Extracto
La expresión de metaloproteinasas de matriz 9 (MMP9) se erige en una variedad de indicaciones inflamatorias y oncología, incluyendo colitis ulcerosa colitis y el cáncer colorrectal. MMP9 es un efector aguas abajo y aguas arriba de un mediador vías implicadas en el crecimiento y la inflamación, y durante mucho tiempo ha sido visto como un objetivo terapéutico prometedor. Sin embargo, los esfuerzos anteriores para orientar las metaloproteinasas de matriz (MMP), incluyendo MMP9, han utilizado de amplio espectro o inhibidores de la semi-selectivos. Si bien algunos de estos fármacos mostraron signos de la eficacia en pacientes, todos los inhibidores dirigidos-MMP se han visto obstaculizados por la toxicidad limitante de la dosis o insuficiente beneficio clínico, probablemente debido a su falta de especificidad. Aquí, se muestra que la inhibición selectiva de MMP9 no indujo síndrome musculoesquelético (una toxicidad característica de los inhibidores de pan-MMP) en un modelo de rata, pero redujo la gravedad de la enfermedad en un modelo de ratón inducida por sulfato de dextrano sódico de la colitis ulcerosa. También se encontró que la inhibición de MMP9 se redujo el crecimiento del tumor y metástasis incidencia en un modelo de xenoinjerto ortotópico quirúrgica de carcinoma colorrectal, y que la inhibición de cualquiera de MMP9 a tumores o estroma derivadas fue suficiente para reducir el crecimiento del tumor primario. En conjunto, estos datos sugieren que la inhibición selectiva MMP9 es una estrategia terapéutica prometedora para el tratamiento de las indicaciones inflamatorias y oncología en el que se upregulated MMP9 y está asociada con patología de la enfermedad, como la colitis ulcerosa y el cáncer colorrectal. Además, se presenta el desarrollo de un inhibidor alostérico MMP9 potente y altamente selectivo, el anticuerpo monoclonal humanizado GS-5745, que se puede utilizar para evaluar el potencial terapéutico de la inhibición de MMP9 en pacientes
Visto:. Marshall DC , Lyman SK, McCauley S, M Kovalenko, Spangler R, Liu C, et al. (2015) La inhibición selectiva alostérica de MMP9 es eficaz en modelos preclínicos de la colitis ulcerosa y el cáncer colorrectal. PLoS ONE 10 (5): e0127063. doi: 10.1371 /journal.pone.0127063
Editor Académico: Fabio Cominelli, CWRU /UH Instituto de Salud Digestiva, Estados Unidos |
Recibido: Diciembre 23, 2014; Aceptado: April 11, 2015; Publicado: 11 de mayo de 2015
Derechos de Autor © 2015 Marshall et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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financiación:. Todos los autores reconocidos y las personas son empleados actuales o anteriores de Gilead Sciences. Gilead Sciences financió toda la investigación se informa en este estudio y participa únicamente en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, y la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores tienen los siguientes intereses: Todos los autores son empleados actuales o anteriores de Gilead Sciences. Este estudio fue financiado por Gilead Sciences. Gilead Sciences tiene la patente 'Los anticuerpos a la matriz metaloproteinasa 9' (US8501916 B2) y la solicitud de patente 'Los anticuerpos a la matriz metaloproteinasa 9' (US20130281676 A1), y actualmente se está evaluando el anticuerpo monoclonal humanizado GS-5745 en la Fase 1 de pruebas clínicas (ClinicalTrials .gov Identificadores NCT01831427, NCT02077465 y NCT01803282). Ninguno de estos intereses en competencia afecta a la adherencia de los autores a PLoS ONE políticas relativas a la puesta en común de datos y materiales relacionados con el manuscrito presentado.
Introducción
metaloproteinasa de matriz (MMP) proteólisis mediada desempeña una papel clave en la modulación de la homeostasis celular: MMPs pueden iniciar, amplificar, o regular a la baja cascadas implicados en el crecimiento y la inflamación mediante la activación de citoquinas y la liberación de factores de crecimiento secuestrados de señalización, y puede modificar la arquitectura del tejido mediante la degradación de los componentes estructurales de la matriz extracelular (ECM) [1 -6]. De los 23 miembros de la familia de MMP, MMP9 (también conocida como gelatinasa B) muestra promesa particular como una diana terapéutica, dado el cuerpo de pruebas que demuestran su participación en procesos patológicos que contribuyen a la inflamación crónica, la tumorigénesis y metástasis [5-7].
