Extracto
Antecedentes
Amplia detección del antígeno prostático específico del cáncer de próstata genera un elevado número de biopsias innecesarias y sobre-tratamiento debido a la insuficiente diferenciación entre tumores indolentes y agresivos. La hipótesis de que el plasma seminal es una fuente sólida de biomarcadores novela de cáncer de próstata (CaP) con el potencial para mejorar el diagnóstico primario de distinguir y avanzada de la enfermedad indolente.
Metodología /Principales conclusiones
un estudio abierto de estudio de caso /control de 125 pacientes (70 CaP, 21 hiperplasia prostática benigna, prostatitis crónica 25, 9 controles sanos) se inscribieron en 3 centros. 7) Se buscaron; paneles de biomarcadores para el diagnóstico a) PCA (comparación de pacientes con CaP frente a los controles benignos) y b) para la enfermedad avanzada (comparación de los pacientes después de la cirugía con Gleason & lt; 7 frente a Gleason & gt. cohortes independientes fueron utilizados para el descubrimiento de biomarcadores proteómicos y probar el rendimiento de los perfiles de biomarcadores identificados. El plasma seminal fue perfilada mediante electroforesis capilar espectrometría de masas. Se determinó la estabilidad pre-analítica y precisión analítica del análisis del proteoma. Apoyo al aprendizaje de máquinas de vectores se utilizó para la clasificación. aplicación por etapas de dos firmas de biomarcadores con 21 y 5 biomarcadores proporciona 83% de sensibilidad y 67% de especificidad para la detección de CaP en una prueba de conjunto de muestras. Un panel de 11 marcadores biológicos para la enfermedad avanzada discriminación entre pacientes con puntuación de Gleason 7 y confinado en el órgano (& lt; pT3a) o enfermedad avanzada (≥pT3a) con una sensibilidad del 80% y 82% de especificidad en un entorno validación preliminar. perfiles seminales mostraron estabilidad preanalítica excelente. Ocho biomarcadores se identificaron como fragmentos de N-acetyllactosaminide beta-1,3-N-acetilglucosaminiltransferasa, fosfatasa ácida prostática, Stabilin-2, miembro de la familia GTPasa IMAP 6, semenogelina-1 y -2. tamaño de la muestra restringida fue la principal limitación del estudio.
Conclusiones /Importancia
El plasma seminal representa una fuente sólida de potenciales fabricantes de péptidos para el diagnóstico primario del CaP. Nuestros resultados justifican aún más la validación prospectiva para confirmar el potencial diagnóstico de biomarcadores candidatos identificados seminales
Visto:. Neuhaus J, E Schiffer, von Wilcke P, Bauer HW, Leung H, Siwy J, et al. (2013) Seminal plasma como fuente de candidatos del cáncer de próstata Péptido de biomarcadores para la detección de indolente y la enfermedad avanzada. PLoS ONE 8 (6): e67514. doi: 10.1371 /journal.pone.0067514
Editor: Antonia Vlahou, Fundación de Investigación Biomédica de la Academia de Atenas, Grecia
Recibido: 24 Septiembre, 2012; Aceptado: 23-may de 2013; Publicado: 24 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Neuhaus et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue financiado en parte por el Ministerio alemán de Economía y Technolgy BMWi con subvención Nº KF0362802MD8 a JUS, JN, PW, ES, JS y otorgar Nº EP110141 a ES y JS. Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. ES y JS son empleados de Mosaiques Diagnostics GmbH. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
El cáncer de próstata (CaP) es la segunda cáncer más frecuentemente diagnosticado y la sexta causa principal de muerte por cáncer en los hombres en todo el mundo [1]. La introducción de la detección del antígeno específico prostático (PSA) condujo a un aumento significativo en el número de casos diagnosticados [2], pero no pudo demostrar un beneficio estadísticamente significativo de la mortalidad del cáncer de próstata [3]. El noventa y cinco por ciento de los hombres con cáncer de PSA-detectado que son seguidos durante 12 años no mueren por CaP, incluso en ausencia de tratamiento definitivo, como la prostatectomía radical, radioterapia o terapia hormonal [3].
