Extracto
Los estudios clínicos sugieren que las respuestas a la proteína de fusión HPV16 E6E7L2 (TA-CIN) la vacunación solo son modestos, y GPI-0100 es un bien tolerado, potente adyuvante. Aquí hemos tratado de optimizar tanto la inmunogenicidad de TA-CIN a través de la formulación con GPI-0100 y el tratamiento del cáncer de HPV 16+ por la vacunación después de la quimioterapia con cisplatino. los títulos de anticuerpos en suero HPV16 neutralizantes, proliferativa de células T CD4 + y respuestas de E6 /E7 específicas de células T CD8 + se han mejorado de manera significativa cuando los ratones fueron vacunados por vía subcutánea (s.c.) o intramuscular (i.m.) con TA-CIN formulado con GPI-0100. La vacunación se probó para la terapia de ratones portadores de tumores singénicos /+ HPV16 E6 E7 (TC-1) o bien en el pulmón o por vía subcutánea. Los ratones tratados con TA-CIN vacunación /GPI-0100 exhibió robustos CD8 + T cell respuestas-E7 específico, que se asociaron con una reducción de la carga tumoral en el pulmón, mientras que los ratones que recibieron cualquiera de los componentes solos fueron similares a los controles. Desde la vacunación por sí sola no era suficiente para la curación, los ratones portadores de s.c. TC-1 tumor fueron tratados primero con dos dosis de cisplatino y luego vacunados. La vacunación con i.m. TA-CIN /GPI-0100 el crecimiento del tumor sustancialmente retardado y prolongado la supervivencia después de la terapia con cisplatino. La inyección de TA-CIN solo, pero no GPI-0100, en el tumor (i.t.) fue igualmente eficaz después de la terapia con cisplatino, pero los ratones sucumbieron finalmente. Sin embargo, se observó regresión del tumor y la remisión prolongada en 80% de los ratones tratados con cisplatino y la vacunación entonces intra-tumoral TA-CIN /GPI-0100. Estos ratones también mostraron robusto células T CD8 + específica de E7 de HPV16 y respuestas de anticuerpos neutralizantes. Así formulación de TA-CIN con GPI-0100 y la entrega intra-tumoral después del tratamiento con cisplatino provoca respuestas terapéuticas potentes en un modelo murino de cáncer de HPV 16+
Visto:. Peng S, Wang JW, Karanam B, C Wang, eh WK, Alvarez RD, et al. (2015) Sequential cisplatino Terapia y La vacunación con la proteína HPV16 E6E7L2 fusión en adyuvante de saponina GPI-0100 para el tratamiento de un cáncer Modelo HPV16 +. PLoS ONE 10 (1): e116389. doi: 10.1371 /journal.pone.0116389
Editor: Hiroshi Shiku, Mie University Graduate School of Medicine, Japón
Recibido: 15 de agosto de 2014; Aceptado: December 8, 2014; Publicado: 5 Enero 2015
Derechos de Autor © 2015 Peng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. El estudio fue financiado por becas de la Fundación V (www.jimmyv.org) para SP y RBSR, y el Servicio de Salud Pública (subvenciones. nih.gov) otorga a P50 CA098252 TCW, RO1 CA133749 de GH, y CA118790 a RBSR. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. RBSR es un inventor de patentes relacionadas con L2 (solicitud de EE.UU. 20090047301 virus del papiloma L2 N- los péptidos terminales para la inducción de péptidos a grandes Cross-anticuerpos neutralizantes y la solicitud US 20130177585 PAPILOMA L2 N-terminal para la inducción de la cruzada amplia anticuerpos neutralizantes) con licencia para Shantha Biotechnics Ltd, GlaxoSmithKline, PaxVax, Inc. y Acambis, Inc. RBSR TCW y son fundadores de Papivax LLC y asesores científicos Papivax Biotech Inc. Los términos de estos acuerdos están gestionadas por la Universidad Johns Hopkins, de acuerdo con su conflicto de intereses políticas. Esto no altera los autores adhesión a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