MMP9 expresión desregulada y la actividad están asociados con varias enfermedades inflamatorias, incluyendo la colitis ulcerosa (CU) [1, 7-12]. UC es una inflamación autoinmune recidivante /remitente del colon [13-16] que cuenta con la inducción de los niveles de proteína MMP9 y la actividad proteolítica en las áreas de enfermedad activa [10, 11, 17]. MMP9 actividad en UC está implicada tanto en la generación y perpetuación de un estado inflamatorio-que es inducida por citoquinas proinflamatorias como el TNF-α y α IL1- [18-20] y puede ayudar a mantener los procesos proinflamatorios mediante la liberación de TNF -α y TGF-β, potenciando la IL-8, y mediante la activación de IL1-β [4, 21-26]. MMP9 también puede contribuir a la medio inflamatorio a través de la proteolisis de la membrana basal (BM) constituyentes de colágeno IV y laminina [7]. La destrucción de epitelio BM, una característica definitoria de la UC [13, 14, 16, 18], puede resultar en apoptosis de células epiteliales [27], lo que contribuye a la pérdida de integridad de la barrera epitelial colónica de la mucosa, lo que agrava la inflamación adicional. Del mismo modo, la interrupción de la BM endotelial puede facilitar linfocitos y neutrófilos transmigración al sitio de la inflamación [28-30].
expresión UC andMMP9 crónica en la UC son factores de riesgo para el desarrollo de carcinoma colorrectal (CCR) [15 , 31-33], y aunque la ruta exacta de la inflamación crónica de la displasia de neoplasia no está claro, la participación de MMP9 en los procesos que permiten la creación y propagación de estas dos enfermedades [1, 6, 7, 34, 35] sugiere que puede jugar un papel en la progresión de la UC al cáncer. expresión MMP9 es elevado y se correlaciona con mal pronóstico en una amplia gama de tumores, incluyendo CRC [5, 6, 35-47], y juega múltiples papeles en el proceso de tumorigénesis: MMP9 es producido por las células tumorales así como por células inflamatorias del estroma, tales como macrófagos asociados al tumor (TAM) y neutrófilos, y es un mediador clave de la diafonía tumor de estroma que da como resultado la activación recíproca de señalización pro-oncogénica en estos dos compartimentos [48-52]. MMP9 promueve la metástasis, facilitando la migración de células tumorales y la invasión a través de la escisión de BM y otros componentes de ECM [53], y también se ha implicado en el crecimiento del tumor primario en virtud de su posición como un objetivo corriente abajo [54-63] y una aguas arriba regulador de rutas de señalización oncogénicas clave. En este último la capacidad, MMP9 puede permitir la señalización pro-oncogénica a través de su capacidad para liberar factores de crecimiento tales como EGF, FGF-2 y VEGF [64-67], y para modular la integrina y receptor tirosina quinasa de función [54, 68, 69 ]. En última instancia, estos diferentes aspectos del trabajo de la función MMP9 en concierto para efectuar la desregulación de señalización y la proteólisis de la matriz que contribuyen al crecimiento y la diseminación de los tumores [53, 64, 70-73].
La relevancia de MMP9 en el patología de determinadas indicaciones inflamatorias y oncología ha sido demostrada por informes que muestran que
MMP9 - /- ratones mostraron una disminución de
gravedad de la enfermedad en modelos preclínicos de la colitis y la artritis reumatoide, y también mostró una reducción del crecimiento del tumor y /o metástasis reducido varios modelos de cáncer [1, 66, 74-81]. Aunque estas y otras observaciones publicadas sugieren que MMP9 es una diana terapéutica atractiva, los esfuerzos anteriores para orientar MMPs (incluyendo MMP9) utilizado inhibidores pan-específicos o semi-selectivos, y no tuvieron éxito debido a efectos secundarios limitantes de la dosis como el síndrome musculoesquelético (MSS ) y /o a una falta general de beneficio clínico [1, 17, 39, 82-84]. En retrospectiva, la falta de una ventana terapéutica con estos inhibidores de MMP amplio espectro es comprensible, dado el papel que pueden jugar las MMP en los procesos homeostáticos críticos [22, 85].
Aquí, se presenta el desarrollo de una altamente selectivo y un inhibidor alostérico de anticuerpos potente de MMP9: nos muestran que la inhibición de la MMP9 es eficaz en modelos de ratón de UC y el cáncer colorrectal, y que esta terapia no induce MSS en un modelo de rata. Proponemos que la inhibición selectiva de la señalización patológica mediada MMP9 y la proteólisis de la matriz es una novela oportunidad terapéutica en enfermedades inflamatorias como la UC, y en cánceres como el CRC.
