Extracto
El cáncer de páncreas es una neoplasia maligna humana devastadora y la ganancia de mutaciones funcionales en
K-ras
oncogén se observa en el 75% -90% de los pacientes. Los estudios han demostrado que oncogénicos
ras
no sólo es capaz de promover el crecimiento celular o la supervivencia, pero también apoptosis, dependiendo de las circunstancias. El uso de líneas celulares de cáncer pancreático con o sin expresar mutado
K-ras
, hemos demostrado que la inhibición de la actividad de la PKC endógenos sensibiliza las células de cáncer de páncreas humano (MIA y PANC-1) que expresa mutados
K-ras
a la apoptosis, que no tuvo ningún efecto apoptótico sobre las células de cáncer de páncreas BxPC-3 que contienen una Ras normal, así como epiteliales de pulmón humano de células BAES-2B. En este proceso de apoptosis, el nivel de ROS se incrementó y PUMA se upregulated de una manera dependiente de p73-MIA y las células PANC-1. Posteriormente, se escinde la caspasa-3. Un total de inducción de la apoptosis requiere la activación de ambos ROS y las vías de p73 mediada. Los datos sugieren que la PKC es un factor crucial que hace frente aberrante
K-ras
para mantener la homeostasis de las células del cáncer pancreático que alberga mutados
K-ras
. Sin embargo, la supresión o la pérdida de la PKC rompe el equilibrio e inicia una crisis de apoptosis, en el que ROS y P73 aparecen el potencial, objetivos clave
Visto:. Shen L, Kim SH, Chen CY (2012) Sensibilización de Las células de cáncer pancreático humano mutado que albergan
K-ras
a la apoptosis. PLoS ONE 7 (7): e40435. doi: 10.1371 /journal.pone.0040435
Editor: H. Fazlul Sarkar, Wayne Facultad de Medicina de la Universidad del Estado, Estados Unidos de América
Recibido: 20 Marzo, 2012; Aceptado: 6 Junio 2012; Publicado: July 25, 2012
Derechos de Autor © 2012 Shen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado en parte por una JCRT interno (Centro Conjunto para la radioterapia, la Escuela de Medicina de Harvard) y el Instituto Nacional de Salud 1RO1CA100498 concedida a Chang Yan Chen. Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es una enfermedad con un pronóstico sombrío. En los Estados Unidos, aproximadamente 33.000 pacientes son diagnosticados con cáncer de páncreas cada año y casi un número igual morirán a causa de esta enfermedad maligna [1] - [3]. A nivel mundial, el cáncer de páncreas causa un número significativo de muertes al año. Varias características de esta enfermedad devastadora son responsables de la alta tasa de mortalidad, debido a la dificultad para detectar lesiones precursoras o darse cuenta de los síntomas hasta en las etapas avanzadas. El cáncer a menudo se somete a micro-metástasis, que es responsable de un mal pronóstico de esta enfermedad. Además, el cáncer de páncreas avanzado es a menudo resistente a la quimioterapia o radioterapia convencional. Todo esto indica la urgencia de desarrollar nuevas estrategias para el tratamiento de esta enfermedad mortal.
genética, epigenéticos y ambientales factores están implicados en la génesis y el desarrollo de cáncer de páncreas [1]. La patogénesis de esta enfermedad es a través de acumulación de cambios genéticos y moleculares, lo que resulta en defectos en el crecimiento, la adherencia y la integración de los páncreas. Las alteraciones moleculares en esta malignidad humana se ha demostrado que incluir cambios en las moléculas relacionadas con el crecimiento, supresores de tumores y los reguladores del ciclo celular [4] - [7]. Las perturbaciones en intracelular, las vías de señalización mitogénica o restricciones de proliferación proporcionan una ventaja para las células tumorales para su crecimiento o la supervivencia. receptor del factor (EGFR) de crecimiento epidérmico es la glicoproteína de membrana plasmática y ha demostrado desempeñar un papel crucial en la iniciación del cáncer de páncreas y el desarrollo [8] - [10]. Se han notificado los miembros de EGFR que se sobreexpresa frecuentemente en las células de cáncer de páncreas, que accordantly activan sus vías de señalización corriente abajo, tales como Ras y ERK, para promover el crecimiento celular y la supervivencia [11].
