Extracto
Las microcistinas son potentes inhibidores de la fosfatasa y toxinas celulares. Requieren de transporte activo por OATP1B1 y OATP1B3 transportadores para la captación en las células humanas, y la alta expresión de estos transportadores en el hígado cuentas por su toxicidad hepática selectiva. Varios tumores humanos han demostrado tener altos niveles de expresión de OATP1B3 pero no OATP1B1, el transportador principal en las células hepáticas. La hipótesis de que las variantes de microcistinas podría ser aislados que son transportados preferentemente por OATP1B3 en relación con OATP1B1 para avanzar como agentes contra el cáncer con la toxicidad hepática clínicamente tolerable. variantes microcistina se han aislado y probado para la citotoxicidad en células de cáncer transfectadas de forma estable con OATP1B1 y OATP1B3 transportadores. Microcistina variantes se encontraron con citotóxica OATP1B1 /OATP1B3 IC
50 proporciones que oscilaban entre 0,2 y 32, lo que representa un rango de 150 veces en la selectividad transportador. Como estructura de microcistina tiene un impacto significativo en la selectividad transportador, que es potencialmente posible desarrollar análogos con aún más pronunciada selectividad OATP1B3 y así permitir su desarrollo como fármacos anticancerígenos
Visto:. Niedermeyer THJ, diario A, Swiatecka-Hagenbruch M, Moscú JA (2014) selectividad y potencia de microcistina Los congéneres contra las células cancerosas y OATP1B1 OATP1B3 Expresando. PLoS ONE 9 (3): e91476. doi: 10.1371 /journal.pone.0091476
Editor: Matias A. Ávila, Universidad de la Escuela de Medicina de Navarra y el Centro de Investigación Médica Aplicada (CIMA), España |
Recibido: 19 de diciembre 2013; Aceptado: 13 Febrero 2014; Publicado: 10 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Niedermeyer et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por DanceBlue, un esfuerzo dirigido por el estudiante que apoya la atención clínica y la investigación en oncología pediátrica en la Universidad de Kentucy, y en parte por el Ministerio Federal alemán de Economía y Tecnología (KF2766301SB0). publicación de Acceso Abierto es apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft y Open Access Fondo Editorial de la Universidad de Tubinga. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Timo Niedermeyer y Monika Swiatecka-Hagenbruch son empleados de Ciano Biotech GmbH. No hay productos comercializados que declarar. Ciano Biotech GmbH ha dado permiso para publicar el manuscrito. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
Las microcistinas (MC) son heptapéptidos cíclicos producidos por varios géneros de cianobacterias como
Microcystis
,
Oscillatoria
,
Planktothrix
,
Nostoc
, y
Anabaena
. Se pueden considerar como uno de los metabolitos secundarios de cianobacterias mejor estudiados [1] - [4]. La característica estructural común de microcistinas es un aminoácido derivado de poliquétido sintasa con el acrónimo "Adda", (2S, 3S, 8S, 9S) -3-amino-9-metoxi-2,6,8-trimetil-10-phenyldeca- 4,6-dienoico, que es también una de las dos subestructuras obligatorias para la fosfatasa serina potente proteína /treonina (PP) 1 y la inhibición de PP2A observados para las microcistinas [5] - [9]. No sólo es la biosíntesis de estos compuestos por policétido sintasas y péptido sintetasas no ribosómicas notablemente bien entendido [10] - [12], pero también más de 90 miembros individuales de esta químicamente muy diversa familia de compuestos se han descrito en la literatura científica para fecha (Fig. 1) [13] - [56]. Especialmente propensos a la variación son los L-aminoácidos situados en las posiciones 2 y 4 del esqueleto de MC. Los compuestos relacionados son los nodularinas, que se encuentran en
Nodularia
sp, que también contiene Adda, pero son pentapéptidos cíclicos en lugar de heptapéptidos (Fig. 1) [57] -.. [60]
La prevalencia de residuos que se encuentran dentro de microcistinas (izquierda) y nodularinas (derecha) es proporcional al tamaño de la fuente del residuo correspondiente. Los datos utilizados para generar esta figura se deposita en http://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.880756.