Materiales y Métodos
tejidos
fresco congelado (FF) y se fija con formalina y embebidos en parafina (FFPE) los tejidos humanos se obtuvieron de Cureline, Inc. (Burlingame, CA), Asterand (Detroit, MI), o Folio Biosciences (Powell, OH) .
proteínas recombinantes y MMP9 inmunización
MMP9 proteína humana se generó por clonación del ADNc de longitud completa en el vector pSecTag2hygro (B) (Life Technologies, Carlsbad, CA) y la transfección transitoria en células HEK293 células (ATCC, Manassas, VA). El medio condicionado se purificó con una columna XK Ni-Sepharose Fast Flow 16/20 (GE Life Sciences, Pittsburgh, PA). Esta proteína y adyuvante Ribi se utilizaron para inmunizar ratones BALB /c (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) a través de la almohadilla de la pata. Los ratones con los títulos de anticuerpos séricos contra MMP9 se utiliza para hacer bibliotecas de hibridoma mediante la fusión de las células B aisladas de los ganglios linfáticos. Estas bibliotecas se subclonaron por única clasificación de células para generar poblaciones clonales de la que el anticuerpo anti-MMP9 humana se identificó AB0041. Las inmunizaciones, la creación de la biblioteca de hibridoma, y la clonación de anticuerpos se realizaron en soluciones de anticuerpo (Sunnyvale, CA). El anticuerpo monoclonal anti-ratón de MMP9 AB0046 fue generado de manera similar, con las excepciones de que se usaron ratones knockout MMP9 (Jackson Laboratories) y de que se utilizó una proteína de MMP9 ratón compuesta de sólo los dominios pro y catalíticos (aa 1-445) para la inmunización. Para el análisis de la especificidad, proteínas de la familia de MMP de longitud completa se compraron de R & amp; D Systems (Minneapolis, MN)
AB0041 y AB0046 la producción de anticuerpos y la purificación
células hibridoma que expresan AB0046 o AB0041 se cultivaron en. IMEM, 10% de suero bovino fetal (bajo IgG), penicilina /estreptomicina (1X), 5% de hibridoma Cloning Factor, y suplemento HT medios (1X) (Life Technologies, Grand Island, NY). El líquido ascítico fue generado, se purificó mediante el modo por lotes en resina MabSelect SURE (GE Healthcare, Piscataway, NJ), y se formuló en solución salina tamponada con fosfato (PBS; fosfato de sodio 10 mM, 140 mM de cloruro de sodio). pureza de anticuerpos se evaluó mediante la resolución de muestras reducidas y no reducidas con SDS-PAGE al 4-12% Bis-Tris geles y tinción con tinción de azul simple Seguro (Invitrogen). Se demostró que los anticuerpos purificados que contienen menos de 5% de agregados mediante SEC-HPLC utilizando columna de gel TSK G3000SWXL en Tosoh (King of Prussia, PA). Se utilizó la prueba LAL (Endosafe, Charles River Laboratories, Charleston, Carolina del Sur) para confirmar las preparaciones de anticuerpos contenían menos de 5 mg de endotoxina de la UE /.
MMP9 particular ligado a enzimas (ELISA) de unión
unión al antígeno-down ensayos ELISA directa con proteínas recombinantes purificados MMP9 se desarrollaron para medir la afinidad de unión aparente de AB0046, AB0041, y GS-5745. Todos los lavados fueron con PBS + 0,05% de Tween-20 (PBST). proteínas MMP9 de longitud completa se recubrieron en placas Maxisorp (NUNC, Rochester, NY), seguido de bloqueo con PBS + 5% (w /v) de albúmina de suero bovino (BSA; EMD Millipore). Después, las placas se lavaron y se añadieron diluciones en serie de anticuerpos anti-MMP9 en PBS. Después del lavado, las placas se incubaron con peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con anticuerpo secundario (Thermo Scientific, Fair Lawn, NJ) diluido 1: 10.000 en PBS + 0,5% (w /v) BSA después se lavó y desarrolló utilizando 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB; Sigma, St. Louis, MO) durante 1 minuto. La reacción se interrumpió mediante la adición de ácido clorhídrico 1 M. La cuantificación se llevó a cabo en un lector de placas SpectraMax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) en el modo de absorción a una longitud de onda de 450 nm. constantes de disociación aparente (K
D (ELISA)) se determinaron utilizando software Pro SoftMax (Molecular Devices) mediante el trazado de los valores de absorbancia frente a la concentración de anticuerpo y ajustando los datos a una ecuación logística de 4 parámetros, con el "C "ecuación de parámetro definido como la aparente K
D.