A pesar de una variedad de marcadores aberrantes genéticos han sido identificados en lesiones de cáncer de páncreas humano, las mutaciones más frecuentes fueron identificados en
K-ras
, y las de cerca siguientes eventos fueron la inactivación de los supresores de tumores de p16, ARF, p53 y SMAD4 [ ,,,0],12] - [14]. K-Ras pertenece a las proteínas de la familia Ras que son pequeñas de unión a GTP proteínas citoplasmáticas [15]. Los asociados constitutivamente activa Ras con GTP, y confiere la señalización incontrolable, mitogénica-estimuladoras a efectores corriente abajo, incluyendo Raf /MAPK, PI3K /Akt, JNK /p38 y RalGDS. Un modelo de ratón de cáncer de páncreas mostró que la expresión condicional de un alelo oncogénico de
K-ras
fue capaz de formar lesiones pre-ductal que progresaron a cáncer invasivo y metastásico a una frecuencia baja. knockout concurrente de p14 y ARF promovido y transforma estos pre-lesiones a los cánceres altamente invasivos y metastásicos [12] - [14]. Estos resultados indican que la activación de K-Ras induce lesiones pre-pancreáticos y los supresores de tumores (tales como p14 ARF o) la función de restringir la conversión maligna de estos precursores [12] - [14]. Sin embargo, no se ha explorado completamente si estas vías intracelulares en células de cáncer pancreático se pueden volver a dirigirse a cambiar en el programa de muerte celular.
Es bien sabido que Ras puede promover no sólo la proliferación o diferenciación celular, pero también la muerte celular programada. En la apoptosis mediada por APO1, la ligadura con APO1 (antígeno apoptosis 1) receptor provocó la acumulación de lípidos de la membrana y la activación de la ceramida, que a su vez, estimulan la actividad Ras para la inducción de la apoptosis [16], [17]. En los linfocitos, Ras jugó un papel importante en la IL-2 mediada por apoptosis, lo que aseguró rotación efectiva de los linfocitos [18], [19]. la activación de células abrupta promovidas quinasa MAP efector aguas abajo de Ras a someterse a la apoptosis [20], [21]. En respuesta a la estimulación relacionada con el estrés, JNK parecía funcionar a aguas abajo de Ras e inducir la apoptosis en las células cuando el estrés era persistente [22]. Hemos informado de que oncogénico Ha-Ras sensibiliza las células humanas o murinas a la apoptosis cuando la actividad de PKC endógeno se suprime [22]. En este proceso de apoptosis, el nivel de ROS se incrementó y cascada de caspasas se desencadenó [22]. Nuestro presente estudio destinado a comprobar, además, si
K-ras
mutación fue sintéticamente letal con la pérdida de la PKC en células de cáncer de páncreas.
PKC (proteína quinasa C) de la familia se compone de más de 11 isoformas que se clasifican sobre la base de sus funciones y estructuras bioquímicas en los clásicos (cPKCs: α, ß y? que son éster de forbol y calcio-dependiente), novela (nPKCs: δ, ε, η y θ que son phobol éster dependiente solamente ) y PKC atípicas (aPKCs: zeta y lambda que son independientes de éster de forbol y calcio). estímulos mitógenos (tales como factores de crecimiento), a través del aumento de la membrana DAG (diacilglicerol), activan la PKC. Mientras que los estudios han demostrado que la PKC participó en forbol respuestas mitogénicas de éster mediada, ahora está claro que la activación de PKC podría inhibir el crecimiento celular o incluso desencadenar la apoptosis, dependiendo de los tipos de las isoformas, diferencial de acoplamiento a los efectores [23], [24] . Por ejemplo, PKC α frecuencia media las respuestas proliferativas o tumorigénicas. En las células intestinales o mamarias, las mismas isoformas de PKC participan en las respuestas antiproliferativos. Sin embargo, diferentes isoformas de PKC en el mismo tipo de células podrían funcionar de forma opuesta. En murina NIH3T3, rata R6 o células epiteliales colónicas humanas normales, la sobreexpresión de PKC δ causó la detención del crecimiento, mientras que el aumento de nivel de PKC varepsilon inició proceso de transformación [25] - [27]. La evidencia emergente sugiere fuertemente que la PKC δ a menudo actúa como un supresor de tumores [24], [28]. Los estudios demostraron que la PKC no sólo delta era un regulador negativo de la progresión del ciclo celular o mediador positivo de la apoptosis, sino también prestan una alta resistencia a la promoción de tumores de la piel inducida por éster de DMBA-forbol en modelos animales [29], [30].