Esto ha exagerado considerablemente nuestra actual incapacidad para hacer recomendaciones basadas en la evidencia sobre las opciones de tratamiento de acuerdo con el comportamiento del tumor, es decir, clínicamente insignificante, o una enfermedad indolente y clínicamente significativa, o enfermedad avanzada [4]. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevas modalidades de detección para reducir el número de hombres que requieren biopsia y para mejorar la precisión discriminatorio entre tumores indolentes que tiene un pronóstico clínico favorable, incluso sin la intervención, y la enfermedad que es probable que ya hayan clínicamente avanzados, con el fin de reducir el exceso de diagnóstico y un tratamiento excesivo.
detección de biomarcadores proteómicos ha llegado a ser popular durante la década pasada. Sangre, orina, fluidos prostáticos, y el tejido prostático se han evaluado como fuente de biomarcadores. Varios biomarcadores candidatos que se encuentran en esos estudios se introdujeron como biomarcadores en un intento de abordar las necesidades clínicas para la discriminación de la enfermedad indolente y avanzado [5] - [7]. Sin embargo, todos los biomarcadores individuales disponibles en la actualidad, la falta precisión diagnóstica para la aplicación clínica de rutina. La alta variabilidad biológica del cáncer de próstata sugiere que un distinto conjunto claramente definido de biomarcadores, en lugar de un solo biomarcador, puede ser más eficiente para evaluar con precisión la enfermedad. Los recientes avances técnicos, especialmente en la espectrometría de masas y la computación, permiten la aplicación de perfiles proteómicos para el descubrimiento de biomarcadores de proteínas múltiples.
Recientemente, hemos identificado y validado un patrón proteómico de 12 presentes en la naturaleza, los biomarcadores de péptidos urinarios en masa electroforesis capilar espectrometría (CE-MS), capaz de detectar CaP usando la primera orina de flujo con una sensibilidad del 90% y 61% de especificidad [8], [9]. Estos experimentos sugirieron que los fluidos prostáticos pueden servir como fuente de biomarcadores [10]. Sobre la base de estos resultados, la hipótesis de que el plasma seminal podría ofrecer una fuente sólida para identificar nuevos perfiles fabricante de proteína CaP. Este estudio tuvo como objetivo una evaluación sistemática de la estabilidad del plasma seminal pre-analítica y de su idoneidad para el desarrollo de paneles de biomarcadores CaP.
Resultados
resultado clínico de los pacientes
70 Total de pacientes con CaP, 21 pacientes con hiperplasia prostática benigna (BPH), 25 pacientes con prostatitis crónica (PC) y 9 controles sanos (HC) fueron incluidos en el estudio (Tabla 1 y Figura 1). CP y los grupos HC eran significativamente más jóvenes que los pacientes en los grupos de la hiperplasia benigna de próstata (BPH) (Tabla 1) PCa y. A medida que los niveles de PSA esperados fueron significativamente inferiores en los CP y HC en comparación con la HPB (0,98 - 6,70 ng /ml) o CP (2,0 - 20 ng /ml) en tanto, la formación y el equipo de prueba (p & lt; 0,05, prueba de Mann Whitney, dos cola; Tabla 1). La clasificación TNM reveló 60 organoconfinado (≤pT2c) y 10 CaP avanzado (≥pT3a). La asignación de los pacientes a los grupos de bajo y alto riesgo variaba considerablemente entre los sistemas de clasificación (Tabla 1).
En el descubrimiento de biomarcadores en el total de 125 muestras de plasma seminal fueron utilizados a partir de 70 pacientes con CaP, 21 pacientes con hiperplasia benigna de próstata ( HPB), 25 pacientes con prostatitis crónica (PC) y 9 controles sanos (HC). Este conjunto de muestras disponibles se utilizó en composición variable en tres grupos de estudio. En el estudio A "Marcadores de diagnóstico" 50/125 pacientes con y sin cáncer de próstata (CaP 22, 14; CP 9 BPH y 5 HC) fueron utilizados para el descubrimiento de biomarcadores y los restantes 75/125 pacientes (48 con CaP, 12 HPB, 11 CP y 4HC) se utilizó para ensayos de rendimiento diagnóstico. En el Estudio B "enfermedad avanzada Marcadores" muestras de ACP disponibles (n = 70) fueron estratificados de acuerdo con la puntuación de Gleason. Para los pacientes descubrimiento de biomarcadores con puntuación de Gleason & lt; 7 (n = 21) y la puntuación de Gleason & gt; 7 (n = 16) fueron comparados. Los restantes 33/70 pacientes con Gleason 7 (28 enfermedad indolente & lt; pT3a y 5 ≥pT3a enfermedad avanzada según las directrices de los EUA) se utilizaron para probar el rendimiento clínico. perfiles Por otra parte, en el estudio C evaluación preliminar de la estabilidad y la precisión del método se realizó.