mapeo de epítopos de AB0041 y AB0046
Todas las construcciones MMP9 mutantes utilizados en el mapeo de epítopos se generaron mediante la mutación de ratón y vectores de expresión de MMP9 humanos usando una II Site Directed Mutagenesis Kit QuikChange (Stratagene, la Jolla, CA). Los clones individuales fueron verificados por análisis de secuencia de ADN, y las proteínas MMP9 mutantes fueron generados por transfección transitoria en células HEK293. El medio acondicionado se recogió después de 24 a 48 horas y se usa para recubrir un Su-Seleccionar Hi-Capacity Ni2
+ placa recubierta (Sigma), durante la noche a 4 ° C. Los siguientes placas día se lavaron en PBST y se bloquearon con 5% de BSA en PBS durante una a dos horas a temperatura ambiente, seguido de incubación con 10 nM o 1 nM de anticuerpo diluido en PBST. Las placas se lavaron y se incubaron con un anticuerpo de cabra anti-ratón IgG conjugado con HRP anticuerpo secundario (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA,) diluido 1: 10.000 en 0,5% de BSA en PBS. Las placas se lavaron, se desarrollaron, y se leen como se describió anteriormente
ensayos de actividad de MMP9
MMP9 actividad se evaluó usando sustratos fluorogénicos templados.; escisión genera fluorescencia que es proporcional a la cantidad de actividad de la enzima [86]. Los ensayos humanos y de ratón usado QXL donde CMC = S-Metil-L-cisteína, Abu = ácido 2-aminobutírico 520-γ-Abu-P-Cha-Abu-SMC-HA-Dab (5-FAM) -AL-NH2, y Cha = β-ciclohexilalanina (AnaSpec Inc., Fremont, CA), y el ensayo de rata utilizado Mca-PLGL-Dpa AR-NH2; (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN). Purificada MMP9 recombinante a partir de células HEK293 se activó por incubación durante la noche a 37 ° C con 4-aminofenilmercúrico de etilo (APMA) en mM Tris pH 7,5, cloruro de calcio 50 10 mM, cloruro de sodio 150 mM y 0,05% de Brij-35 buffer [87]. proteína MMP9 (63 humana pM, 125-150 ratón pM o 1 nM de rata) se transfirió a una placa de 96 pocillos negro (Costar) y se mezcló con anticuerpo diluido en serie. Después de la formación de complejos MMP9-anticuerpo, se añadió sustrato (20 mM para los ensayos de humanos y de ratón, 10 uM de rata) y la fluorescencia se controló en el modo de cinética a 37 ° C ya sea en un lector de placas SpectraMax M2 o M5 (excitación 320 nm, emisión 405 nm) o un lector de placas de Infinito M1000 (Tecan, Suiza) utilizando una longitud de onda de excitación de 494 nm y una longitud de onda de emisión de 521 nm. La pendiente de la curva (unidades de fluorescencia relativa [RFU] por minuto) se determinó en la región lineal, y después frente a la concentración del anticuerpo usando un 4-parámetro de curva algoritmo de ajuste para determinar un IC
50 valor. Para determinar el modo de inhibición MMP9, el ensayo de actividad se llevó a cabo como se describe anteriormente utilizando cuatro concentraciones diferentes de sustrato peptídico QXL-FAM etiquetados.
DQ-colágeno IV y DQ-gelatina ensayos
Human DQ-colágeno IV y porcino DQ-gelatina (Life Technologies) se templan proteínas conjugados con fluoresceína que emiten fluorescencia tras la digestión. proteínas MMP9 recombinante humana de longitud completa o de ratón se activaron como se describe anteriormente. MMP9 humana a 1 nM o 0,25 nM (colágeno IV o el ensayo de gelatina, respectivamente) o MMP9 ratón en 1 nM se añadió a una microplaca de 96 pocillos negro que contiene diluciones en serie de anticuerpo. Después de la formación de complejos MMP9-anticuerpo, se añadió 25 sustrato ug /ml y la fluorescencia se controló en un lector de placas SpectraMax M5 (Molecular Devices) a 37 ° C con longitudes de onda de excitación /emisión de 495/515 nm durante 3 horas (colágeno IV) o en un lector de placas PHERAstar FS (BMG Labtech) con longitudes de onda de excitación /emisión de 485/520 nm durante 30 minutos (gelatina). Los datos se corrigieron por sustracción de sus respectivos negativo (sin enzima) pocillos de control, y las unidades de fluorescencia relativa (RFU) se convirtieron en porcentaje de inhibición, que luego se representó frente a la concentración del anticuerpo; Se utilizó un ajuste de curva de 4 parámetros para determinar un CI
50.