Al ser potente proteína serina /treonina fosfatasa inhibidores, microcistinas y nodularinas tienen una profundo efecto en la señalización celular y el mantenimiento del citoesqueleto, que conduce a la muerte de las células afectadas [61], [62]. Sin embargo, los MCs relativamente grandes y anfifílicos son incapaces de atravesar las membranas celulares por difusión pasiva. En su lugar, se basan en la captación activa de las células. Tres miembros de la familia de polipéptidos de aniones transporte orgánica (OATP) son capaces de mediar en esta captación de MCs, a saber OATP1B1, 1B3 y 1A2 [63], [64]. OATP1B1 y OATP1B3 son los transportadores de microcistina más eficientes, y como en los seres humanos sanos se encuentran exclusivamente ambos transportadores que se expresa en el tejido del hígado [64], [65], microcistinas y nodularinas son conocidos por causar un extenso daño en el hígado [66] - [68 ]. Por lo tanto microcistinas se hizo famosa como toxinas hepáticas que causan daño a los seres humanos y el ganado cuando estos compuestos se acumulan en las fuentes de agua potable durante épocas de floración de algas de agua [69], [70]. Los inhibidores de estos transportadores de OATP mejorar la hepatotoxicidad de microcistinas y nodularinas [68], [71], [72]. En contraste con OATP1B1, que se expresa en los hepatocitos en todo el lóbulo hepático, localización OATP1B3 está restringido alrededor de la vena central [64]
OATPs se encuentran actualmente en discusión como objetivos para la terapia del cáncer [73] - [76]. . Lo más interesante, OATP1B3, pero no OATP1B1, se ha encontrado que se expresa funcionalmente en un número de tejidos de cáncer, especialmente los tumores de colon, pero también los tumores de mama, tumores de pulmón, de páncreas y tumores hepatocelulares [75], [77] - [79] . Como toxicidad diferencial de microcistina natural de variantes en las líneas celulares que expresan se ha observado ya sea OATP1B1 o OATP1B3 [78], [80], estos resultados plantearon la cuestión de si microcistinas podrían ser adecuados como pistas para sustancias de fármacos contra estos tipos de cáncer, y si hay microcistinas entre los más de 90 variantes conocidas que se transportan selectivamente por OATP1B3 en relación con OATP1B1. La selectividad que favorece OATP1B3 sobre OATP1B1 debería conducir a una disminución del aclaramiento hepático y aumento de la captación de MCs en los tumores que expresan OATP1B3, la creación de una ventana terapéutica del compuesto respectivo por la disminución de la tasa de aclaramiento hepático y la toxicidad. MCs son interesantes como estructuras de plomo novedosos porque tienen un modo de acción aún no utilizado, pero actualmente discutido para la terapia del cáncer (inhibición de la fosfatasa) [81] - [83], y en contraste con la mayoría de los medicamentos contra el cáncer actualmente disponibles, que necesitan activo transporte en las células y por lo tanto todos los tejidos de repuesto que no expresan los OATPs mencionados.
Hemos aislado varios congéneres de microcistina de cianobacterias del género
Microcystis
,
Planktothrix
, y
Nodularia
para poner a prueba la hipótesis de si las diferentes selectividades transportadoras pueden ser alcanzable. Como herramientas para las pruebas de selectividad, las células HeLa de cáncer de cuello uterino y las células de cáncer de colon RKO transfectadas establemente con vectores de expresión para OATP1B1 y 1B3 se han utilizado. En el presente manuscrito, se describen los resultados de las pruebas de MCs aislados en estas líneas celulares. Las determinados IC
50 valores, así como las diferencias de selectividad observados muestran claramente que las pequeñas diferencias estructurales de los MC probado de hecho tienen un impacto significativo en la selectividad y potencia citotóxica transportador.
Resultados y Discusión
las composiciones de aminoácidos (AA) de los MCs analizadas se resumen en la Tabla 1
las estructuras de los congéneres de microcistina se han determinado sobre la base de HRMS en tándem [51], [52], [84 ], con el apoyo de la espectroscopia
1H COSY y RMN. Todos los MCs contienen la fracción Adda característica en la posición 5 y D-Ala en la posición 1 de la molécula. Sólo uno de los congéneres aislados cuenta con un
O
-methylated d-iso-Glu en lugar de d-iso-Glu en la posición 6 (22). d-iso-β-MeAsp y d-iso-Asp en la posición 3 se distribuyen casi por igual, como lo son MDHA y Dhb en la posición 7. Los L-aminoácidos en la posición 2 comprenden Leu, Tyr, Arg, hty, Hil (orden descendente de cuenta), en la posición 4 Arg, Tyr, Trp, Phe, hty, y Har se encuentran. Además de 22 variantes MC, nodularina (23) como una Adda contiene pentapéptido cíclico, así como el ácido okadaico (24) como un inhibidor de PP estructuralmente no relacionados con el MC han sido probados.
