatitis y la PDAC no resecable.
miRNAs salivales preceden a base de proteínas, detección sistémica de PDAC en modelos experimentales
a continuación se investigó la cinética de la saliva de detección de miRNA en el modelo experimental de cáncer de páncreas. Mia PACA-2 humano derivado de células de cáncer pancreático se implantaron en el páncreas de ratones atímicos (n = 6). Se encontró que estas células y xenoinjertos resultantes expresan altos niveles de hsa-miR-21, hsa-miR-23a, hsa-miR-23b y hsa-miR-29c (S3 y S4 Tablas). Estas células fueron diseñadas para expresar altos niveles de luciferasa secretada de la proteína,, monitorización de tumores no invasivo basado en sistémica [16,17]. tumores de cáncer de páncreas experimentales se detectaron 25 días después de injerto de células tumorales usando la dosis sistémica de luciferasa secretada y antes de que se hicieron palpable (Fig 2).
resultados son la media ± S.D. de 6 repeticiones biológica realizado por triplicado experimentales. los niveles de miRNA se expresan en Cq, los niveles de Lucía se expresan en unidades relativas de luz (r.l.u.). La zona gris corresponde a la detección de tumores usando secretada Lucia como marcador tumoral sistémica, a base de proteínas.
Curiosamente, hsa-miR-21 se detectó fácilmente en altos niveles en saliva de los ratones portadores de tumores, tan pronto como 14 días después de la inducción del tumor (media Cq = 24.41 ± 1.29 Fig 2 y Tabla S5), mientras que no detectable en la saliva de animales libres de tumor (datos no mostrados). Además, salival hsa-miR-21 expresión permaneció elevada durante el curso del experimento (Fig 2). Por otra parte, se detectaron salival hsa-miR-23a, hsa-miR-23b y hsa-miR-29c en niveles bajos en la saliva de los ratones portadores de PDAC (Figura 2 y Tabla S5). Por lo tanto, nosotros confirmamos hsa-miR-21 como un biomarcador salival en este modelo experimental de PDAC; Además, nuestros resultados sugieren fuertemente que la saliva miARN son más sensibles que los marcadores de proteínas sistémicos para el diagnóstico de los tumores pancreáticos.
Discusión
Un tema importante en la investigación del cáncer de páncreas es la necesidad de biomarcadores para la primera diagnóstico, no sólo para la detección precoz de la enfermedad en cohorte de pacientes, sino también para acelerar la toma de masas pancreáticas difíciles de diagnosticar decisión. Esto es extremadamente importante teniendo en cuenta que la supervivencia y el pronóstico de los pacientes dependen de la etapa del tumor en el momento del diagnóstico. En teoría, el diagnóstico precoz puede permitir la resección del tumor y por lo general se asocia con un mejor pronóstico. Sin embargo, la dificultad del diagnóstico precoz y la alta prevalencia de metástasis asociado con el cáncer de páncreas contribuyen a su mal pronóstico [1]. Por lo tanto, en los últimos años han sido testigos de estudio intensivo en la búsqueda de biomarcadores más sensibles, específicos y rentables. Hasta la fecha, se utilizan muchas estrategias, multi-ómicas base molecular para lograr este objetivo. miRNAs tejido se demostraron recientemente como nuevos biomarcadores para el diagnóstico, pronóstico y predicción de respuesta al tratamiento para los pacientes con cáncer de páncreas [4]. Sorprendentemente, estos pequeños ARN no codificantes también se pueden detectar en muchos, si no todos los fluidos corporales [20]. En consecuencia, los genes miARN perfiles en la sangre se demostró recientemente para diferenciar pacientes con cáncer de controles sanos [4], y que circula análisis miRNA han sido cada vez más sugerido como un nuevo biomarcador para el diagnóstico del cáncer de páncreas.
En los últimos años, miRNAs en la saliva humana han demostrado ser biomarcadores potenciales para fines de diagnóstico. Debido a que la colección no es invasivo, no traumático y de fácil acceso, el uso de la saliva para la detección temprana de la enfermedad es ideal. Históricamente, hsa-miR-31 fue uno de los primeros biomarcadores salivales discriminatorias miARN identificados para el cáncer oral [21]. Recientemente, la sobre-expresión de miR-tiene-17 y ha-miR-20a se ha informado de que se asociaron significativamente con un peor pronóstico del carcinoma adenoide quístico salivales [22]. Además, se encontraron 13 miRNAs desregulado significativamente en la saliva de los pacientes de carcinoma de células escamosas orales en comparación con los controles sanos [23]. Por último, los perfiles de miARN salivales difieren en la saliva de pacientes con maligna de la saliva de pacientes con un tumor benigno de la glándula parótida, y por lo tanto representan una nueva herramienta de diagnóstico no invasivo para el diagnóstico de tumores en las glándulas salivales [9]. Durante la redacción de este manuscrito, Xie
et al
describe que la saliva de miR-3679-5p y miR-940, dos miRNAs recién caracterizados que no fueron estudiados en el presente trabajo, pueden ser específicas de los pacientes con resecable PDAC , con especificidad razonable y la sensibilidad [24]. Por otro lado, el uso de saliva para la detección de los genes miARN no se ha evaluado hasta la fecha en pacientes PDAC inoperables que representan la gran mayoría (85%) de los pacientes diagnosticados con este tipo de cáncer.