TNF-α proteína de fusión ensayo de escisión
El ensayo de escisión proteína de fusión pro-TNF-α recombinante humana (R & amp ; D Systems, 1012-PS-010) se realizó siguiendo el protocolo del fabricante. Activo MMP9 humana recombinante (Millipore, PF024) o ADAM17 (R & amp; D Systems, 903-ADB) se mezcló con 10 uM AB0041 o 10 uM BB-94 (Selleck Chemicals, S7155) y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación se añadió sustrato de proteína de fusión de TNF-α, y se incubó durante la noche a 37 ° C. El análisis de transferencia Western se realizó con un anticuerpo TNF-α policlonal de conejo (Cell Signaling, 3707). Recombinante TNF-α humano (amp I +; D Systems, 201-TA) se utilizó como control positivo
Rat MSS modelo
Treinta ratas Lewis macho se obtuvieron de los laboratorios Harlan (Livermore, CA. ) y se aclimataron durante cinco a siete días antes de la iniciación del estudio. Las ratas se distribuyeron al azar en 5 grupos (3 de control; 2 experimentales) de 6 ratas /grupo en base a su peso corporal. Las ratas fueron alojadas en jaulas individuales en una habitación de temperatura controlada con un ciclo de 12 horas de luz /oscuridad, y tuvieron acceso ad libitum a agua potable y comida de los animales durante todo el curso del estudio. AB0041 (50 mg /kg) o vehículo (PBS pH 6,5, 0,01% de Tween-20) se administró a 6 ratas dos veces por semana por medio de inyección intravenosa en la vena caudal. Como control positivo para el SMS, 6 ratas fueron tratados con marimastat (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) a través de una bomba Alzet subQ implantado quirúrgicamente (Alzet, Cupertino, CA). Cada bomba contenía un total de 60 mg marimastat, que fue entregado a una velocidad de 2,5 l /hora durante un periodo de 28 días. Un cuarto grupo de 6 ratas recibió el vehículo usado para la dilución marimastat (50% DMSO /50% de agua) a través de una bomba Alzet SubQ. velocidad de liberación Marimastat fue entre 6,8 mg /kg /día (al inicio del estudio) y 5,7 mg /kg /día (en la terminación del estudio). Los animales se observaron y se puntuaron diariamente para los síntomas del SMS de acuerdo con los criterios citados en Renkiewicz et al. [88]. Descansando la postura, la marcha y la voluntad de avanzar: la postura de descanso se puntuó como 0 (normal), 1 (que descansa sobre un pie) o 2 (que descansa sobre un pie, ni tampoco dos pies). Gait se puntuó como 0 (normal), 1 (evita la utilización de una pata trasera) o 2 (evita el uso de ambas patas traseras). Disposición para mover a la estimulación se puntuó como 0 (movimiento normal), 1 (algo reacios a moverse), 2 (moderadamente reacios a moverse) o 3 (muy reacios a moverse). A la finalización del estudio (día 28), las extremidades se recogieron y se fijaron en 10% de formalina tamponada neutra para el análisis histopatológico. Las extremidades fueron descalcificadas y luego recortada, procesado, embebidos en parafina, se seccionaron, se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E) y se examinaron microscópicamente. El estudio se realizó en MSS Aragen Biosciences Inc. (Morgan Hill, CA).
DSS-colitis inducida modelo
El setenta y cinco ratones macho C57BL /6 ratones se obtuvieron de Charles River Laboratories (Wilmington , MA) y se aclimataron durante 5 días antes del estudio inicio y monitoriza para confirmar la salud. El estudio se realizó en las habitaciones de los animales provistos de HEPA filtración de aire a una temperatura de 70 ° F +/- 5 ° F y 50% +/- 20% de humedad relativa. La habitación estaba en un temporizador automático para un ciclo de luz /oscuridad de 12 horas y 12 horas en off sin crepúsculo. ropa de cama estéril Bed-O-mazorcas fue cambiado al menos una vez por semana. Los animales fueron alimentados con Purina LabDiet dieta estéril 5,053 roedor, y se proporcionó agua esterilizada ad libitum
.