'' virus del papiloma humano de alto riesgo (VPHar) causa el 5,2% de todos los cánceres en todo el mundo [ ,,,0],1]. Mientras que la infección persistente VPHar es una causa necesaria del cáncer, la gran mayoría de las infecciones se borran de forma espontánea por la inmunidad del huésped. La prevención secundaria a través de programas de cribado citológico y del VPH y de intervención han reducido la carga del cáncer cervical en un estimado de 80% en los países desarrollados y ahora dos vacunas preventivas contra el VPH apuntar a los dos más frecuentes de los 14 tipos VPHar, HPV16 y HPV18. HPV16 es el genotipo presente en el 50-60% de los cánceres de cuello uterino, en el 87% de VPH + carcinomas orofaríngeos [2], en el 55% y el 76% de VPH + carcinomas vaginales y vulvares invasivos [3], y en el 73% de cáncer anal [ ,,,0],4]. La eficacia sustancial y la seguridad de las vacunas del VPH con licencia para la prevención de nuevas infecciones por el VPH 16 y el VPH 18 está bien documentada [5]. Sin embargo, la protección conferida por estas vacunas disponibles en el mercado es generalmente de tipo restringido [6], y las tasas de vacunación por desgracia siguen siendo bajos en los países en desarrollo. Es importante destacar que estas vacunas no tienen actividad terapéutica para aquellos pacientes con infección persistente por el VPH y el VPH establecida asociada displasia cervical [7], terapéutico vacunación contra el VPH tiene el potencial para aumentar la eficacia de las terapias no específicas, quirúrgicos y de ablación convencionales de la neoplasia de alto grado, o incluso quimiorradioterapia de los cánceres invasivos VPH +. A pesar del uso de cisplatino y /o terapia de radiación [8], la supervivencia a cinco años de los pacientes con cáncer avanzado de cuello uterino sigue siendo & lt; 30%. Por lo tanto, las estrategias de tratamiento específicas, tales como la vacunación terapéutica contra el VPH, son necesarios para mejorar los resultados en pacientes con cáncer avanzado de cuello uterino [9].
La vacuna contra el VPH candidato terapéutico TA-NIC es una proteína recombinante que comprende una fusión de HPV16 oncoproteínas E6, E7 y el menor L2 proteína de la cápside que se purificó a partir de
e. coli
[10]. E6 y E7 oncoproteínas virales son blancos prometedores para la inmunoterapia, se expresa en todas las células infectadas, necesarios para la viabilidad de las células de cáncer de HPV + y ausente de las células huésped normales. La proteína de la cápsida L2 menor no se expresa de forma detectable en las células de HPV + cáncer, pero es un antígeno terapéutico potencial para lesiones precursoras [11], [12], [13]. Además L2 contiene epítopos neutralizantes conservados y tiene potencial como un antígeno de HPV ampliamente profiláctico [14]. Tres inmunizaciones mensuales de voluntarios sanos con TA-CIN sin adyuvante, provocó una anticuerpos séricos neutralizantes-L2 específica y respuestas proliferativas de células T de una manera dependiente de la dosis [15]. E6 y E7-inmunidad específica de células T CD8 se detectó mediante ELISPOT de IFN en 8 de los 11 pacientes evaluables en la dosis más alta, aunque E6 era el antígeno dominante. Sin embargo, la respuesta general fue modesto, lo que sugiere la necesidad de un adyuvante [16], [17] o heteróloga refuerzo con un vector viral recombinante [18], [19], [20].
