Extracto
reciente avance en la tecnología de secuenciación ha permitido perfilado integral de las alteraciones genéticas en el cáncer. Hemos establecido una plataforma de secuenciación que se hayan empleado la tecnología de secuenciación de próxima generación (NGS) para uso clínico, que puede proporcionar datos de mutación y la variación del número de copias. NGS se realizó con la biblioteca de extremo emparejado enriquecido con exones de 183 genes relacionados con el cáncer. pares de tejidos normales y tumorales de 60 adenocarcinomas colorrectales se utilizaron para probar la viabilidad. Se analizaron mutación somática y la alteración del número de copias. Un total de 526 somáticas variaciones de la secuencia no sinónimas se encontraron en 113 genes. Entre éstos, 278 variaciones de nucleótidos individuales eran 232 mutaciones puntuales somáticas diferentes. 216 SNV eran conocidos 79 polimorfismos de nucleótido único en el dbSNP. 32 indeles fueron 28 indel mutaciones diferentes. La mediana del número de genes mutados por el tumor fue de 4 (rango 0-23). el aumento de número de copias (& gt; pliegue X2) se encontró en 65 genes en 40 pacientes, mientras que la copia número pérdida (& lt; x0.5 veces) se encontró en 103 genes en 39 pacientes. Los genes más frecuentemente alterado (mutación y /o alteración del número de copias) fueron
APC
en 35 pacientes (58%),
TP53
en 34 (57%), y
KRAS
en 24 (40%). lista de genes alterados reveló ErbB vía de señalización como la vía más comúnmente involucrados (25 pacientes, 42%). plataforma de secuenciación que se hayan empleado la tecnología NGS es factible para uso clínico y proporciona datos completos de alteración genética
Visto:. Han S-W, Kim H-P, Shin J-Y, Jeong E-G, Lee W-C, Lee K-H, et al. (2013) La secuenciación dirigida de genes relacionados con el cáncer en el cáncer colorrectal Uso de secuenciación de próxima generación. PLoS ONE 8 (5): e64271. doi: 10.1371 /journal.pone.0064271
Editor: Noam Shomron, Universidad de Tel Aviv, Israel
Recibido: 18 de febrero, 2013; Aceptado: April 10, 2013; Publicado: 21 de mayo de 2013
Derechos de Autor © 2013 Han et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por una beca de la coreana Healthcare Technology R & amp; D del proyecto, Ministerio de Salud, Bienestar & amp; Asuntos de la Familia, República de Corea (A091081). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores desean declarar que Jong-Yeon Shin y Kim Jong-Il, son consultores para Psoma Terapéutica y Jeong-Sun Seo es un consultor para Macrogen. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
múltiples eventos genéticos se acumulan durante la progresión de la carcinogénesis colorrectal [1]. Hay un número de subtipos moleculares de cáncer colorrectal incluyendo inestabilidad de microsatélites y la inestabilidad cromosómica [2], [3]. Sin embargo, los subtipos han limitado valor predictivo o pronóstico y no influir en la decisión del tratamiento en enfermedad metastásica. Por el contrario,
KRAS
mutación es la prueba molecular más importante y ampliamente utilizado solo en el cáncer colorrectal metastásico. estado mutacional de
KRAS Guías decisión de tratamiento debido a la presencia de la mutación puede predecir falta de beneficios de
EGFR
anticuerpos -targeted [4].
análisis de secuenciación a gran escala utilizando métodos de secuenciación convencional ha proporcionado paisaje genético del cáncer colorrectal mostrando que hay un gen pocos "montañas" mutados en gran proporción de tumores y muchos "colinas" mutados con poca frecuencia [5], [6]. Además, el análisis del número de copias de todo el genoma revelado que el cáncer colorrectal tiene menos de copia alteraciones en el número en comparación con el cáncer de mama [7]. Reciente avance en la tecnología de secuenciación utilizando secuenciación de próxima generación (NGS) ha facilitado el análisis del genoma completo en distintos tipos de cáncer y la identificación de nuevas alteraciones genéticas [8], [9]. En los estudios de cáncer colorrectal, nuevas fusiones genéticas recurrentes han sido identificadas [10], [11]. Sin embargo, las principales deficiencias del genoma o exoma secuenciación enfoque conjunto es la identificación de las muchas posibles mutaciones funcionalmente poco claras, poco común, el "pasajero" con significado clínico desconocido. Por otra parte, relativamente bajo alcance de la estrategia a gran escala tiene limitaciones en la sensibilidad y especificidad, que es una cuestión importante para su aplicación en la clínica. Las alteraciones genéticas identificadas por el análisis de confirmación de baja cobertura necesitan para ser utilizado en la toma de decisiones clínicas.