perfiles proteómicos
Análisis de CE-MS cedía de alta resolución (Figura 2, Tabla S1). Para la calibración perfil preliminar se utilizó péptidos marcados con isótopos sintéticos como referencia. Esta pre-calibración permitió definición de 287 "péptidos casa de mantenimiento" como puntos de datos en masa de referencia y el tiempo de migración. A medida que la intensidad de señal de iones (amplitud) mostró una variabilidad significativa, las señales de 46 péptidos muy abundantes fueron utilizados como péptidos estándar interno para la normalización de la señal (Tabla S2). Estos péptidos estaban presentes en & gt; 97% de las muestras analizadas y mostraron menor variabilidad de la señal. El procedimiento de uso de "patrón interno" para la normalización de amplitud, ha demostrado ser un método fácil y fiable para hacer frente a las variaciones tanto de análisis y de dilución en un solo paso de calibración [11]. Espectrometría de masas [12] - [14] identificó 141 péptidos nativos seminales que representan 47 proteínas parentales diferentes (Tabla S3). Ochenta y ocho péptidos identificados (83/141, 59%) eran fragmentos de semenogelina-1 o -2, con mucho, los péptidos más abundantes del proteoma de bajo peso molecular seminal.
La electroforesis capilar acoplada a espectrometría de masas de perfiles del plasma seminal humano revelaron un total de 1784 péptidos. Los péptidos sintéticos se disparó a las muestras con fines de pre-calibración están marcados con flechas blancas. peso molecular normalizado (700 a 25,000 Da) en escala logarítmica se representa frente a tiempo de migración normalizado (15-45 min). La intensidad media de la señal del pico de polipéptido se da en 3D-representación. conjuntos de datos recopilados de CaP (caso) combinan todos los controles y también por separado CP (control), se muestran BPH (control) y HC (control) del conjunto de entrenamiento.
descubrimiento de biomarcadores
Estudio a:. marcadores de diagnóstico de
en el descubrimiento de biomarcadores de diagnóstico se dividió a los 125 muestras disponibles en un descubrimiento conjunto con CaP 22, 14 CP; 9 HPB y 5 muestras de HC y el restante 48 CaP, 12 HPB, 11 CP, y las muestras 4HC en un conjunto de pruebas independientes (Figura 1). estadísticas múltiples pruebas dieron como resultado 21 polipéptidos discriminatorias alterado de manera significativa entre los pacientes con y sin cáncer de próstata (Tabla 2 y Figura 3). Seis de los 21 polipéptidos se identificaron como fragmentos de N-acetyllactosaminide beta-1,3-N-acetilglucosaminiltransferasa, fosfatasa ácida prostática, semenogelina-1 y -2 (tabla 3). . Con el fin de definir biomarcadores candidatos diferenciar de forma fiable CaP y HPB, se comparó la HPB
vs
PCA, HPB
vs
CP & amp.; . HC, y HPB
vs
CP & amp; CP & amp; HC utilizando múltiples estadísticas de ensayo adecuadas. Cinco polipéptidos fueron significativos en las tres pruebas que sugieren la idoneidad de estos candidatos para identificar específicamente BPH y por lo tanto para excluir la presencia de CaP (Tabla 2, Figura 3). Uno de ellos era un fragmento del miembro de la familia GTPasa IMAP 6 (Tabla 3)
.
peso molecular normalizado (700 a 25,000 Da) en escala logarítmica se representa frente a tiempo de migración normalizado (15-45 min). La intensidad media de la señal del pico de polipéptido se da en 3D-representación. se muestran los conjuntos de datos promediados de la formación conjunto
Hemos aplicado un enfoque de dos pasos:. (i) un primer panel (21 polipéptidos, 21pp) de discernir CaP y HPB de próstata inflamatoria y sano; (Ii) un segundo panel (5 polipéptidos, 5PP) para diferenciar PCa y la BPH. Ambas firmas fueron entrenados en la cohorte de descubrimiento (figura 1) el uso de algoritmos de máquinas de vectores soporte (SVM) y alcanzaron valores del AUC de 100% (IC del 95%: 93% -100%) para 21pp y el 99% (IC del 95%: 90% -99 %) para 5PP.