basan en proteínas vacunas sin adyuvante normalmente induce respuestas inmunes débiles. GPI-0100 es un potente adyuvante derivada mediante la modificación de saponinas naturales seleccionados [21] para eliminar restos acilo relativamente tóxicos e inestables, y la introducción de un resto lipófilo [22], [23]. Las dosis de 100 mg a 5000 mg de GPI-0100 ha sido probado con varios antígenos en ensayos clínicos de fase temprana y fueron bien toleradas [21], [24]. La vacunación de macacos con TA-CIN en combinación con el adyuvante GPI-0100 (TA-CIN /GPI-0100) también fue bien tolerada y provocó robustos títulos de anticuerpos neutralizantes contra HPV16, con respuestas menores contra otros tipos de VPH ensayados, y respuestas de células T para HPV16 E6 y E7 [16]. Formulación de TA-CIN con GPI-0100 destaca profundamente la respuesta de anticuerpos neutralizantes y los ratones protegidos de la piel desafío experimental con pseudovirions HPV16 que ofrecen un indicador de luciferasa. La inclusión de GPI-0100 también mejoró la respuesta específica de E7 CD8 de células T a la vacunación TA-CIN y ratones protegidos de la estimulación con la línea de células TC-1, un E6 /E7 + modelo de tumor murino HPV16 [16]. Sin embargo, su actividad terapéutica contra el tumor establecido no ha sido probado.
Estudios recientes sugieren que la inmunización local es importante para provocar una respuesta inmune celular que las casas de nuevo al sitio pertinente y que la quimioterapia puede mejorar la respuesta inmune en parte por la reducción de la carga de morbilidad, la liberación de antígenos tumorales y transitoriamente la modificación del microambiente inmunológico dentro del tumor [25], [26], [27], [28], [29], [30], [31]. El tratamiento con cisplatino y /o dosis bajas de radiación puede aumentar la potencia de las vacunas terapéuticas contra el VPH en modelos de ratones [32], [33], [34]. El tratamiento concomitante con cisplatino y la inyección intratumoral (IT) de péptido E7 en ratones C57BL /6 que llevan significativamente más-E7 específico IFN-γ secretoras de CD8
células E6 /E7 que expresan tumores generados 1 TC-+ T y podría curar muchos ratones, mientras que los tratados con cualquiera de las terapias sola no generaron control de crecimiento del tumor similar. Es importante destacar que la administración subcutánea de crecimiento del tumor controlado péptido E7 con menor eficacia que la administración intratumoral, lo que indica que la entrega de antígeno en el microambiente tumoral mejora de cebado de una respuesta de células T CD8 + específicas de antígeno tumor inmune después de la quimioterapia [34]. tratamiento cisplatino también indujo de forma transitoria una importante acumulación de células dendríticas (DC) en el microambiente tumoral. Además, la inyección intratumoral de péptido antigénico llevó a la absorción del péptido E7 por el CD11c + DCs y migración de los DC cargadas con péptido E7 a los ganglios linfáticos de drenaje [34]. Las CD cargadas con péptido E7 en el nodo linfático de drenaje podrían activar las células T CD8 + específica de E7. Es importante destacar que esta mejora de las células T CD8 + específicas de E7 en circulación y antitumorales efectos también se observó marcado cuando 1 TC-ratones portadores de tumores se trataron con cisplatino y intratumoral vacunación TA-CIN [35].
Nuestra antes los estudios en ratones y macacos apoyan la seguridad y la potencia de GPI-0100 como un adyuvante para TA-NIC, pero no examinaron su impacto sobre la actividad terapéutica [16]. Aquí se compararon la vacunación solo y cisplatino seguido por vacunación intratumoral o intramuscular TA-CIN formulado con adyuvante GPI-0100 para el tratamiento de tumores establecidos TC-1.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
La línea celular derivada de humanos 293TT se utiliza en este estudio. Esta línea celular se ha descrito anteriormente [37], [38]. Los estudios en animales se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud y con la aprobación previa del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Johns Hopkins (MO14M43). Los ratones se controlaron al menos tres veces por semana, y los puntos finales humanas se utilizaron en estudios de supervivencia; los ratones fueron sacrificados en exceso de la carga tumoral (≥2 cm de diámetro o ulceración), o la primera evidencia de sufrimiento como la pérdida de peso (≥10%), letargo, falta de calidad del pelaje, sensibilidad a la luz, de anidación o arañazos. Los ratones fueron anestesiados con inhalación de isoflurano, sacrificados por asfixia con dióxido de carbono y la muerte asegurado por dislocación cervical.