Los valores de CI50 de todos los aislados se han determinado los MC contra OATP1B1- y líneas de células HeLa o RKO OATP1B3 expresan. Los resultados se muestran en la Tabla 2.
Curiosamente, marcadas diferencias tanto para potencia y selectividad del individuo se pudieron observar congéneres MC.
Selectividad
Mientras que la sustitución de d-iso-β-MeAsp
3 para d-iso-Asp
3 (por ejemplo, compuestos de 1/2 y 13/14) no parece tener una influencia significativa en ninguno de potencia ni la selectividad, la influencia de la presencia de cualquiera MDHA
7 o (
e
) -Dhb
7 (por ejemplo, 3/4, 5/6, 8/9 y 14/15) es ambigua: Mientras que en el caso de 3/4 y 5/6 sustitución de MDHA
7 para (
e
) -Dhb
7 conducen a un profundo aumento en la selectividad para OATP1B3 sobre OATP1B1, este efecto no se observó para 8 /9 y 14/15. Como los seis compuestos menos selectivos OATP1B3 (1, 2, 3, 5, 7, 23), todos cuentan con MDHA
7 o Mdhb
7, mientras que (
E
) -Dhb
7 es que se encuentra en 3 de los 6 mayoría de los compuestos OATP1B3 selectivos (4, 10, 12, 15, 16, 18), es probable que (
E
) -Dhb
7 tiene una influencia en la selectividad pero es no es la única característica estructural que confiere selectividad.
de hecho, especialmente los residuos de aminoácidos en las posiciones 2 y 4 de la estructura del núcleo MC parecen ser importantes tanto para la potencia y selectividad. Mientras que el 80% de la mayoría de los compuestos selectivos OATP1B1 disponen de Leu en la posición 2, este aminoácido es completamente ausente en la mayoría de los compuestos selectivos OATP1B3. Sin embargo, Leu también se encuentra en la posición 2 de varios congéneres que son débilmente selectivo OATP1B3 (6, 8, 9), por lo tanto Leu solamente no hace un OATP1B1 compuesto selectivo. Arg en la posición 2 parece inducir selectividad OATP1B3, mientras que Arg en la posición 4 no tiene ninguna influencia sobre la selectividad. Esto es evidente con los compuestos 13 y 16, donde el intercambio de los aminoácidos en las posiciones 2 y 4 tiene un impacto enorme sobre la selectividad. Arg en combinación con los aminoácidos aromáticos Phe, Tyr, y hty son monómeros prominentes que se encuentran en compuestos selectivos OATP1B3. Especialmente combinaciones de Arg
2 y Phe
4 (12) o Arg
2 y Tyr
4 (16) parecen conferir selectividad OATP1B3. Pero, de nuevo, la presencia de Arg en la posición 2 parece no ser obligatorio para la selectividad OATP1B3 (4).
Curiosamente, el pentapéptido nodularina (23) es el más OATP1B1 selectiva entre los compuestos que contienen Adda examinados.
Potencia
potencia de MC muerte celular inducida en el sistema de ensayo utilizado para este estudio tiene dos facetas. Por una parte, la toxicidad de los congéneres de MC depende de la extensión de su inhibición PP [85]. Por otro lado, la potencia es en función de transporte de capacidad de la respectiva OATP. Estos dos efectos no se han distinguido en el presente estudio. Mientras que algunos estudios anteriores sugieren que
in vitro e
in vivo
toxicidad están relacionados con la inhibición del enzima en lugar del transporte [78], [85], otros informes muestran la inhibición PP comparable de diferentes congéneres de microcistina , lo que implica que las diferencias de transporte contribuyen a
in vivo
toxicidad [80], [86].