para la confirmación de clasificación de rendimiento de las firmas de biomarcadores se aplicó la combinación de 21pp y 5PP a un conjunto de pruebas independientes de CaP 48, 12 HPB, 11 CP, y 4HC (Figura 1). Las muestras positivas para 21pp (por encima de la clasificación cortada) fueron re-clasificados utilizando 5PP para identificar específicamente la HBP con exclusión de CaP. Por lo tanto, las muestras positivas y negativas para 21pp para 5PP fueron considerados como CaP, las muestras positivas en los grupos especiales se consideraron como BPH y las muestras negativas para 21pp (por debajo de la clasificación cortada) se consideraron como CP o de control HC muestras. Este enfoque identificó correctamente 40 de las 48 muestras de CaP [sensibilidad del 83% (IC del 95%: 70% -93%)], 6 de 12 de la HPB y 12 de los 15 controles [67% de especificidad (IC del 95%: 46% -83%)] . valor AUC fue del 75% (IC del 95%: 64% -83%,
P
= 0,0001). El rendimiento diagnóstico observada fue tan alto como el rendimiento de PSA como referencia, que mostró 87% de sensibilidad (CI 95% 75% -97%) y 59% de especificidad (CI 95% 40% -80%).
Estudio B: biomarcadores de la enfermedad avanzada
en el descubrimiento de biomarcadores de la enfermedad avanzada que divide las 70 muestras de ACP disponibles en un conjunto de entrenamiento con 37 muestras de CaP (21 posterior a la cirugía Gleason & lt; 7, 16 después de la cirugía de Gleason score & gt; 7). Las 33 muestras restantes con post-cirugía de Gleason 7 se utilizaron como un conjunto de prueba. La comparación de la 21 GS & lt; 7 pacientes (& lt; pT3a) a 16 GS & gt; 7 pacientes (11 & lt; pT3a, 5 pT3a) utilizando estadísticas corregido para múltiples pruebas dio lugar a 11 candidatos de biomarcadores con un fragmento de Stabilin-2 entre ellos (Tablas 2 y 3). Estos como patrón se encontraron (11pp) para clasificar la cohorte con una AUC de 99% (IC del 95%: 87% -100%, Figura 1).
Para probar el rendimiento de los biomarcadores asociados con la enfermedad avanzada, 11pp se aplicó a la prueba de conjunto de los pacientes con post-cirugía de Gleason 7 que no se utiliza para el descubrimiento de biomarcadores. De las 33 muestras, 9 obtuvieron tan avanzadas (por encima de la clasificación cortada) y 24 tumores indolentes (por debajo de la clasificación cortada).
En diversos sistemas de clasificación de práctica clínica se utilizan para estimar el riesgo de progresión del cáncer de próstata . Por lo tanto, se compararon los resultados de nuestros biomarcadores a cinco sistemas de uso común (Tabla S4): resultados 11pp se correlacionó significativamente con estadios TNM [rho 0,423 (95% IC 0,093 a 0,669), P = 0,0142], la puntuación EAU [rho 0,408 ( IC del 95%: 0,076-0,659), P = 0,0183], y la puntuación de la NCCN [rho 0,365 (IC del 95%: 0,024-0,629), P = 0,0370] (Figura 4A-C), mientras que CAPRA, RTOG y la puntuación D'Amico no eran correlacionado (datos no mostrados). Usando la clasificación EAU como patrón de referencia, 11pp identificó correctamente 4/5 avanzada (≥pT3a) y 23/28 organoconfinada (& lt; pT3a) tumores, lo que resulta en una AUC de 83% (IC del 95%: 66% -94%,
P = 0,0055
, dos caras de potencia β = 0,84, Figura 5D). La sensibilidad fue del 80% (IC del 95%: 29% -97%) y la especificidad fue del 82% (IC del 95%: 63% -94%)].
(A) y bigotes parcelas .box de los resultados obtenidos en 11pp la cohorte de pacientes con CaP prueba con GS 7 estratificado según TNM, (B) EAU, y los sistemas de clasificación (C) de la NCCN. Los cuadrados negros indican las medianas y los bigotes de 1,5 veces los rangos intercuartil. Coeficientes de correlación de rango rho, los respectivos IC del 95% y los valores de p se han dado anteriormente. curva (D) ROC (líneas negras) para la clasificación 11pp de la cohorte de validación independiente de los pacientes con CaP GS 7 con la enfermedad, ya sea indolente (N = 28) o avanzado (N = 5) según la clasificación de la EAU como patrón de referencia. intervalos de confianza del 95% se representan como líneas discontinuas. La línea diagonal representa la probabilidad de adivinar con un área bajo la curva de 0,5. intervalos de confianza del 95% (IC) se muestran como líneas discontinuas.