La diafonía entre PKC y vías de señalización Ras se ha observado [31]. En diferentes tipos de células, PKC y Ras interactúan ya sea en un lineal jerárquica o relación paralela cooperativa. En respuesta a la estimulación mitogénica, PKC se fosforiló en varios residuos de serina y posteriormente asociado con el dominio SH2 de Grb-2. El complejo que incluye Grb-2 /Sos fue, a su vez, forma de activar la señalización Ras en los linfocitos T [32]. La activación de la PKC y Ras en linfocitos fue capaz de movilizar a la PI3 quinasa para generar PIP3 y además causar diversas cascadas de proteína quinasa, que conduce a la activación de AKT y Rac para promover las actividades relacionadas con el crecimiento de células. También se informó de que a través de afectar a la actividad Rel, PKC tuvo una influencia negativa en la señalización mediada por Ras [31]. En ciertas células malignas, PKC se activa y capaz de fosforilación mediada por Bcl-2 para la promoción de la supervivencia [33], [34]. Mediante el bloqueo de las vías de señalización pro-apoptóticos, la activación de la PKC Bcl-2 inducida se sugirió que desempeñar un papel importante en la tumorigénesis de pulmón. La inhibición de la PKC por inhibidores farmacológicos en las células cancerosas de pulmón humano en cultivo provocó una respuesta apoptótica [35]. Nuestro estudio demostró que Ras inducida preferentemente la apoptosis en células de cáncer pancreático que albergan una activa
K-ras
después del bloqueo de la PKC. Nuestros datos sugieren que la cooperación de la PKC apareció crucial para las células de cáncer de páncreas que albergan K-ras mutado para sobrevivir.
Resultados
Sensibilización de células de cáncer pancreático que albergan K-ras mutado a la apoptosis después del tratamiento con Gö6976
Las funciones duelo de Ras para promover el crecimiento celular y la apoptosis fue bien documentado [20], [22]. Anteriormente, hemos demostrado que la co-inhibición de PKC α y β expresión o actividad era letal para las células que sobreexpresan murinos
v-ras
[22], [28]. Desde
K-ras ¿Cuáles son detectaron mutaciones en la mayoría de las lesiones de adenocarcinoma pancreático [1], nos llevó a examinar la susceptibilidad de las células de cáncer de páncreas a la apoptosis en respuesta al tratamiento con Gö6976 (un inhibidor de PKC específico para PKC alpha y β). El estado de expresión y la activación de K-Ras en diferentes líneas celulares de cáncer de páncreas humano y las células epiteliales de pulmón humano se ensayaron. El nivel de expresión de Ras en el cáncer pancreático humano MIA o células PANC-1 fue comparable con la de las células BEAS-2A de pulmón epiteliales y se detectó una cantidad ligeramente reducida de Ras en el cáncer pancreático BxPC-3 células (Fig. 1A). Posteriormente, los lisados de estas células se precipitaron con un RBD (dominio de unión a Ras de Raf) proteína de fusión-GST para probar el estado de activación de Ras. Un Ras activado se co-precipita con la proteína de fusión en MIA y células Panc-1, pero no en células BEAS-2B BxPC-3 o (Fig. 1B). La magnitud de la activación de Ras en MIA fue mayor que en las células PANC-1.
A. La expresión de Ras se examinó mediante análisis de inmunotransferencia en el cáncer pancreático humano BxPC-3, MIA, PANC-1 o epiteliales de pulmón de células BEAS-2B. Los pliegues de los niveles de expresión de Ras en células de cáncer pancreático en relación con la de las células BEAS-2B se midieron y se indican. La igualdad de carga de proteínas totales por carril se determinó mediante β-actina. B. Ras de unión a GTP actividad fue medida en estas células mediante el ensayo de Ras-GTP. La transferencia se volvieron a sondar con anticuerpos anti-Ras para juzgar equitativamente la carga de proteínas totales.