En la prueba de concepto-presente estudio, hemos recogido la saliva de pacientes con cáncer de páncreas resecable (n = 7), pancreatitis (n = 4), TPMI (n = 2), y los pacientes sin cáncer (n = 4) sometidos a examen endoscópico. De los más de 90 miRNAs ensayadas, 4 fueron identificados como siendo significativamente desregulado en la saliva de los pacientes con cáncer de páncreas en comparación con el control (HSA-miR-21, hsa-miR-23a, hsa-miR-23b y hsa-miR-29c). Además, hsa-miR-21, hsa-miR-23a y hsa-miR-23b eran estrictamente específico para pacientes con cáncer, con una excelente sensibilidad (71,4% y 85,7%, respectivamente). Por otro lado, Let-7c y hsa-miR-210 estaban ausentes en la saliva de los pacientes de control, pero fácilmente detectable en la saliva de los pacientes con pancreatitis, con exquisita especificidad y selectividad (hsa-miR-210).
sin embargo, en esta etapa de este proyecto, la prueba de saliva no pudo diferenciar entre pancreatitis y PDAC, como se detecta hsa-miR-216 sólo en pancreatitis y no en el cáncer, pero con poca sensibilidad. Tomados en conjunto, hemos demostrado por primera vez que salivales miARN son indicativos de enfermedad pancreática y se puede utilizar para diagnosticar PDAC no resecable (HSA-miR-21, hsa-miR-23a, hsa-miR-23b) o pancreatitis (HSA-mir -210). Hsa-miR-21, hsa-miR-23a y hsa-miR-23b se encuentra desregulado de manera significativa en la saliva de los pacientes PDAC resecables en comparación con los controles sanos durante la fase de descubrimiento, pero no se investigó más a medida que no mostraron en menos 4 veces el cambio en la expresión entre los dos grupos [24].
en este trabajo, hemos comenzado a explorar si miRNAs salivales pueden ayudar en el diagnóstico de la población en riesgo de desarrollar cáncer de páncreas, y por lo tanto podría ser utilizado como marcador para prevenir la incidencia de tumores. neoplasmas mucinosos papilares intraductales (IPMNs) son lesiones precursoras no invasivos de cáncer de páncreas. Recientemente, los miRNAs en el líquido del quiste se han demostrado para identificar TPMI de alta calidad que requiere la resección y excluir quistes no mucinosos lo que implica un tratamiento conservador con alta sensibilidad y especificidad [25]. Hemos obtenido resultados preliminares que sugieren que hsa-miR-23a y hsa-miR-23b están también estar presente en la saliva de pacientes con diagnóstico de TPMI, y podría ser utilizado para la toma de decisiones en la gestión TPMI.
Sin embargo, nuestra estudio tiende a indicar que hsa-miR-21, hsa-miR-23a y hsa-miR-23b están presentes en la saliva de los pacientes con pancreatitis, mientras que hsa-miR-210 se detecta en la saliva de una fracción de los pacientes con PDAC . Además, hsa-miR-23a y hsa-miR-23b están presentes en la saliva de pacientes con TPMI. Esto podría explicarse fácilmente como pancreatitis y TPMI son de dos pozos lesiones caracterizadas precursoras PDAC, lo que indica que PDAC positivo para hsa-miR-210, o HSA-miR-23a y hsa-miR-23b, puede haber derivado de la pancreatitis o TPMI, respectivamente. Por el contrario, los pacientes con diagnóstico de pancreatitis y elevados salival hsa-miR-21, hsa-miR-23a y hsa-miR-23b, o pacientes diagnosticados con TPMI y elevado salival hsa-miR-23a y hsa-miR-23b puede ser en riesgo de desarrollar PDAC y pueden requerir cuidado de seguimiento clínico. Somos conscientes de que el presente estudio adolece de dimensionamiento pequeña muestra y requiere una población de validación externa. En consecuencia, hemos constituido recientemente la primera cohorte clínicamente anotado de las muestras de cáncer de páncreas de pacientes de diferentes institutos (la iniciativa BACAP, http://www.chu-toulouse.fr/-projet-bacap-). Tal cohorte será inmensamente informativo para una mayor validación y futura aplicación clínica de este método, ya que representa una fuente única de muestras PDAC, sino también porque es recapitular la "historia natural" de esta enfermedad. Tal cohorte puede ayudar a establecer miRNAs salivales, junto con variables clínicas adicionales, como nuevos biomarcadores para el manejo de pacientes con cáncer de páncreas. Además, todavía tenemos que realizar estudios comparativos entre diferentes pacientes con cáncer para justificar que los biomarcadores que hemos identificado en el presente documento son específicos para el cáncer de páncreas.