(A) Un promedio de 1.887 ± 202 polipéptidos se detectó en cada una de las 14 mediciones almacenadas para diferentes tiempos a TA. La media está marcado con una línea gruesa; desviación estándar se resalta en color gris. (B) más allá de este cualitativos firmas de biomarcadores evaluación se aplicaron a la estabilidad 14 replica para obtener datos cuantitativos de la estabilidad dependiente del tiempo de plasma seminal. Para el análisis de correlación 21pp puesto de manifiesto una disminución significativa de las puntuaciones de SVM en el tiempo con rho de Spearman de -0.576 (IC del 95% a la -0,854 -0,07 p = 0,0379). El análisis de regresión reveló una tasa de disminución de -0.05 a.u. (& Lt; 2%) por hora. 5PP y 11pp muestran ninguna dependencia del tiempo significativo. (C) la precisión analítica de los clasificadores SVM establecidos se evaluó mediante la aplicación a 15 conjuntos de datos CE-MS obtenidos a partir de repeticiones independientes de una muestra de un paciente de 57 años de edad con BPH significativo. La media de las puntuaciones de clasificación fueron 0,619 ± 0,07, 0,81 ± 2,290 y -1,239 ± 0,18 para 21pp, 5PP, y 11pp respectivamente. Los coeficientes de variación fueron calculados dividiendo desviaciones estándar por el rango global observada de las puntuaciones de SVM [resaltado en gris, 21pp desde -1.50 a la +1,50 (3,0 UA), 5PP 4,50 a 3,0 (7,5 UA) y 11pp desde -1.50 a 1,50 (3,0 UA)]. Los coeficientes de variación fueron 2,2%, 10,8% y 6,1%, respectivamente. offs Clasificación de corte están representados por líneas horizontales. Las cajas representan los medios y desviación estándar como los bigotes
Estudio C:.. La evaluación de la estabilidad y reproducibilidad biomarcador
El plasma seminal demostró la estabilidad pre-analítica sólida a temperatura ambiente. Los perfiles obtenidos fueron muy similares sin desaparición masiva o formación de fragmentos degradados. Se detectó un promedio de 1887 ± 202 péptidos (Figura 5A) en 14 repeticiones. Investigación de la 21pp en estos 14 repeticiones para cuantificar dependencia del tiempo de la estabilidad reveló una disminución significativa de las puntuaciones de SVM en el tiempo con rho de Spearman de -0,576 (95% CI -0,854--0,07, P = 0,0379, Figura 5B). El análisis de regresión reveló una tasa de disminución de -0.05 a.u. (& Lt; 2%) por hora. 5PP y 11pp muestran ninguna dependencia del tiempo significativo. La precisión analítica de los clasificadores SVM establecidos se evaluó en 15 repeticiones independientes. La media de las puntuaciones de clasificación fueron 0,619 ± 0,07, 0,81 ± 2,290 y -1,239 ± 0,18 resulta en coeficientes de variación de 2,2%, 10,8% y 6,1% para 21pp, 5PP, y 11pp, respectivamente (Figura 5C).
Discusión
la hipótesis de que el plasma seminal es una fuente sólida de nuevos perfiles fabricante péptido ACC con el potencial para mejorar el diagnóstico primario de cáncer de próstata y para distinguir avanzada de la enfermedad indolente.
En contraste a los informes anteriores de perfiles proteómicos del plasma seminal mediante la digestión con tripsina [15], se utilizó plasma seminal nativo para el análisis de biomarcadores proteómicos. Las principales ventajas de este enfoque de arriba hacia abajo en péptidos de origen natural incluyen la capacidad de detectar directamente combinaciones de modificaciones post-traduccionales, variantes de la secuencia, y productos de degradación. Hemos detectado cerca de 2.000 diferentes péptidos seminales = 20 kDa. Esos eran fragmentos de proteínas parentales más grandes, las cuales fueron parcialmente también detectados anteriormente usando tríptico resúmenes. Sin embargo, nuestro enfoque también identificar componentes seminales aún desconocidas (Tabla S3)
.