Los ratones se asignaron al azar según el peso corporal en 5 grupos de 14 animales y 1 grupo de 5 animales antes del inicio de la estudiar. Colitis fue inducida por la administración de 3% w /v de sulfato de sodio dextrano (DSS) (MP Biomedicals; MW 36,000-50,000;. Producto No 160110;. Lote Nº 5237K) en el agua potable en los días de estudio 0 a 5. solución DSS era reemplazado por una solución recién preparada en el día 3. un grupo de ratones (n = 5) no recibió DSS y sirvió como el grupo de control sin la enfermedad. En estudio días 6, 14 animales por grupo se les administró por vía intraperitoneal o bien PBST vehículo, anticuerpo de control de isotipo (30 mg /kg), AB0046 (30 mg /kg), o etanercept (10 mg /kg, Clayworth Healthcare, Castro Valley, CA) . Vehículo y los anticuerpos fueron dosificados en los días 6, 9, y 12, y etanercept se dosificó en los días 6, 8, 10, y 12. Todos los animales se pesaron y se evaluaron visualmente para detectar la presencia de diarrea y heces con sangre diariamente. En la finalización del estudio (día 14), todos los animales fueron sometidos a endoscopia de vídeo de la parte inferior del colon con un pequeño endoscopio animales (Karl Storz Endoskope, Alemania). Los animales fueron anestesiados con isoflurano y colitis se puntuó visualmente con la siguiente escala [89]: 0 (por normal), 1 (para la pérdida de vascularización), 2 (para la pérdida de la vascularidad y la evidencia de friabilidad), 3 (para la friabilidad y erosiones ), y 4 (para ulceración severa). Cada ratón se le asignó una puntuación única (denominada puntuación endoscopia) que correspondía a los daños más graves observado a lo largo de toda la longitud del colon. A la terminación del estudio, los animales se sacrificaron por exposición a C0
2. Para evaluar la colitis histológicamente gravedad, un patólogo veterinario GI certificado por el consejo, cegado con respecto a los grupos de estudio, evaluado H & amp; secciones de paso FFPE E-manchado de tejido del colon. Cinco a ocho secciones separadas 5 micras de espesor tomadas de distintas regiones de los menores de 5 cm de cada una de colon se anotó para los cambios morfológicos y /o lesiones en el epitelio, tejido conectivo, y submucosa usando una escala de 4 puntos [89]. La puntuación de la inflamación y el edema fue la siguiente: 0 (ninguno de los presentes), 1 (focos raros /mínima), 2 (regiones dispersas o leve /difusa), 3 (numerosas regiones o difusa moderada), 4 (marcadas). La puntuación de la necrosis de la mucosa fue el siguiente: 0 (ninguno), 1 (& lt; 25% afectada), 2 (26 a 50% afectada), 3 (51-75% afectada), y 4 (& gt; 76% afectada). Estas puntuaciones se promediaron para obtener una única puntuación media por ratón por parámetro. Este estudio y el análisis histopatológico asociado (incluyendo la selección de imágenes representativas) se llevó a cabo por Biomodelos, LLC.
HCT116 quirúrgica ortotópico modelo de xenoinjerto
Se llevaron a cabo todos los estudios preclínicos tres HCT116 por AntiCancer Inc. (San Diego, CA). nu /nu hembra NCr se obtuvieron de Charles River (Wilmington, MA) y fueron criados por AntiCancer Inc. para producir estudiar a los animales. Los animales de ensayo se mantuvieron en un entorno de filtrado HEPA con una luz de 14 horas /10 horas de oscuridad para el experimento. Jaulas, alimentos y ropa de cama se trataron en autoclave; LabDiet Chow ratón se obtuvo de PMI Nutrition International Inc. (Brentwood, MO) y se proporcionó ad libitum, como se agua potable. Los ratones se asignaron al azar según el peso corporal en 4 grupos (grupo de control; un 3 grupos experimentales) de 15 animales. poblaciones tumorales Pre-implantación de la línea celular HCT116 de cáncer colorrectal humano que expresa GFP (AntiCancer Inc.) se prepararon mediante inyección subcutánea de las células HCT116-GFP a una concentración de 5 x 10
6 células /100 ul en el flanco de nude ratones. Después de la expansión, los tejidos tumorales fueron cosechadas de los ratones y se cortaron en fragmentos de aproximadamente 1 mm
3. Dos de estos fragmentos de tumor se implantaron a continuación quirúrgicamente ortotópicamente (SOI) adyacente al colon de cada animal estudio, bajo ketamina /acepromazina anestesia /xilazina.