A continuación, se analizó la expresión de PKC en estas células, así como sus respuestas a la PKC activador PMA (forbol miristato acetato) o Gö6976 inhibidor. A nivel de expresión comparable de PKC se detectó en todas las líneas celulares (Fig. 2A). La actividad de la PKC inducción por PMA y el efecto inhibidor de Gö6976 sobre la actividad de la PKC inducida por PMA también se examinaron usando un kit de la actividad quinasa de PKC (Fig. 2B). En MIA sin tratar o las células PANC-1, actividad de la PKC fue ligeramente mayor que la de las células BxPC-3 o BEAS-2B no tratados. El tratamiento con PMA aumentó drásticamente la actividad de esta quinasa en todas las líneas celulares, que fue inhibida por Gö6976, lo que indica que la PKC era funcional en todas las células ensayadas.
A. lisados de células aisladas a partir de células no tratadas se sometieron a inmunotransferencia con el anticuerpo anti-pan-PKC.
β-actina
se utilizó para determinar la igualdad de carga de proteína total por carril. B. celulares lisados de las células con o sin tratamiento con PMA o PMA más Gö6976, se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-pan-PKC. Los inmunocomplejos se incubaron con [
32P] ATP γ-y los sustratos peptídicos para analizar la actividad PKC. Las barras de error representan SD de tres experimentos independientes (n = 3,
ρ Hotel & lt; 0,05).
PKC y Ras son los transductores de señal intracelular cruciales y participa en la transmisión de señales a regular diversas actividades biológicas o pato-biológica. La inducción de apoptosis por la supresión de PKC se informó en células murinas o humanas que expresan oncogénico
ras
[20], [22], [28]. Para probar si Gö6976 fue capaz de inducir apoptosis en líneas celulares de cáncer pancreático con o sin expresar mutado
K-ras
, ensayo de anexina V se realizó (Fig. 3A y B). tratamiento Gö6976 sensibilizado dramáticamente MIA y las células PANC-1 a la apoptosis y no desempeñó ningún papel en la inducción de la apoptosis en BxPC-3 células que contienen Ras normales de señalización, así como en epiteliales de pulmón humano de células BEAS-2B. En particular, las células MIA en el que la actividad de Ras fue mayor eran más susceptibles a la apoptosis inducida por Gö6976 que las células PANC-1. Para determinar si Ras fue responsable de la inducción de la apoptosis, se usó inhibidor de la farnesiltransferasa (FTI) para suprimir la actividad Ras (Fig. 3C). En presencia de la IVR, el tratamiento Gö6976 fue incapaz de inducir la apoptosis en MIA o células PANC-1. Los datos sugirieron que K-ras mutado, junto con la pérdida de la función de la PKC, apareció letal y esta reacción letal podría ser regulada por Ras mutado.
A. Las células se trataron con Gö6976 (1 M) durante 48 h y luego se recogieron para el ensayo de anexina V. Las barras de error se SD a partir de 5 experimentos independientes (n = 5,
ρ
& lt; 0,05). B. Los perfiles de las células después de ser teñido con anexina V. C. Las células fueron tratadas con FTI para 30 min antes del tratamiento Gö6976. Posteriormente, se llevó a cabo ensayo de anexina V. Las barras de error son SD de 5 experimentos independientes (n = 5,
ρ & lt; 0,05
) guía empresas
La regulación por incremento de ROS por Gö6976 en células de cáncer pancreático que albergan K-ras mutado para el. la inducción de la apoptosis
ROS (especies reactivas de oxígeno) se sabe que son necesarios para el crecimiento celular y por el contrario, un aumento persistente en ROS ha demostrado ser capaz de causar daño al ADN o desencadenar la apoptosis [36]. Los estudios revelaron que las ROS en células que expresan oncogenes (tales como
ras
) fueron a menudo aumentada, lo que podría ser debido a las altas necesidades metabólicas de crecimiento neoplásico [36]. los niveles de ROS en el cáncer de páncreas y células BEAS-2B se midieron en condiciones de crecimiento normales o después del tratamiento con Gö6976 (Fig. 4A). Se detectó una cantidad moderada de ROS en células MIA o PANC, que fue elevado dramáticamente después de la adición de Gö6976. ROS estaba en los niveles basales en las células y el tratamiento con el inhibidor de PKC no afectó a la producción o acumulación de ROS no tratada BxPC-3 o BEAS-2B.