secuenciación específico podía ser una mejor alternativa para la aplicación clínica de la tecnología NGS. Ventaja de enfoque específico es aumento de la profundidad de cobertura en comparación con enfoque completamente exoma al reducir el número de genes analizados con número similar de pares de bases secuenciadas. Esto permite la generación de datos fiables con suficiente profundidad la secuenciación de los genes específicos de interés.
Hemos establecido una plataforma de secuenciación que se hayan empleado la tecnología NGS, que incluye 183 genes y proporciona mutación y copiar datos de variación de número. El propósito de este estudio fue probar la viabilidad de la plataforma de secuenciación selectiva para la futura aplicación clínica utilizando tejidos de tumores colorrectales.
Materiales y Métodos
Ética declaración
El protocolo de estudio fue revisado y aprobado por el Comité de Ética del hospital Universidad Nacional de Seúl (SNUH). Todos los pacientes dieron su consentimiento informado para los bancos de tejidos y las pruebas genéticas antes de la cirugía escritos. Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Declaración de Helsinki para la investigación biomédica en seres humanos.
Información general del Estudio
Un total de 183 genes (Tabla S1) fueron seleccionados con criterios siguientes : conocido para predecir la respuesta, terapéuticamente objeto de orientación, que participan en las principales vías de señalización, y alta frecuencia de mutación en el Catálogo de mutaciones somáticas en la base de datos del cáncer (cósmica). Fresca y congelada tumor primario muestras de tejidos normales adyacentes fueron adquiridas de SNUH Banco de Tumores. Los especímenes fueron desprovistos de identificación y la información clínico-patológico fue proporcionada por el Banco de Tumores. ADN extraído del tejido fue enviado al Instituto del Genoma de Medicina, Universidad Nacional de Seúl. Secuenciación resultados se registraron dentro de 3 semanas (Figura S1).
enriquecimiento objetivo de ADN genómico y la secuencia
ADN genómico fue extraído de las muestras pareadas utilizando el kit QIAamp DNA Mini (Qiagen, Hilden, Alemania). Tres microgramos de ADN se cortó usando un Covaris S2 (Covaris, Inc., Massachusetts, EE.UU.) a ~ 250 nt en un ciclo de trabajo del 20%, el nivel de intensidad y 5 200 ciclos por ráfaga de 180 s. bibliotecas de secuenciación de fragmentos de código de barras se hicieron usando un kit de extremo emparejado preparación de muestras de ADN (Illumina, California, EE.UU.) y Illumina adaptador de multiplexación (iluminación) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la ligación con el adaptador de Illumina, las bibliotecas fueron preparados usando AMPure grano (Beckman Coulter, Inc., California, EE.UU.) en lugar de purificación en gel. Biblioteca calidad se evaluó utilizando un Agilent 2100 analizador de ADN y fichas 1000 (Agilent Technology, California, EE.UU.). Para diseñar los cebos para la captura de ARN, se utilizó el CÓSMICA (http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic) y el sitio de Agilent Technologies eArray (https://earray.chem.agilent.com/eArray /). Las regiones seleccionadas incluyen todos los exones de 183 genes implicados en varios tipos de cáncer y longitud total capturado fue ~ 1 M. Los cebos fueron 120 pb de longitud, y el promedio de cobertura de cebo de cada base en la región diana fue 2X. Nos evitar la repetición de las regiones enmascaradas estándar, pero permitió que cada cebo para superpone con una región repetitiva hasta 20 pb. También se identificaron las secuencias dentro de las regiones repetitivas que eran lo suficientemente única para servir como cebos razonables. Una piscina de ocho complejo equimolar fue producido para el enriquecimiento utilizando un kit SureSelect Target Enrichment System (Agilent Technology) y un protocolo modificado. Quinientos nanogramos de ADN en común con 5 l (100 ng) de cebos personalizados se utilizaron para el enriquecimiento, con el bloqueo de oligonucleótidos específicos para las bibliotecas de secuenciación de gama emparejado y 24 h de hibridación. híbridos de ARN biblioteca biotinilados se recuperaron con perlas de estreptavidina. Las bibliotecas capturados se amplificaron y secuenciaron en el Illumina Genome Analyser IIx por 2 x 69 ciclos. Estamos alineados a corto secuencia resultante lee a la referencia del genoma (conjunto de NCBI genoma humano construir 37) utilizando el programa de alineación de nucleótidos (GSnap) programa de lectura corta genómico de alineación [12], con una previsión de 5% de emparejamientos erróneos después de la contabilidad para los duplicados de PCR y lee que no alinear a regiones capturados del genoma de referencia. Los datos de secuenciación se cargan en el Europeo de nucleótidos Archivo EBI (http://www.ebi.ac.uk/ena/home) bajo el número de ERP002442.