La generación de estos péptidos de origen natural depende de la licuefacción proteolítica de la eyaculación y los resultados en varios fragmentos proteolíticos de las proteínas seminales. Enfermedades asociadas alteraciones en este proceso de licuefacción proteolítica podría explicar nuestra observación, que algunos fragmentos de origen natural muestran niveles significativamente alterados seminales y otros de la misma proteína parental no. Por lo tanto, la estabilidad preanalítica y la reproducibilidad analítica son de suma importancia para el éxito del descubrimiento de biomarcadores y validación clínica. Un primer hito en el presente estudio fue el desarrollo de un simple y reproducible procedimiento de muestreo consistente con condiciones de rutina clínica. Hemos permitido que la licuefacción para llegar a un estado estacionario final, documentada por un número constante de polipéptidos detectables con el tiempo (Figura 5A), pero el tiempo para probar el almacenamiento a -80 ° C controla para que sea inferior a 60 min para evitar la interferencia con la inestabilidad biomarcador dependiente del tiempo a temperatura ambiente (Figura 5B).
Las muestras de tejido de la próstata, sangre, plasma seminal, orina y con y sin masaje de la próstata están actualmente analizaron intensamente para potenciales biomarcadores CaP [5], [6]. Aunque se espera que el tejido a ser proximal al origen de la enfermedad y que se correlaciona con mayores concentraciones de biomarcadores, la toma de muestras de tejido está relacionado a la intervención invasiva con todos los riesgos y limitaciones. Por el contrario, el plasma seminal y en especial la orina son de fácil acceso. Sin embargo, el procesamiento proteolítico es de creciente importancia para la explotación de los marcadores de líquidos corporales. Nuestros datos preliminares sobre la estabilidad del plasma seminal (Figura 5 A /B) no proporcionaron evidencia de la degradación masiva después de la toma de muestras como en contraste, se observó para el suero de la sangre [16] o el plasma [17]. Por lo tanto plasma seminal podría combinar la alta proximidad a la glándula de la próstata como sitio del tumor sólo superado por muestreo de tejido de próstata directo con la excelente estabilidad y la accesibilidad de la orina [18] - [21], lo que es una fuente altamente prometedora para potenciales biomarcadores CaP.
Hemos sido capaces de definir y validar las firmas sólidas de biomarcadores para el diagnóstico de CaP. La sensibilidad del 83% (IC 95% 70% -93%) para el diagnóstico de CaP fue muy comparable con los reportados anteriormente para las firmas de biomarcadores urinarios basados CE-MS (sensibilidad 86% a 90%). La especificidad del 67% (IC del 95%: 46% -83%) fue ligeramente mejor que sus contrapartes en orina de 59% y 61%, respectivamente [8], [9].
Además, descubrimos una firma biomarcador seminal, que distinguía (
P = 0,0055
) pacientes con post-cirugía de Gleason 7 con indolente (& lt; pT3a) la enfermedad o avanzada (≥pT3a) con alta sensibilidad y especificidad del 80% y el 82% , respectivamente. rutina actual utilizando el nivel de PSA sérico clínica y pre-cirugía suma de Gleason puntuación para identificar la enfermedad avanzada sigue siendo insuficiente, ya que la mayoría de la detección detectado CaP tienen niveles de PSA entre 4-10 ng /ml suma las puntuaciones y moderados de Gleason de 6 y 7. Por lo tanto, estos biomarcadores, que se basan en datos de los resultados después de la cirugía como patrón de referencia, podrían representar una posibilidad futura de una diferenciación de pre-cirugía no invasiva de órgano confinado y etapas avanzadas del tumor. Además, la evaluación del tumor mediante puntuación puntuación de Gleason antes de la cirugía requiere procedimientos invasivos para obtener muestras de tejido, y se ve obstaculizada por la variabilidad significativa entre los operadores y las discrepancias entre los resultados anteriores y posteriores a la cirugía en tantos como 35% de los casos [22] . Además, entre los pacientes con enfermedad clínicamente localizado (etapas de tumores T1 y T2), aproximadamente el 30% se encontró que tenían tumores localmente avanzados después de la cirugía radical. Por lo tanto, hay un riesgo real de que la falta de tratamiento en este grupo de pacientes, si se gestiona por la vigilancia. En el futuro el perfil de biomarcador puede ayudar a evitar la falta de tratamiento en estos pacientes con presentación clínica es incierta
.
Uno de los expresados diferencialmente las proteínas seminales fue de próstata fosfatasa ácida (ACPP), que es un regulador negativo del crecimiento celular en células LNCaP [23]. La regulación por disminución de la ACPP celular se asocia con el crecimiento del tumor andrógeno-independiente y de alta tumorigenicidad de grados CP avanzado [23].