En este artículo, hemos identificado hsa-miR-21, HSA-mir -23a y HSA-miR-23b, que se expresaron de forma diferente entre las muestras de saliva de los pacientes con un tumor maligno y pacientes sin cáncer, con una excelente especificidad y sensibilidad. Mientras hsa-miR-21 también se asocia con muchas condiciones fisiológicas incluyendo pero no restringido a las enfermedades cardiovasculares y pulmonares, incluyendo cardiaca y fibrosis pulmonar, así como el infarto de miocardio, pero también con los procesos inmunológicos y de desarrollo [26], hsa-miR-21 es uno de los miRNA más citados en oncología [27], incluyendo el cáncer de páncreas [4]. Hemos demostrado anteriormente que hsa-miR-21 se expresa temprano durante la carcinogénesis pancreática [28], y que la orientación hsa-miR-21 provoca la regresión del tumor en modelos experimentales de cáncer de páncreas [17]. Sorprendentemente, hsa-miR-21 parece estar constantemente regulada en el cáncer de páncreas, y para ser indicativo de una mala supervivencia, respuesta al tratamiento y /o la enfermedad metastásica [4]. Además, un meta-análisis reciente ha demostrado recientemente hsa-miR-21 en lugar de valor pronóstico de diagnóstico en diferentes tipos de cáncer [29] circulante. En el presente estudio, se especula que hsa-miR-21 salival también puede ser de interés para el diagnóstico de cáncer de páncreas, y completar la caracterización previa de la saliva hsa-miR-21 para la detección de cáncer de esófago [10]. A nuestro entender, ofrecemos aquí la primera demostración de que hsa-miR-23a y hsa-miR-23b se pudieron detectar en la saliva de los pacientes con diagnóstico de cáncer; Sin embargo, la especificidad de los dos candidatos a la PDAC miRNAs aún no se ha demostrado. Hsa-miR-23a se ha asociado recientemente con KRAS [30] y C-MYC [31] vía de señalización mediada, y se describe como un candidato de conducción miARN en el cáncer de páncreas [30]. Hsa-miR-23a también ha sido vinculada a la alteración de la citotoxicidad de células NK [32], EMT [33] y la resistencia al tratamiento [34-36]. Curiosamente, hsa-miR-23b se ha demostrado recientemente para regular la autofagia asociado con radioresistance de las células de cáncer de páncreas [37].
A continuación se investigó la cinética de la detección de los miRNAs salivales en un modelo experimental de cáncer de páncreas. Mientras hsa-miR-23a y hsa-miR-23b fueron altamente expresado en xenoinjertos derivados de las células de cáncer de páncreas humano, que eran apenas detectable en la saliva en este modelo de ratones portadores de tumores. Por otro lado, hsa-miR-21 se detectó fácilmente en los tumores y en la saliva de los ratones xenoinjertados con células de cáncer derivadas de páncreas humano, mientras que no detectables en los animales de control. Este último hallazgo sugiere fuertemente que salivales hsa-miR-21 se origina a partir de tumores experimentales, probablemente
a través de
exosomas derivados del tumor, como se ha descrito recientemente [38]. Además, se demuestra en este documento que salivales hsa-miR-21 de detección precede a la detección de marcadores tumorales de células específicas de cáncer en este modelo experimental de PDAC. Esto sugiere fuertemente que la saliva miARN, incluyendo hsa-miR-21, son más sensibles que los marcadores de proteínas de origen sistémicos para el diagnóstico de la PDAC.
Conclusión
En su conjunto, se demuestra en el presente documento para el primera vez que salivales miARN podría ser biomarcadores valiosos para distinguir pacientes con PDAC no resecable de controles sanos, y que la saliva de miR-210 puede ayudar a detectar la pancreatitis. Si bien se necesitan estudios multicéntricos con muestras de mayor tamaño, este trabajo se deriva del uso de la saliva miARN como nuevos biomarcadores para el diagnóstico de PDAC no resecable.
Apoyo a la Información sobre Table S1. miARN cuantificó en este estudio
doi:. 10.1371 /journal.pone.0130996.s001 gratis (XLSX)
Tabla S2. valores miRNAs Cq en toda la saliva de pacientes sin cáncer (n = 4), begning pancreatitis (n = 4), adenocarcinoma de páncreas (n = 7) o IPMN (n = 2)
doi:. 10.1371 /journal.pone. 0130996.s002
(XLSX)
Tabla S3. Candidatos miRNAs valores Cq de Mia PACA-2 células Lucía (n = 3)
doi: 10.1371. /Journal.pone.0130996.s003 gratis (XLSX)
Tabla S4. Los valores candidato miRNAs Cq de n = 6 tumores pancreáticos experimentales (ET) guía doi:. 10.1371 /journal.pone.0130996.s004 gratis (XLSX) sobre Table S5. Los valores de luciferasa secretada y candidato salival miRNAs Cq a partir de n = 6 ratones con tumores pancreáticos experimentales
doi:. 10.1371 /journal.pone.0130996.s005 gratis (XLSX)
Reconocimientos
Los autores desean agradecer a los Dres Geneviève Tavernier y Jean-José Maoret por sus útiles consejos.