variante de un solo nucleótido (SNV) y la detección indel
llamamos variantes genómicas de cada muestra (SNVS y indeles cortos) utilizando criterios modificados de nuestras publicaciones anteriores en la secuenciación de todo el genoma [13], [14]. En pocas palabras, SNVS y indeles se definieron en base a la satisfacción de las tres condiciones siguientes: (1) el número de mapeado de forma única lee en la posición debe ser dos o más; (2) la calidad de base media (
Phred
puntuación Q) para la posición debe ser de 20; y (3) la frecuencia de alelo de lectura en la posición debe ser de 20%. Para la detección de las mutaciones somáticas (SNVS y indeles) en los tejidos de cáncer, se utilizaron las siguientes condiciones: (1) SNVS no sinónimas o indeles en los tejidos de cáncer; (2) el número de alelo SNV debe ser cero en la secuencia específica de tejido normal; (3) el recuento de alelo de tipo salvaje debe ser 10 o más en la secuencia específica de tejido normal; y (4) las posiciones de los candidatos no deben ser polimorfismos de acuerdo con la dbSNP132. Las consecuencias funcionales de las nuevas variantes de cambio de sentido se prevé la utilización de clasificación de intolerante Tolerante (SIFT) [15]. La mutación en
KRAS
se confirmó mediante secuenciación de Sanger. Se utilizaron los siguientes cebadores: codon12 y 13, adelante 5'-CGTCTGCAGTCAACTGGAAT-3 'y revertir 5'-GAGAGTGAACATCATGGACC-3'; codón 61, adelante 5'-CAGACTGTGTTCTCCCTTCTCA-3 'y revertir 5'-CTCATGTACTGGTCCCTCATTG-3'; y el codón 146, hacia adelante 5'-TGGACAGGTTTTGAAAGATATTTG-3 'e inverso 5'-ATTAAGAAGCAATGCCCTCTCAAG-3'. Todas las reacciones de secuenciación se realizaron en ambas direcciones directa e inversa, y todas las mutaciones se confirmaron al menos dos veces a partir de PCR independiente aísla.
El número de copias alteración
Se estimó la cobertura de los genes mediante secuenciación lee asignado a las regiones seleccionadas. Para detectar la alteración del número de copias de un par de cáncer y tejidos normales, los ratios de cobertura de plegado indicados se han determinado (tumor /normal) para 183 genes diana. Después de la etapa de normalización teniendo en cuenta bases totales de lectura obtenidos a partir de cada tejido, índice de cobertura veces se ajustó por la pureza de las células tumorales estimado se describe a continuación. Se definió que un gen atestigua la copia número ganancia cuando su índice de cobertura veces ≥2.0 y pérdida cuando ≤0.5.
recuentos Para estimar la pureza del tumor, hemos utilizado leemos de SNVS somáticas identificadas. Dada SNVS somáticas para cada tejido canceroso, se asumió que el cáncer se compone de un clon mayor y los SNVS se deriva del clon. Por otra parte, hemos considerado a los SNVS como heterocigotos cuya frecuencia de los alelos es de 0,5. Con estas hipótesis, la pureza del tumor se estimó de la siguiente manera. El número esperado de tipo salvaje lee originaron a partir del clon cáncer y se calcularon las células normales. Entonces, la proporción de los de tipo salvaje, más SNP leer el recuento de cáncer entre el número total de recuentos de lectura se consideró como la pureza del tumor correspondiente. En 3 muestras que no tenían tumor específico SNV, se utilizó el valor medio de 57 muestras en el análisis de las variaciones del número de copias.