A. Las células fueron tratadas con Gö6976 o co-tratadas con Gö6976 más NAC (2,5 mM). Después de ser teñida con DCF, los niveles de ROS en las células se analizaron mediante un citómetro de flujo. B. Las células fueron tratadas con Gö6976 (1 M) o Gö6976 más NAC. Posteriormente, se recogieron las muestras y se sometieron a ensayo de anexina V. Las barras de error son SD de 5 experimentos independientes (n = 5,
ρ Hotel & lt; 0,05).
Para determinar si ROS juega un papel en la inducción de la apoptosis después de la inhibición de PKC en las células de cáncer de páncreas que expresan mutados
K-ras
, se llevó a cabo el ensayo de anexina V (Fig. 4B). Una vez más, las células MIA y PANC-1 eran sensibles al tratamiento Gö6976, que era parcialmente, pero bloquean significativamente por NAC (N-acetil-L-cisteína, un inhibidor de la ROS). Desde NAC no suprime completamente la apoptosis en estas células, que sugiere la participación de otras vías en la ejecución de este programa de muerte celular. Consistentemente, las células de cáncer de páncreas sin expresar mutado
K-ras
o epiteliales de pulmón humano de células BEAS-2B no respondieron a Gö6976 así como para el tratamiento de combinación de Gö6976 además NAC.
Activación de caspasa 3 en esta reacción letal Ocurrió en MIA o PANC-1 en las células
familia de las caspasas se compone de más de 10 miembros [37]. En respuesta a los estímulos apoptóticos, se demostró que la caspasa-3 para funcionar como un ejecutor en cascada de caspasas para la realización del programa de muerte celular [37]. En este proceso, se requiere la caspasa-3 a escindir en un fragmento pequeño, activo. Para probar el estado de activación de la caspasa 3, la presencia de la caspasa 3 escindida en MIA o células PANC-1 se analizó mediante inmunotransferencia (Fig. 5A). Después del tratamiento con Gö6976, un pequeño, escinde la caspasa-3 fue de hecho presente en estas dos células de cáncer pancreático. La forma activa de esta caspasa era indetectable en las células BxPC-3 o BEAS-2B tratados con Gö6976 (datos no mostrados). Para examinar aún más la activación de la caspasa 3 con el mismo entorno experimental, se analizó la actividad de caspasa 3 (Fig. 5B). Después del tratamiento con el inhibidor, la actividad de esta proteasa se upregulated en MIA y las células PANC-1, que fue parcialmente suprimidos por la adición de NAC. En consonancia, la actividad de la caspasa 3 estuvo ausente en las células BxPC-3 tratadas con Gö6976 sin expresar mutado
K-ras
o células BEAS-2B. Los resultados sugieren que la caspasa 3 participó en la ejecución de la apoptosis inducida por Gö6976 en las células de cáncer de páncreas que alberga oncogénicos
K-ras
.
A. Con o sin tratamiento Gö6976, los lisados celulares se prepararon y se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpo anti-caspasa 3. B. Las células se sometieron al tratamiento con Gö6976 o Gö6976 más NAC. Posteriormente, se realizó el ensayo de anexina V. Las barras de error representan SD de 3 experimentos independientes (n = 3,
ρ Hotel & lt; 0,05).