Ratones
5~8 semanas de edad ratones hembra C57BL /6 o ratones BALB /c fueron adquiridos de la Instituto Nacional del cáncer (Frederick, MD) y alojado por lo menos una semana antes del estudio. Todos los ratones se mantuvieron en la Escuela Johns Hopkins University of Medicine (Baltimore, MD) instalación de centro de cáncer de animales en condiciones libres de patógenos específicos. Los ratones fueron mantenidos 5 por jaula microisolator con comida estéril y ropa de cama con cambio semanal, y se aleatorizaron por jaula.
Péptidos, anticuerpos y reactivos
El H-2K
HPV16 b restringida E6aa50-57 péptido, YDFAFRDL, y H-2D
b-restringido péptido HPV16 E7aa49-57, RAHYNIVTF se sintetizaron por Recursos macromoleculares (Denver, CO) a una pureza de ≥80%. FITC o PE-anti-ratón conjugado CD4 (clon RM4-5) y CD8a (clon 53.6.7), y conjugado con FITC anti-ratón de IFN-γ (clon XMG1.2) anticuerpos se compraron de BD Pharmingen (San Diego, CALIFORNIA). Conjugado con PE, péptido HPV16 E7aa49-57 cargado H2-D
b tetrámeros se obtuvieron del Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas Fondo de tetrámeros. El acetato de medroxiprogesterona se adquirió de Greenstone LLC (Peapack, NJ), y el 4% nonoxinol-9 (N-9) se adquirió de Revive empresa de productos personal (Madison, NJ). Cisplatino, Tween-40 y el manitol se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO).
Se generaron
Células
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Vacuna y formulación
TA-CIN se ha descrito anteriormente y fue proporcionado amablemente por el Cancer Research Technology, Reino Unido [15]. GPI-0100 fue generosamente proporcionada por Hawaii Biotech Inc. (Aiea, Hawai). Para los estudios de vacunación, TA-CIN (31,25 mg /ml) se formuló con GPI-0100 (250 g /ml), solo o con cualquiera de Tween-40 (4 mg /ml), o manitol (50,7 mg /ml) en 0.025 M tampón fosfato de sodio (pH 7,2). Para preparar la vacuna para la inyección intra-tumoral, TA-CIN (312,5 g /ml) se formuló con GPI-0100 (2,500 g /ml) junto con manitol (50,7 mg /ml) en tampón de fosfato de sodio M 0,025 (pH 7,2). La vacuna formulada se incubó durante la noche en un agitador suave a 4 ° C antes de su uso. La formulación congelada de TA-CIN /GPI-0100 incluye manitol, y después de incubación durante la noche, se dividió en alícuotas y se congeló usando hielo seco /isopropanol. Las alícuotas se almacenaron a -80 ° C hasta su uso.
Producción de HPV16 y HPV58 pseudovirus y neutralización de ensayo
pseudoviruses (PSV) fueron producidos por co-transfección de células 293TT [37] , [38] con plásmidos que codifican HPV L1 y L2 y plásmido indicador que expresan bien la fosfatasa alcalina secretada (SEAP) o luciferasa de luciérnaga [39], [40]. ensayos de neutralización basados Pseudovirus-SEAP se realizaron como se describe anteriormente [38]. Brevemente, PSVS HPV16 SEAP se incubaron con sueros de ratón valorado (a partir de la dilución 1:50) o 4 l de positivo RG-1 anticuerpo monoclonal de control (1,1 mg /ml) durante 2 horas a 37 ° C antes de la adición a las células 293TT. Las células se incubaron entonces durante 72 horas, y se recogieron los sobrenadantes. actividad SEAP se midió por medio del método de ensayo colorimétrico. Los títulos séricos de neutralización se definieron como la mayor dilución que dio lugar a la reducción de al menos 50% de la actividad SEAP en comparación con virus únicos controles de infección.