número de copia alteración se confirmó utilizando cuantitativa en tiempo real PCR con el sistema de detección iCycler IQ ( bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) utilizando SYBR green I (Molecular Probe, Eugene, OR) en las reacciones por triplicado. Los cebadores utilizados en la reacción de PCR fueron las siguientes:
ErbB2
, adelante 5'-TGCTGGAGGACGATGACATG-3 'y revertir 5'-CTGGACAGAAGAAGCCCTGC-3';
SRC
, hacia adelante 5'CGGTTACTGCTCAATGCAGA-3 'y 5'-reverse CAAGAGCGCTCGTACCTTTC-3';
TP53
, adelante 5'-CCCTTCCCAGAAAACCTACC-3 'y revertir 5'ACTGACCGTGCAAGTCACAG-3';
PTEN
, hacia adelante 5'TGGCACTGTTGTTTCACAAG-3 'y revertir 5'TGTTCCAATACATGGAAGGATG-3';
BRCA1
, hacia adelante 5'GTTTGCCAGAAAACACCACA-3 'y 5'-reverse TTTATGCAGCAGATGCAAGG -3';
BRCA2
, adelante 5'-TGCCTGGCCTGATACAATTA-3 'y revertir 5'TTGCTGCTTCCTTTTCTTCC-3'; y
ACTB
, hacia adelante 5'AGAGCTACGAGCTGCCTGAC y revertir 5'GGATGCCACAGGACTCCA-3 '. La fluorescencia
hibridación in situ gratis (FISH) análisis de
ErbB2
/CEP17 se realizó utilizando el kit PathVysion (Vysis, Downers Grove, IL) según las instrucciones del fabricante.
microsatélite estado
El estado de los microsatélites de cada tumor se determinó mediante el examen de 5 marcadores de microsatélites (D2S123, D5S346, D17S250, BAT25, BAT26 y) tal como se describe anteriormente [16]. Ya sea directa o inversa cartilla para cada marcador fue marcado con fluorescencia, y los productos de PCR se sometieron a electroforesis y se analiza. Se clasificaron estado de MSI de la siguiente manera:. MSI-alta, la inestabilidad en dos o más marcadores de microsatélites, MSI-baja, la inestabilidad en un marcador, y el SMS, ningún marcador inestabilidad
Pathway análisis
Camino análisis se realizó para los genes que tengan una mutación o el número de copias alteración en cada tumor utilizando la Base de datos para anotación, y Visualización integrada Descubrimiento versión de Recursos (DAVID) Bioinformática 6.7 utilizando la vía de bases de datos de BBID, Biocarta, y Kyoto Enciclopedia de genes y genomas (KEGG) [17 ]. gráfico de la anotación funcional de DAVID se ha creado usando el genoma humano como fondo, y los umbrales de recuento como 2 y facilidad Resultado como 0,1.
Resultados
Características de los pacientes y el perfil secuenciación
características de los pacientes son como se describen en la Tabla 1. las muestras apareadas de tumor colorrectal primario y la mucosa normal adyacente eliminado durante la operación se utilizaron para el análisis.
la cobertura media de las 120 muestras analizadas was175X (rango de 99X-435x) (Tabla S2). Fue 181x (100x-435x) para el tumor y 170X (99X-312x) para mucosa normal. porcentaje de células tumorales en la muestra de tumor podría ser estimado utilizando SNVS específicas de tumor en 57 muestras. El porcentaje promedio fue de 71% (rango 42-100).
Las mutaciones
Se encontró un total de 532 variantes no sinónimas somáticas en 113 genes (Figura 1). No se observaron variaciones de un solo nucleótido 494 de 106 genes de 60 pacientes y 38 mutaciones indel (11 inserciones y deleciones 27) en 19 genes de 21 pacientes (Tabla S3) guía
SNV, la variación de un solo nucleótido.; SNP, el polimorfismo de un solo nucleótido; NMD, sin sentido mediada la decadencia.