Regulación al alza de la apoptótica Factor PUMA de una manera dependiente de p73-Durante GO6976- la apoptosis inducida
p73 pertenece a la familia p53 y comparte homología con p53 no sólo en sus secuencias, sino también la transactivación, las funciones de unión a ADN o de oligomerización [38]. En la apoptosis mediada por p73, el factor de PUMA relacionados con apoptosis a menudo se upregulated [38]. Hemos informado anteriormente de que después de la inhibición de PKC, p73 en fibroblastos murinos que expresan ectópica
Ha-ras
se activó y responsables de la iniciación de la apoptosis [28]. Durante este proceso de muerte celular, p73 se fosforiló en sus residuos de serina [28]. Para probar si p73 se fosforiló en MIA tratada Gö6976 o células PANC-1, se llevó a cabo el análisis de inmunotransferencia (Fig. 6A). se produjo la fosforilación de p73 en sus residuos de serina en las células tratadas, pero no en las células control. La fosforilación p73 Gö6976 mediada no alterado por la adición de NAC. Posteriormente, la expresión de p73-regulado
PUMA
gen de MIA o células PANC-1 se examinó mediante análisis en tiempo real PCR (Fig. 6B). El nivel de la expresión génica en las células fue significativamente mayor después del tratamiento con Gö6976. La regulación positiva del gen fue de nuevo sin cambios en la presencia de NAC, pero completamente suprimida por la infección transitoria de
shRNA-P73
. Consistentemente, la expresión de la proteína se aumentó después del tratamiento con el inhibidor de PKC (Fig. 6B). La introducción de
shRNA-p73 en las células
también bloqueó la inducción de la proteína PUMA, que no fue afectada por la adición de NAC (datos no mostrados). Al parecer, PUMA estuvo involucrado en el eje de la señalización de p73 mediada por apoptosis en este proceso.
A. Con o sin el tratamiento con Gö6976 o Gö6976 más NAC, los lisados se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-p73. Los inmunoprecipitados se sometieron a inmunotransferencia usando el anticuerpo anti-serina fosforilada. El nivel de los inmunoprecipitados fue juzgado por re-sondeo de la transferencia con anticuerpo anti-p73. B. ARN total de las células con o sin tratado con Gö6976, además Gö6976 NAC o Gö6976 más
se aislaron shRNA-P73
infección. La misma cantidad de ARN se transcribe inversa, y la expresión de
PUMA
fue probado por RT-PCR. C. Con o sin tratamiento Gö6976, MIA o PNAC-1 células fueron sometidas a análisis de inmunotransferencia para la expresión de PUMA. La igualdad de carga de proteínas totales se determinaron mediante representante en la sonda de la transferencia con anticuerpo anti-β-actina.
Cooperación de ROS y P73 para la inducción de la apoptosis mediada por Gö6976
es bien conocido que múltiples vías de señalización de apoptosis, se están integrando para una ejecución completa del programa de muerte celular. Desde ROS y p73 parecían tomar parte en la inducción de la apoptosis en Gö6976 tratados con células de cáncer pancreático que albergan mutado
K-ras
, primero a prueba si p73 juega ningún papel en la regulación al alza de ROS en las células del cáncer pancreático ( Fig. 7A). Una vez más, se detectó una moderada entre de ROS en MIA no tratadas o células PANC-1, que se aumentó aún más después de la inhibición de PKC. La infección transitoria de
shRNA-P73
no tenía ninguna influencia sobre la inducción de ROS, lo que sugiere que p73 en nuestro entorno experimental no estuvo involucrado en la señalización ROS. Posteriormente, se analizó la actividad de caspasa-3 después de la caída de p73 o co-inhibición de p73 y ROS (Fig. 7B). La introducción de
shRNA-p73
bloqueado parcialmente la actividad de la caspasa-3 en MIA tratado-GO-6976 o PANC-1 y la actividad de esta proteasa se abolió completamente después de la co-supresión de p73 y ROS. A continuación, la aparición de la apoptosis después de que los mismos tratamientos se analizó por el ensayo de anexina V (Fig. 7C). La caída de
P73
inhibió parcialmente el proceso de apoptosis inducida por Gö6976 en MIA o células PANC-1. En ausencia de ambos
P73 Opiniones y ROS, Gö6976 fue incapaz de iniciar la apoptosis en estas células. Los datos sugieren que al menos dos vías de apoptosis:. P73 y ROS participaron en esta reacción letal
El nivel de ROS en las células tratadas con Gö6976 o Gö6976 más
shRNA-P73
infección era analizado. Las barras de error representan SD de 3 experimentos independientes (n = 3,
ρ
& lt; 0,05). B. La actividad de caspasa 3 en las células tratadas con Gö6976, Gö6976 más
shRNA-P73
infección o Gö6976 además NAC más
shRNA-P73
la infección se ensayó. Las barras de error representan SD de 3 experimentos independientes (n = 3,
ρ
& lt; 0,05). C. Anexina V en el ensayo de MIA y PANC-1 en las células tratadas con Gö6976, Gö6976 más
shRNA-P73
infección o Gö6976 además NAC más se realizó
infección shRNA-P73
. Las barras de error representan SD de 3 experimentos independientes (n = 3,
ρ Hotel & lt; 0,05).