tinción intracelular de citoquinas y citometría de flujo análisis
Para detectar E6 de HPV16 o específica de E7 CD8
+ T respuestas de las células por tinción intracelular de IFN-γ, los esplenocitos se estimularon con ya sea HPV16 E6aa50-57 o péptido E7aa49-57 (1 mg /ml) a la presencia de GolgiPlug (BD Pharmingen, San Diego , CA) a 37 ° C durante la noche. Para detectar CD4
+ y CD8
respuestas TA-CIN-específicos + T cell, los esplenocitos se estimularon con 10 mg /ml de proteína TA-CIN durante 24 horas a 37 ° C. entonces GolgiPlug se añadió a las células y se incubó durante la noche a 37 ° C. Cuando se usaron células CT26 transfectadas con HPV16 L2, las células CT26 fueron transfectadas primero con optimizado-codón de plásmido que codifica HPV16 L2 [41] utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los esplenocitos fueron co-cultivadas con HPV16 L2 transfectaron células CT26 con la relación de E:T de 10:01 en la presencia de GolgiPlug a 37 ° C durante la noche. A continuación, los esplenocitos estimulados se lavaron una vez con PBS que contenía 0,5% de BSA y se tiñeron con o bien conjugado con PE anti-CD4 de ratón o anticuerpo CD8. Las células se permeabilizaron y se fijaron con kit Cytofix /Cytoperm de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BD Pharmingen, San Diego, CA). Intracelular de IFN-γ se tiñó con FITC-conjugado anti-ratón de rata IFN-γ. La citometría de flujo análisis se realizó utilizando citómetro de flujo FACSCalibur con software CellQuest (BD Biosciences, Mountain View, CA).
tetrámero tinción
Para la tinción de tetrámero, PBMCs de los ratones fueron teñidas con anti purificada ratón CD16 /32 (bloque Fc, BD Pharmingen, San Diego, CA) primero y, a continuación, se tiñeron con anti-ratón CD8-FITC, PE conjugado con, el péptido HPV16 E7aa49-57, RAHYNIVTF cargado H2-D
b tetrámero en 4 ° C. Después de lavado, las células se tiñeron con 7-AAD antes del análisis de citometría de flujo para excluir las células muertas. Las células fueron adquiridas con citómetro de flujo FACSCalibur y se analizaron con el software CellQuest.
La transferencia pasiva de ratón o sueros macacque y vaginales VPH PSV desafío
Para los estudios de transferencia pasiva, grupos de ratones BALB /c hembra (n = 5) fueron inyectados con 3 mg de medroxiprogesterona por vía subcutánea cuatro días antes de la exposición PSV vaginal. Un día antes de la estimulación vaginal, 90 l de sueros de cada control o TA-CIN vacunado ratones hembra BALB /c se agruparon en sus respectivos grupos con un 150 l adicional de PBS (volumen total 600 l). Como control positivo, el RG-1 anticuerpo monoclonal de ratón se utilizó en tres de alto separada doses- (50 mg /ratón), Medio (25 mg /ratón) y baja (12,5 g /ratón). Posteriormente, 100 l de la respectiva mezcla de sueros o RG-1 dosis inyectadas por vía intraperitoneal fue entonces en cada ratón del grupo respectivo. A las 24 horas después de la transferencia pasiva, entrada a la vagina con el VPH PSV se llevó a cabo como se describe anteriormente [42] utilizando ~ 10
8 viral equivalente genómico (VGE) unidades /ratón. Tres días después de la exposición VPH PSV, la expresión de luciferasa en la bóveda vaginal fue adquirida con una cámara Xenogen IVIS 100 (Caliper Life Science, Hopkinton MA) y se analizaron con el software Image Living 2.5. Los mismos pasos se llevaron a cabo para los estudios de transferencia pasiva utilizando sueros de macacos 3 (I.D 746, 811 o 831) tercera vacunación, ya sea pre- o post- con TA-CIN + GPI-0100 generada en un estudio previo [16]. 100 l de suero preinmune (dilución = 1:200, sobre la base de estimación del volumen de sangre de ratón de 2 ml) o sueros vacunados se valoró con un intervalo de dilución de 1:200-1:2000 se transfirió pasivamente i.p. en grupos de ratones no tratados (n = 5). Al día siguiente, los ratones fueron desafiados por vía intravaginal con HPV58 PSV y la imagen de 72 horas a partir de entonces para evaluar la infectividad.
Estudios de tratamiento de células tumorales hematogeneosuly propagación TC-1