Entre los 494 SNVS, 278 variaciones fueron 232 mutaciones diferentes de puntos (67 mutaciones previamente reportados y 166 nuevas mutaciones) y 216 fueron reportados previamente 79 polimorfismos diferentes en el dbSNP .
mutaciones
punto componen de 43 mutaciones sin sentido y 189 mutaciones sin sentido. Hemos encontrado 2 nuevas mutaciones recurrentes,
JAK1
c.1595C & gt; T (p.R532H) en 2 pacientes y
EWSR1
c.1769A & gt; C (p.Q590P) en 2. Las mutaciones puntuales se observaron con mayor frecuencia en
APC gratis (32 mutaciones en 29 pacientes), seguido por
TP53 gratis (27 en 27),
KRAS gratis (24 en 24),
TTN gratis (36 en 21), y
FBXW7 gratis (15 en 14) (Tabla 2).
Las 32 mutaciones indel fueron de 3 mutaciones conocidas y 25 nuevas mutaciones , que eran 2 supresiones simples de un aminoácido, 26 mutaciones de cambio. Entre las mutaciones de cambio, 14 se prevé que resultará en decaimiento absurdo mediada. Se observaron recurrentemente 3 nuevas mutaciones indel:
ACVR2A
c.1303delA (p.K435fs) en 3,
TGFBR2
c.449_450delAA (p.E150fs) en 2 y
BLM
c.1536delA (p.G512fs) en
2.
La mediana de los números de mutación y gen mutado por tumorales fueron 4,5 (rango 0-32) y 4,0 (0-23), respectivamente. genes más frecuentemente mutados fueron
APC
(35 pacientes),
TP53 gratis (27), y
KRAS gratis (24). Se realizó la secuenciación de Sanger para la validación de los
se confirmó KRAS
mutación y todas las mutaciones identificadas por NGS.
Copiar alteraciones en el número
Copiar número cambio se observó en 132 genes y 51 tumores (85%) (Figura 2 y Tabla S4). el aumento de número de copias (& gt; pliegue X2) se encontró en 65 de los 40 genes de tumores y la copia número pérdida (& lt; x0.5 veces) en 103 genes de los 39 tumores. Entre los tumores que muestran el cambio de número de copia, mediana del número de genes implicados fue de 6 (rango 1-44). Los genes que muestran con mayor frecuencia fueron el aumento de número de copias
SRC gratis (15 pacientes),
MAFB gratis (15),
TOP1 gratis (14),
RECQL4 gratis ( 13), y
GNAS gratis (13). A excepción de
RECQL4
situado en el cromosoma 8q24, los otros 4 genes se encontraban en 20q 11-13. Los genes que muestran pérdida frecuente fueron
TP53 gratis (13 pacientes),
SMAD2 gratis (12),
SMAD4 gratis (12),
MAP2K4 gratis (11),
BCL2 gratis (11),
WRN gratis (10), y
DCC gratis (10).
TP53
y
MAP2K4
se encuentra en 17p12-13, mientras que
SMAD2
,
SMAD4
,
BCL2
, y
DCC
se encuentran en 18q21, y
WRN
localizado en 8p12. RT-PCR cuantitativa se utilizó para la validación del número de copias alteración de
SRC
,
ErbB2
,
TP53
,
PTEN
y
BRCA2
en muestras representativas y mostraron valores comparables.
ErbB2
fue validado mediante FISH (Figura 3).
Las muestras están alineadas según el número de identificación de la muestra en el eje Y y los genes están alineados según la localización cromosómica en el eje de abscisas.
* Los valores son coeficientes de plegado de cobertura no ajustados a la pureza del tumor. imagen representativa de análisis FISH de
ErbB2 gratis (rojo) y CEP17 (verde) que muestra la amplificación de
ErbB2
.
alteraciones genéticas combinadas
la combinación de mutación y copiar los datos de número,
APC
fue el gen alteración genética más frecuente (35 pacientes). Tres pacientes tuvieron pérdida de número de copias de
APC
, pero los 3 tumores también tenían mutaciones indel. En caso de
TP53
, 6 pacientes tenían concomitantemente punto de mutación y de la copia número pérdida y 7 pacientes tuvieron pérdida de número de copias como el único mecanismo genético de
TP53
inactivación. No hubo cambios en el número de copias
KRAS
. Sin embargo, el aumento de número de copia
HRAS
se encontró en 6 pacientes.
tumores MSI-H tendieron a tener mayor número de genes con mutación en comparación con MSS /MSI-L (media 10,8
vs
3,9, respectivamente;
p = 0,11
de t-test) y un menor número de genes que tengan el número de copias alteración (media 3,2
vs
8,6, respectivamente;.
p = 0,22
de t-test). MSI-H tumores presentaron mayor frecuencia de alteraciones genéticas en
ACVR2A gratis (1,9% en MSS /MSI-L
vs.