No es de extrañar, de 22 años, con
O
-methylated d-iso Glu
6, es uno de los compuestos menos potentes. Las modificaciones del ácido carboxílico libre de Glu es probable que conduzcan a una pérdida de eficiencia debido a la pérdida de la interacción con una arginina cargada positivamente en el centro activo de las proteínas fosfatasas [7], y Glu (OMe) congéneres que contienen se han encontrado para inhibir PP1 a un grado mucho menor que contienen análogos MCs Glu [87] y tienen menor
in vivo
toxicidad [26]. Curiosamente, también 10, 11 y 21 muestran la toxicidad más débil que la mayoría de los otros congéneres. Mientras que 10 inhibe la PP2A unas veinte veces más débil en comparación con 1 [78], [80], [85], [86], su toxicidad en el presente ensayo es alrededor de 500 veces menor. Esto indica que en el caso de 10 (y también su análogo 11), es probable que la toxicidad no es sólo una cuestión de eficiencia de inhibición de PP, sino también de la capacidad de transporte de OATP, como MC-RR es una indicación en condiciones fisiológicas y, por tanto menos probabilidades de ser transportados a través de las membranas celulares por los transportadores de aniones. En general, la citotoxicidad en nuestro ensayo no se correlaciona con la proteína fosfatasa potencia de inhibición como se describe en la literatura para los compuestos 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 18, 19, 20, 23 [56], [ ,,,0],78], [80], [85], [86]. Así, nuestros datos indican que las diferentes eficacias de transporte tienen un mayor impacto en
in vivo
toxicidad que difieren potencia de inhibición de la proteína fosfatasa.
Es interesante que los MCs más potentes, con CI
50 valores en el rango sub-nanomolar (5, 6, 7, 8, 17, 18, 19), todas las combinaciones de características de cualquiera Leu
2 y Tyr /Phe /Trp
4 o Tyr /hty
2 y Tyr /hty
4. Arg está ausente de los congéneres más potentes. Los potentes congéneres menos con IC
50 valores & gt; 100 nM (10, 11, 21, 22), todos cuentan con Tyr
2 y Arg /Har
4 o Arg
2 y Arg
4. La presencia de Arg, en general, reduce la potencia, una vez más el apoyo a la hipótesis de que la carga positiva residuos de Arg obstaculizan la eficiencia del transporte, además de reducir la inhibición de PP2A, y por lo tanto menor
in vivo
toxicidad.
Resumen y Conclusiones
en nuestra proyección de 23 variantes naturales MC, se han encontrado varios MCs con un CI
50 en el intervalo nanomolar baja y con una selectividad transportador que favorece OATP1B3 sobre OATP1B1 en un factor de hasta treinta. Aunque la presencia de Arg en general disminuye la potencia de MC citotoxicidad, su presencia en la posición 2 de la estructura del núcleo MC también parece ser importante para la selectividad OATP1B3, lo que implica que este transportador podría ser más tolerante a la naturaleza catiónica de Arg en condiciones fisiológicas que OATP1B1. Además, la presencia de los aminoácidos aromáticos ligeramente ácidos Tyr o hty en la posición 4, además de Arg en la posición 2 parece beneficioso para la selectividad OATP1B3. Se necesitan
más estudios para discriminar si las diferencias observadas en la potencia son debido a diferentes inhibición PP o diferente capacidad de transporte de la OATP. Sin embargo, los resultados anteriores sugieren que
in vivo
toxicidad depende principalmente de la cinética de transporte de OATP que en las diferencias en la inhibición de PP [80], [86].
A pesar de que las relaciones entre las estructuras deducidas son ambiguas en algunas partes, las características estructurales observados para la selectividad OATP1B3 pueden condensarse a la en la actualidad más probable es selectiva estructura general ciclo (-d-Ala
1-L-Arg
2-D- (Me) Asp
aminoácidos 3-l-aromático
4-Adda
5-D-Glu
6 - (
E
) -Dhb
7). Esta estructura general se puede utilizar como punto de partida para la generación de nuevos compuestos por ejemplo por la alimentación de precursor o estrategias biocombinatorial
Uno de los retos de la utilización de MCs como conduce drogas sigue siendo:. Incluso con variantes MC selectivos, toxicidad hepática podría seguir siendo un reto importante, por lo que es necesario para generar variantes MC que podrían ser metabólicamente desintoxicados por las células sanas del hígado y /o eficiente effluxed en la bilis, y así aprovechar los mecanismos de desintoxicación y depuración hepática que no se encuentran en los tumores.