Cuando los tumores implantados quirúrgicamente alcanzaron un volumen medio de aproximadamente 70 a 100 mm
3, los ratones se dividieron en grupos de tratamiento. El tratamiento se inició 16 días después de la implantación del tumor para el Estudio 1 y el Estudio 3, y 17 días después de la implantación de Estudio 2. Todos los ratones tratados con el cóctel AB0041 /AB0046 recibido una dosis de carga de AB0046 a 50 mg /kg en el primer día de tratamiento. AB0041 y AB0046 fueron a partir de entonces dosifican por inyección intraperitoneal dos veces por semana a 15 mg /kg, de forma individual o en combinación (en el grupo de combinación, cada anticuerpo estaba presente en 15 mg /kg). Los ratones de control se dosificaron con vehículo (PBS, 0,01% de Tween-20). Se midieron el tamaño del tumor y los pesos corporales primaria (por el calibrador o mediante balanza electrónica, respectivamente) dos veces a la semana durante el estudio 2 y Estudio 3, y una vez a la semana para las estimaciones de tamaño basadas en Caliper Estudio 1. Se obtuvieron midiendo la dimensión menor perpendicular ( W) y la dimensión mayor (L) del tumor palpado. aproximada del volumen del tumor (mm
3) se calculó mediante la fórmula (W
2 x L) /2.
Los ratones se terminaron a los 20 días después del inicio del tratamiento (Estudio 3), 18 días después del tratamiento iniciación (Estudio 2), o 28 días después del inicio del tratamiento (estudio 1). Los disparadores para la eutanasia fueron: volumen tumoral & gt; 2000 mm
3, & gt; 20% de pérdida de peso, observaron interferencias con una función de vital importancia fisiológica, o ulceración o necrosis de tumor. El tumor primario de colon y de cualquier órgano con metástasis fueron cosechadas al final del estudio, y el tumor primario se pesó después de la escisión. Los tumores se bisecaron, y una media se fijaron en solución de formalina tamponada neutra al 10% para el análisis histológico. La otra mitad y todos los tumores metastásicos GFP-positivas de otros órganos se colocaron en casetes de tejido y se snap-congelado en nitrógeno líquido. Se utilizó el sistema de imágenes FluorVivo (INDEC Biosystems, Santa Clara, CA) para formación de imágenes de todo el cuerpo. En la necropsia, la imagen abierta se realizó en la cavidad torácica y la zona abdominal para la inspección de la metástasis a los ganglios linfáticos, los pulmones y otras áreas. La presencia de tejido necrótico en H & amp; E-manchado secciones del tumor fue evaluada por un patólogo certificado por el consejo
La inmunohistoquímica
Los tejidos congelados fueron incorporados en la temperatura óptima de corte (OCT Tissue Tek, VWR. , Brisbane, CA) compuesto por inmersión en un baño de hielo seco isopentano (-70 ° C). Los tejidos se recuperan y se almacenaron a -80 ° C. que contiene tejido bloques de OCT se seccionaron en un criostato (Leica CM1850), y se cortaron en secciones criogénicas 5 micras de espesor, que se colocaron en portaobjetos Superfrost con carga positiva (VWR). Para (FFPE) los bloques de tejido incluidas en parafina fijadas en formalina, se cortaron secciones de 5 micras de grosor, se montaron en portaobjetos SuperFrost, y al horno a 60 ° C durante aproximadamente 20 minutos.
A menos que se indique lo contrario, todos los reactivos IHC y equipo eran de Biocare médica (Concord, CA), procedimientos IHC se llevaron a cabo a temperatura ambiente, y todas las diapositivas fueron teñidas utilizando el Nemesis 3600 de Biocare médica. Pre-fijación (secciones de tejido congelado): portaobjetos se fijaron con paraformaldehído al 4% (VWR) y después se aclara en PBS que contenía 0,02% de Tween-20 (PBST) en preparación para la IHC. Desparafinación /recuperación del antígeno (tejidos FFPE): portaobjetos se sumergieron en 1 x Solución Decloaker universal y se calienta a 90 ° C durante 45 minutos en la cámara de destape, entonces sumergidos en caliente de enjuague 20 veces, y se equilibró con agua destilada. Autostainer: diapositivas fueron tratados con Peroxidazed y se bloquearon con el fondo de francotirador antes de la incubación con el anticuerpo primario en Da Vinci verde Diluyente durante 30 minutos. El anti-MMP9 (ab76003), anti-colágeno IV (ab6586), y anti-PM2K (ab58822) anticuerpos se obtuvieron de Abcam (Cambridge, MA). El anti-mieloperoxidasa (MPO, A0398) se obtuvo de Dako (Carpinteria, CA). Las diapositivas fueron lavadas en TBS-Autowash. El kit polímero Mach 2 se utilizó para la detección de antígeno mediante la adición de anti-anticuerpo secundario de conejo (conjugado con peroxidasa de rábano picante) durante 30 minutos. DAB (3, 3 'diaminobencidina) cromógeno se añadió a los portaobjetos durante 1 minuto seguido de un único aclarado en TBS-Autowash y un único enjuague en agua destilada. Las láminas fueron counterstained con hematoxilina CAT, seguido por deshidratación manual con alcohol gradual, a continuación, se montaron con medio de montaje entellan. Todos los portaobjetos se visualizaron utilizando un microscopio óptico Leica DFC500.