50,0% en MSI-H,
p =
0,002),
MLH1 gratis (3,7%
vs.
33,3%,
p = 0,046
),
MSH6 gratis (1,9%
vs.
33,3%,
p = 0,024
),
SPTAN1 gratis (0%
vs.
33,3%,
p
= 0,008), y
TGFBR2 gratis (
1,9%
vs. 33,3%,
p = 0,024
). Por el contrario, las alteraciones genéticas de los
TP53 gratis (63,0%
vs.
0%,
p
= 0,005) se observaron con mayor frecuencia en los tumores MSS /MSI-L.
también podríamos identificar alteraciones genéticas que podrían tener potenciales implicaciones terapéuticas (tabla 3).
ErbB2
ejemplar número ganancia fue identificado en 4 pacientes (rango X2.0-X71.5) y
ErbB2
mutación puntual en 5 pacientes (1 paciente tenía copia aumento de número y mutación puntual). alteraciones genéticas en
BRCA1
y
BRCA2
se observó en 4 pacientes:
BRCA1
pérdida (X0.49),
BRCA1
mutación puntual,
BRCA2
pérdida (X0), y
BRCA2
mutación por deleción en 1 paciente cada uno.
EGFR
ejemplar número ganancia se encontró en 4 pacientes (rango X2.0-8.2).
se observó PIK3CA
mutación puntual en 4 pacientes y
PTEN
pérdida y la mutación puntual en 4 pacientes (rango X0-X0.49) y 1 paciente, respectivamente.
Pathway análisis
Un total de 33 pacientes (55%) tuvo posible alteración de ganancia de función en el
RAS
/
RAF
vía: 20 pacientes con
solamente, 3 con KRAS mutación
KRAS
la mutación y la ganancia de
HRAS
, con 1
KRAS
mutación y
BRAF
mutación, 3 con
ANR
mutación, 2 con
HRAS
ganancia, 2 con
BRAF
mutación, con 1
BRAF
mutación y
HRAS
ganancia, y 1 con
RAF1
ganancia.
lista de genes alterados (mutación y cambio de número de copia) utilizando DAVID herramientas de anotación funcional Analizar, relacionados con la vía se identificó en 53 pacientes (cuadro S5) . La mediana de la vía por paciente fue de 19 (rango 3-70). Excluyendo las vías relacionadas con la enfermedad (por ejemplo, cáncer colorrectal), vía de señalización de ErbB (KEGG hsa04012) era la vía más frecuentemente implicados (25 pacientes, 42%).
Discusión
En la próxima era de la medicina personalizada para el tratamiento del cáncer, es esencial disponer de información genética exacta del cáncer individuo. Número de información genética ya guía las decisiones de tratamiento en la práctica diaria. Ejemplos en el tratamiento de tumores sólidos incluyen
ErbB2 gratis (HER2) amplificación génica en cáncer de mama y el cáncer gástrico,
EGFR
mutación en el cáncer de pulmón de células no pequeñas, y
KRAS mutación
en el cáncer colorrectal [18], [19], [20], [21]. tratamiento personalizado del cáncer es perseguido desde las primeras etapas del desarrollo de fármacos cuando hay un objetivo conocido [22]. Sin embargo, muchos de los agentes dirigidos en desarrollo no tienen un biomarcador genético predictivo. información completa del estado genético de los pacientes incluidos en los ensayos clínicos de fase temprana y análisis de asociación con la respuesta puede acelerar objetivo la identificación del paciente.
Hemos establecido una plataforma de secuenciación que se hayan empleado la tecnología NGS para proporcionar información genética completa para pacientes individuales. En el presente estudio, mostramos que la plataforma de secuenciación dirigida a base de NGS es factible para el uso clínico. A pesar de que no confirmamos cada alteración genética identificada, experimento de validación de
KRAS
mutación y alteraciones en el número de copia representativa (Figura 3) muestra que los resultados de la plataforma es fiable. Además, el perfil de los genes mutados y comúnmente patrón de número de copias de genes (alteración de las ganancias 8q y 20q y pérdida de 8p, 18q y 17p) son consistentes con el conocimiento previo de alteraciones genéticas en el cáncer colorrectal [23].