Hemos observado semenogelina-1 fragmento 316-344 (ID18990) como uno de los 21 polipéptidos regulados diferencialmente (Tabla 2 y Tabla 3). Mientras que este fragmento directamente se puede asignar a KLK3 (= PSA) escisión en el sitio 315 (SSIY-SQTE), esto no es válido para la otra observado semenogelina fragmentos. Estos no pueden ser explicados por KLK3 escisión sola, lo que implica la presencia de una red de actividad de la proteasa más compleja con múltiples eventos de escisión aguas abajo después de la escisión inicial KLK3 Es bien sabido que existen mecanismos de activación e inhibición mutua dentro de la cascada de licuefacción [24], lo que podría conducir a diferentes patrones de escisión "aguas abajo". El papel de las peptidasas potenciales involucrados en la formación de los fragmentos peptídicos específicos no se puede juzgar en la actualidad. En otros estudios experimentales la posible participación de exopeptidasas debe abordarse, que puede procesar adicionalmente los fragmentos iniciales. Sin embargo, la literatura actual es insuficiente para asignar los sitios especiales de escisión dentro de semenogelina a exopeptidasas distintas [25].
Nuestro estudio se enfrenta a varias limitaciones. Donación de plasma seminal con fines de diagnóstico está relacionado con varios problemas prácticos. Desde el presente estudio hemos aprendido que entre el 30-50% de los pacientes están dispuestos y son capaces de donar eyaculación antes de la cirugía prostática radical. Sin embargo, creemos que la aceptación mejorará mediante la comunicación de los prometedores resultados de nuestro estudio preliminar.
Podemos compensar parcialmente falta de cumplimiento por la inclusión de voluntarios sanos y pacientes con prostatitis crónica. A pesar de estas cohortes nos permitieron confirmar nuestra hipótesis inicial de que el plasma seminal ofrece una sólida fuente de biomarcadores, que también podrían haber introducido un cierto grado de sesgo relacionado con la discrepancia de edades en comparación con los grupos de CaP y HPB. Además, nuestros cohortes de prueba de cortes transversales son relativamente pequeños y sesgada. Por lo tanto, los futuros estudios confirmatorios deben importaría cohortes de control bien alimentados, equilibradas, y de la misma edad con datos de los resultados clínicos de los subtipos de CaP en el seguimiento. Sobre la base de los datos de prueba a pequeña escala que se presentan aquí, los cálculos del tamaño de la muestra para este tipo de estudio calculan un tamaño total de la muestra de 200 pacientes con CaP avanzado o agresivo y 302 pacientes con enfermedad localizada indolentes para demostrar una mínima sensibilidad y especificidad del 70% y 80% para el CaP avanzado, respectivamente.
Aunque el uso de la espectrometría de masas en tándem del estado de la técnica, no fuimos capaces de secuenciar todos los candidatos de biomarcadores. En contraste con la identificación de proteínas parentales de huellas másicas de péptidos trípticos, la secuenciación péptido nativo está limitada por modificaciones posteriores a la traducción, lo que complica no sólo la fragmentación de péptidos, pero también búsquedas de bases de datos posteriores.
Conclusiones
fueron capaces de confirmar nuestra hipótesis inicial de que el fluido seminal es una fuente robusta para la identificación de perfiles de fabricante de proteína CaP para el diagnóstico primario de cáncer de próstata. Nuestro estudio implica un enfoque experimental de dos pasos con los sistemas de detección y pruebas independientes de muestras en relación con la norma de referencia clínica después de la cirugía. Este diseño está en consonancia con las directrices actuales para el análisis del proteoma clínica [26]. Aunque nuestros cohortes son relativamente pequeñas y seleccionadas, que eran apropiados para evaluar la viabilidad del establecimiento de perfiles seminal y para estimar el potencial de los péptidos seminales como biomarcadores de diagnóstico. Por lo tanto, el presente estudio debe entenderse como un primer paso en el campo de los biomarcadores seminales. Nuestros resultados justifican más estudios confirmatorios con cohortes prospectivo de validación no seleccionados agrandados para confirmar y precisar el potencial diagnóstico de los biomarcadores candidatos seminales y su (pato) relevancia fisiológica.
Materiales, Pacientes y métodos
Declaración de ética
el estudio fue aprobado por el Comité de ética de la Universidad de Leipzig (Reg.No. 084-2009-20042009) y se llevó a cabo de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes.