El bienestar animal
Se llevaron a cabo todos los estudios llevados a cabo con ratones o ratas en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de Salud y fueron aprobados por la IACUC local de la supervisión de las instalaciones donde se realizaron estudios: Biomodelos INSTITUCIONAL Cuidado de Animales y el empleo (número de autorización CICUAL 09-1215-03); Comité Aragen para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC número de autorización SA-003-A); Cuidado de Animales y el empleo Comisión de cáncer (IACUC aprobación número 14-090).
gráfica y el análisis estadístico
Los datos se analizaron y se visualizaron utilizando el software Prism (GraphPad, v5.01). Para las evaluaciones clínicas, histopatológicas, e inmunohistoquímica, la importancia de la regulación de los grupos de tratamiento en comparación con el grupo de vehículo se evaluó de la siguiente manera: El D'Agostino & amp; Pearson se utilizó la prueba de normalidad ómnibus para determinar si los datos se distribuyen normalmente. Los datos que normalmente se distribuye fueron evaluados por un ANOVA de una vía con múltiple después de la prueba de comparación de Dunnett. Los datos no distribuidos normalmente se evaluaron sea mediante una prueba de Mann-Whitney (para el análisis por pares) o mediante una prueba de Kruskal-Wallis con comparación múltiple post-test de Dunn. Se utilizó la prueba exacta de Fisher para el análisis de los datos de metástasis. denominaciones de valor P son como sigue: * & lt; 0,05, ** & lt; 0,01, *** & lt; 0,001, **** & lt; 0,0001.
Resultados
anticuerpos
generación y caracterización de anticuerpos anti-MMP9
anticuerpos monoclonales dirigidos MMP9-se generaron mediante la inmunización de ratones con las proteínas de ratón MMP9 humanos o recombinantes, y candidatos fueron identificados por
in vitro
detección de destino de enlace, la inhibición de la proteolisis del sustrato, y la selectividad frente a otros miembros de la familia MMP. El proceso de selección produjo AB0041, que inhibe tanto la MMP9 humana (hMMP9) y MMP9 rata (rMMP9), pero no se une a MMP9 ratón (mMMP9); y AB0046, que por el contrario inhibe mMMP9, mientras que no se une a rMMP9 o hMMP9 (Tabla 1). Ambos anticuerpos tenían una alta afinidad y una excelente potencia: para AB0041 focalización hMMP9, K
D (app) = 0,133 ± 0,030 nM e IC
50 = 0,172 ± 0,007 nM, y para AB0046 focalización mMMP9, K
D (app) = 0,218 ± 0,097 nM y IC
50 = 0,029 ± 0,005 nM (Tabla 1). AB0041 y AB0046 fueron altamente selectiva, con más de 500 veces selectividad para MMP9 frente a otros miembros de la familia de MMP (incluyendo la MMP2 altamente homóloga) (Tabla 1 y Tabla 2). Ambos anticuerpos se comportaron como inhibidores no competitivos, como los IC
50 valores generados contra la actividad de la enzima sobre un sustrato de péptido no se vieron afectadas sustancialmente por las concentraciones de sustrato que van desde 1 hasta 20 mM (Fig 1A). Además, ambos anticuerpos inhiben la escisión MMP9 mediada de la fisiológicamente relevante de colágeno sustratos de gelatina y la membrana basal IV, con potencias similares a los generados en el ensayo de sustrato de péptido. El IC
50 de AB0041 fue 0,34 ± 0,061 nM para la escisión de gelatina (Fig 1B) y 0,30 ± 0,025 nM para la escisión de colágeno IV (Fig 1C), y el IC
50 de AB0046 para la escisión de gelatina fue 0,26 ± 0,018 nM (Fig 1B). Ratón MMP9 no digerir el colágeno IV humano, por lo AB0046 no fue evaluado en este ensayo.