Major ventaja de la plataforma de secuenciación dirigida a base de NGS es que los datos con respecto a varios genes y múltiples alteraciones genéticas (mutación puntual, mutación indel, y número de copia alteración) se genera con un único experimento. La plataforma de secuenciación de proporcionar datos de mutación y el número de copias alteración requiere menos cantidad de ADN o tejido y el costo en comparación con la prueba de alteración genética individual por secuenciación o FISH que se utilizan comúnmente en la práctica diaria actual. Por otra parte, la sensibilidad superior sobre la secuenciación de Sanger se puede obtener mediante el aumento de la profundidad de cobertura, especialmente en los casos con baja pureza tumor.
Además de
KRAS
mutación, la mutación de otros genes en la vía (
BRAF
,
ANR
, y
PIK3CA
) también tiene efecto negativo sobre la respuesta al cetuximab [24]. Es probable que el examen de múltiples genes en la vía también podría mejorar la predicción de respuesta en otros tratamientos dirigidos. plataforma de secuenciación dirigida es una opción ideal para evaluar múltiples genes al mismo tiempo. Además de
KRAS mutación
, alteraciones genéticas en
ANR
,
HRAS
,
BRAF
, y
RAF1
se encontraron en cáncer colorrectal muestras analizadas en este estudio.
Búsqueda de alteración genética poco común puede proporcionar nueva opción de tratamiento para pacientes individuales. Por ejemplo, los pacientes con tumores que tienen
ErbB2
copiar el número de ganancia pueden beneficiarse de
ErbB2
-targeted agentes y los tumores tienen una mutación o pérdida de
BRCA1
o
BRCA2
de los inhibidores de PARP. Por otra parte, las alteraciones genéticas o vía involucrada pueden guiar la selección del ensayo clínico de fase temprana para los pacientes que se inscribieron. Los pacientes con alteración de
RAS /RAF
vía podría tener más posibilidades de beneficio por participar en un ensayo clínico de los inhibidores dirigidos a las vías.
Con el fin de detectar múltiples mutaciones con mayor sensibilidad, la espectrometría de masas plataforma de detección de mutaciones en base está actualmente en uso [25]. Sin embargo, sólo el número limitado de mutaciones preespecificados puede ser detectado y el número de copias alteración no se puede detectar con la plataforma. Por lo tanto, específica plataforma de secuenciación utilizando NGS es superior en términos de la información genética producida y la flexibilidad de constituir conjuntos de genes para el análisis. Estudios recientes también han demostrado la utilidad del enfoque de secuenciación selectiva o de NGS en el entorno clínico [9], [26], [27].
Mayor limitación del presente estudio es que la plataforma es capaz de detectar los genes de fusión y sólo el tejido congelado fresco se utilizó para el análisis. La detección de genes de fusión podría ser habilitado mediante la adición de secuenciación de ARN de baja cobertura. Hemos modificado procedimiento experimental para utilizar tejido incluido en parafina fijado en formol (FFPE) y hemos obtenido una sensibilidad comparable. Actualmente estamos estudiando la utilidad de la plataforma de secuenciación dirigida de forma prospectiva en la práctica clínica. El estudio utiliza ya sea fresco o tejido FFPE y hemos modificado la lista de genes para representar mejor las vías druggable y una mayor profundidad de la cobertura (& gt; X500).
En conclusión, la plataforma de secuenciación que se hayan empleado la tecnología NGS fue capaz de proporcionar amplia genética alteración de datos en muestras de tumores colorrectales y se pueden utilizar en un entorno clínico.
Apoyo a la Información
Figura S1. .
Estudio esquema
doi: 10.1371 /journal.pone.0064271.s001 gratis (TIF)
Tabla S1.
Gen Lista de amigos doi:. 10.1371 /journal.pone.0064271.s002 gratis (XLSX)
Tabla S2. .
Cobertura información
doi: 10.1371 /journal.pone.0064271.s003 gratis (XLSX) sobre Table S3. Las alteraciones genéticas
por pacientes
doi:. 10.1371 /journal.pone.0064271.s004 gratis (XLSX) sobre Table S4.
número de copias alteración
doi:. 10.1371 /journal.pone.0064271.s005 gratis (XLSX) sobre Table S5. vías
David
doi: 10.1371. /journal.pone.0064271.s006 gratis (XLSX)