materiales y Métodos
cianobacterias material
Varios
Microcystis aeruginosa
y
Planktothrix rubescens
cepas, así como un
Nodularia
cepa se han utilizado para producir los congéneres de microcistina estudiadas: 2 y 3,
Microcystis aeruginosa
TCC 265; 4 y 15,
Planktothrix rubescens
TCC 310; 5, 16 y 17,
Microcystis aeruginosa
TCC 850, 6, 9, 18, 19 y 20,
Planktothrix rubescens
TCC 862, 11,
Planktothrix rubescens
TCC 329, 12,
Microcystis aeruginosa
TCC 861, 14, 21, y 22,
Microcystis aeruginosa
TCC 480, 23,
Nodularia
sp. CBT 786. Las cepas se clasificaron en base a análisis de PCR y secuenciación de varios genes marcadores, así como su morfología, y se han depositado en la colección ciano Biotech (CBT) de cultivo bajo los números de acceso indicados anteriormente (Ciano Biotech, Berlín, Alemania). Las cepas se cultivaron en medio BG11 [88] a 20 ° C bajo luz continua (60-80 mol m
2 s
-1) en fotobiorreactores escala de 20 L y cosechado semi-continua durante un período de varios semanas.
El aislamiento de microcistinas
cepas de cianobacterias fueron seleccionadas por HPLC-DAD /IT-TOF-MS (C Kinetex mm de columna
18, 2.6 m, 100 × 3, Phenomenex, Torrance, EE.UU.), utilizando un gradiente de exploración lineal de acuosa CH
3CN (5 a 80% dentro de 25 min a 0,6 ml /min; 0,025% v /v de TFA) para confirmar la presencia MC por su espectro UV característico, así como la característica tándem MS de iones fragmento a
m /z 375
[52], [89]. cepas positivas seleccionados han sido cultivadas en medio BG11 [88] a 20 ° C bajo luz continua (60-80 mol m
2 s
-1) en 20 L de foto-biorreactor escala. Después de la cosecha de la biomasa y de la liofilización, las biomasas se resuspendieron en 50% de MeOH (v /v), se trató con una varilla de ultrasonidos (Bandelin, Berlín, Alemania) y se extrajo en un agitador durante 30 min. Después de la centrifugación las biomasas se extrajeron posteriormente usando (v /v). 80% de MeOH Los 50% de MeOH y 80% de extractos de MeOH de las respectivas biomasas se combinaron y secaron
a vacío
. Los extractos crudos se fraccionaron utilizando gradientes escalonados de agua-metanol en C
18 cartuchos en un sistema de VersaFlash (Supelco, Bellefonte, EE.UU.), y las fracciones que contienen MCs (controlada por HPLC) se secaron
a vacío
. Después de la reconstitución, estas fracciones se sometieron a HPLC semi-preparativa. Para una descripción detallada de los procedimientos de aislamiento de ver S1 Archivo. Microcistinas RR, LW, y LF y ácido okadaico se obtuvieron de Axxora, LLC (San Diego, CA), y microcistinas LR y YR se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
elucidación Estructura
las estructuras de los MCs aislados han sido determinados por la alta resolución de la espectrometría de masas en tándem [51], [52], [84], y confirmado por uno y espectroscopia de RMN bidimensional. Las muestras para la espectroscopia de RMN se disolvieron en 600 l d
6-DMSO. Los espectros de RMN se registraron a 600 MHz (
frecuencia 1H) en un espectrómetro Bruker AV-III usando enfriado criogénicamente 5 mm sondas de resonancia TCI-triples equipadas con un eje, gradientes de auto-blindado. DQF-COSY espectros [90] se registraron usando 2048 × 512 puntos de datos complejos con 8 exploraciones. Los espectros se hace referencia indirecta a tetrametilsilano a través de las señales residuales de d
6-DMSO (2,5 ppm para
1 H). tándem MS datos han sido adquiridos usando un HPLC acoplado a un espectrómetro de masas IT-TOF (Shimadzu Europe GmbH, Duisburg, Alemania) con ionización por electrospray en modo positivo y fueron evaluados utilizando la versión LCMSSolution software del proveedor 3.60.361 con la versión 1.13 Fórmula Predictor. Para el cálculo de fórmulas de suma, la masa monoisotópica un promedio de al menos tres exploraciones se ha utilizado. Los compuestos se separaron en un Kinetex C