Diseño del estudio y el plasma seminal de muestreo
explotables muestras de plasma seminal se obtuvieron de 70 pacientes con CaP, 21 pacientes con hiperplasia prostática benigna (BPH), 25 los pacientes con prostatitis crónica (CP) y 9 controles sanos (HC). Como patrón de referencia clínica se utilizó una combinación de estudio diagnóstico histológico de muestras de prostatectomía radical para la clasificación posterior a la cirugía del tumor y la estadificación de pacientes con CaP y 10-12 cilindros de la biopsia de próstata aguja negativos y /o muestras de resección de la próstata negativas en pacientes con HBP. Se pidió a todos los pacientes para donar fluido seminal antes de la resección quirúrgica radical de la próstata, durante la infertilidad o diagnósticos urológicos. Para el descubrimiento de biomarcadores los disponibles 125 muestras fueron separados en tres grupos de estudio, uno de los biomarcadores de diagnóstico (estudio A), un segundo de biomarcadores de la enfermedad avanzada con diferente formación y unidades de prueba (estudio B), y la estabilidad de biomarcadores y la reproducibilidad (estudio C, figura 1). En los estudios de A y B, las muestras se utilizaron ya sea para el descubrimiento o para pruebas de rendimiento, pero no ambos. Cincuenta muestras (22 CaP, 9 de BPH, 14 CP, 5 HC) se utilizaron como conjunto de entrenamiento para el descubrimiento de biomarcadores de diagnóstico (Tabla 1A), 75 muestras se incluyeron en el conjunto de prueba para probar el rendimiento diagnóstico (48 CaP, 12 HPB, 11 CP , 4 HC, Tabla 1B). Para el descubrimiento de biomarcadores de la enfermedad avanzada se dividió a los 70 muestras de ACP disponibles en un conjunto de entrenamiento con 37 muestras de CaP (21 GS & lt; 7, 16 GS & gt; 7). Las 33 muestras restantes con GS = 7 fueron utilizados como un conjunto de prueba (28 & lt; pT3a "indolente", 5 ≥pT3a "avanzada")
Se compararon cinco enfoques diferentes para la evaluación del riesgo de progresión de CaP clínico. : basado en las directrices de la AUA [27], que adoptó los criterios D'Amico [28], los criterios de la National Comprehensive Cancer Network (NCCN) [29], el Radiation Therapy Oncology Group (RTOG) criterios [30], la de Europa Asociación de Urología (EAU) para [31] y el cáncer de la puntuación de la evaluación de riesgos de próstata (CAPRA) Resultado [32] (Tabla S4). Las muestras de plasma seminal fueron codificados y analizados internamente de una manera ciega (conjunto de prueba) después de establecer el perfil de biomarcadores (conjunto de entrenamiento).
Con el fin de analizar la estabilidad pre-analítica del plasma seminal obtenido por este protocolo de muestreo, una sola muestra de un paciente que alberga CaP se descongeló y se prepara en dos repeticiones independientes (estudio C). El resto de la muestra se incubó a temperatura ambiente. Durante seis horas, cada hora dos repeticiones estaban preparados. Todas las 14 repeticiones preparados se liofilizaron poco después de la preparación y re-suspendido inmediatamente antes del análisis CE-MS.
precisión analítica de los clasificadores SVM establecidos se evaluó mediante la aplicación a 15 conjuntos de datos CE-MS obtenidos a partir de repeticiones independientes de una muestra de un paciente de 57 años con HBP significativa. El volumen prostático fue de 120 cc y suero de PSA total 4,3 ng /ml. Los resultados se expresaron como media y desviación estándar. Los coeficientes de variación fueron calculados dividiendo desviaciones estándar por el rango global observada de las puntuaciones de SVM [21pp -1,50 a 1,50 (3,0 UA), 5PP -4,50-3,0 (7,5 UA) y 11pp -1,50 a 1,50 (3,0 UA)].
adquisición de muestras y análisis proteómico
eyaculado se recogió y se deja que se produzca la licuefacción naturales por proteolisis a temperatura ambiente durante 15 a 30 min. Posteriormente las muestras se centrifugaron a 4000 rpm durante 10 min para separar los espermatozoides a partir de plasma seminal. El sobrenadante se dividió en alícuotas en 50 ml de alícuotas y profundo congeló a -80 ° C hasta su posterior procesamiento.
Preparación de la muestra
Inmediatamente antes de la preparación, las muestras de plasma seminal se descongelaron y la concentración de proteína se ajustó a 2 mg /ml. 10 l-réplicas fueron liofilizadas, almacenadas a 4 ° C.