18 columna (2,6 m, 100 x 3 mm, Phenomenex, Torrance, EE.UU.), utilizando un gradiente que va desde 5 a 80% CH
3CN en agua durante 25 min (0,1% ácido fórmico añadido como modificador). iones precursores correspondientes a [M + H]
+ se aislaron en la trampa de iones, fragmentado por la disociación inducida por colisión (CID) usando argón como gas de colisión (energía de colisión se establece en 150%, el gas de colisión para 100%, y q ( Frequency) a 45,0 kHz), y separados en el analizador TOF. exploraciones de MS /MS se promediaron y se convierten al formato mzXML utilizando el software del proveedor y evaluada con la mMass software (fragmentos de iones calculados: M, a, b, c, y Z; modificaciones: -H
2O, -NH
3, + CO, definido, combinaciones, a juego con una tolerancia de 0,01 Da) [91]. HRMS tándem anotadas y
1 H-NMR de todos los compuestos aislados se puede encontrar en el archivo S2.
Líneas celulares y ensayos de citotoxicidad
hepatocitos primarios no son adecuados para el estudio de la toxicidad y el transporte microcistina , como transportadores de OATP están regulados a la baja en cuestión de horas tras la colocación de las células en cultivo [92]. Por lo tanto las líneas celulares HeLa y RKO se obtuvieron de ATCC y se transfectaron con vectores de expresión para OATP1B1 y OATP1B3. Los clones individuales se aislaron por una dilución limitante, y los clones aislados que muestran altos niveles de expresión por PCR se caracterizaron adicionalmente como se describe anteriormente [72], [93]. Se seleccionaron clones individuales HeLa y RKO para su estudio por la demostración de un aumento de [3H
] -BQ123 captación, un sustrato para ambos transportadores. Además, los clones OATP1B3 demostraron una mayor captación de [
3H] -CCK-8, un sustrato específico para OATP1B3 pero no OATP1B1, mientras que los clones OATP1B1 no mostraron captación de [
3H] -CCK-8. Además, se utilizaron células RKO y HeLa transfectadas de forma estable con un vector de expresión vacío como control. Para los ensayos de citotoxicidad, las células se sembraron por triplicado en placas de microtitulación de 96 pocillos en un medio que contiene suero bovino fetal al 5% a densidades de 1000 células /pocillo. Después de 24 horas, se añadió medio que contenía variantes estructurales MC a las células. Después de otros 3 días, la supervivencia celular se determinó con un ensayo basado en sulforrodamina como hemos descrito previamente [93] - [95]. Como las curvas dosis-respuesta para la apoptosis causando microcistinas son empinadas y bajan a 0 en 72 horas, el ensayo sulfordamina es indicativo de la muerte celular [72], [93]. El IC
50 se calcula a partir de la curva de respuesta a la dosis como la concentración de fármaco que produce una disminución del 50% en la absorbancia media en comparación con los pocillos no tratados y se expresa como la media de al menos tres determinaciones independientes realizados por triplicado usando software Prism .
Apoyo a la Información
archivo S1.
detalles sobre el aislamiento de la microcistina Los congéneres
doi:. 10.1371 /journal.pone.0091476.s001 gratis (PDF)
archivo S2.
anotados en tándem HRMS y
espectros de 1H-RMN de todos los compuestos aislados. Los datos en bruto NMR y MS de estos compuestos están disponibles de forma gratuita a través de Internet en http://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.880755.
doi:10.1371/journal.pone.0091476.s002
(PDF)
Acknowledgments
TN y MSH gracias Ciano Biotech GmbH para la ayuda y el permiso para publicar este manuscrito. Agradecemos a R. Lethaus-Weiß por su ayuda en el cultivo de las cepas de cianobacterias y la extracción de la biomasa, y P. Schmieder y B. Schlegel (FMP Berlin-Buch) para el registro de los espectros de RMN.