Discusión
El cáncer de páncreas es una neoplasia maligna humana y devastadora una de las principales causas de muerte por cáncer [1]. El pronóstico de esta enfermedad es pésimo, debido a la falta de tratamientos efectivos. Se sabe que el aumento de las mutaciones funcionales en
K-ras
se producen en etapas tempranas en pacientes con cáncer o modelos de ratón pancreático humano que se generaron por knockout de los genes supresores de tumores de
p16, Arf
, o
p53
, respectivamente, o en combinaciones de [12] - [14]. Estos resultados indican la importancia de K-Ras en la génesis y desarrollo del cáncer de páncreas. El objetivo de nuestro estudio fue explorar la nueva estrategia de focalización Ras oncogénico para la terapéutica de páncreas. El presente estudio demostró que aberrantes, mutados
K-ras
fue capaz de redirigir las células del cáncer pancreático hacia a la apoptosis después de la supresión de la PKC. En este proceso de apoptosis, múltiples vías de señalización estaban involucrados. Después del tratamiento con el inhibidor de PKC, el nivel de ROS en las células de cáncer pancreático que expresan mutado
K-ras
se incrementó, acompañados con la inducción de apoptosis. Sin embargo, la adición de NAC bloqueado parcialmente el proceso de la muerte celular. P73 fue fosforilada y, PUMA de genes y proteínas se upregulated. Además, la caspasa 3 se escindió de la ejecución del programa de muerte celular. El co-inhibición de ROS y p73 consigue un efecto de bloqueo final sobre la apoptosis en células de cáncer pancreático tratados con Gö6976 albergar mutados
K-ras
. Por lo tanto, nuestro estudio indica que Ras aberrante, junto con la pérdida de la PKC es sintéticamente letal en las células de cáncer de páncreas. Los datos también sugieren un equilibrio potencial entre Ras y PKC que determina el umbral de la apoptosis en las células.
activaciones mutacional de
ras
genes son uno de los eventos clave durante la iniciación y el desarrollo de varios tipos de tumores malignos humanos [15]. En el proceso de transformación, aumentos persistentes de interruptor de la actividad de Ras en diversas vías efectoras abajo, dando lugar a reacciones en cadena de fosforilación para la activación de factores de transcripción a favor del crecimiento [39]. A pesar de la participación esencial en el crecimiento y la diferenciación celular, Ras hiperactivos, bajo ciertas circunstancias, puede ser re-dirigido a la apoptosis. Numerosos estudios han puesto de relieve el papel de Ras en la regulación de la apoptosis [20]. En particular, se ha observado que los tratamientos con inhibidores de la PKC pueden inducir apoptosis en fibroblastos murinos o las células epiteliales del pulmón de rata que sobreexpresan oncogénico
ras
[22], [28]. Aquí, nos demuestran que la actividad de la PKC en las células del cáncer pancreático que albergan mutado
K-ras
fue ligeramente aumentada, que podrían ser necesarios para hacer frente a la alta actividad aberrante de Ras para sobrevivir. Después de PKC fue suprimido, mutado K-Ras no pudo mantener las necesidades metabólicas altas de las células cancerosas y se inició la reacción letal. Desde un alto porcentaje de cánceres humanos que albergan oncogénico
ras
, PKC parece una diana intracelular ideal para la inducción de la apoptosis, con un bajo efecto o ninguno tóxicos en los tejidos circundantes o células normales.
Más de 11 serina quinasas de proteína /treonina pertenecen a la familia PKC, algunos de los cuales son estructuralmente distintos o funcionalmente diversas. Sin embargo, hay una redundancia funcional entre estas isoenzimas PKC para restaurar el estado fisiológico normal cuando una o más isoenzimas PKC son eliminados o no funcional. El papel de las isoformas de PKC en la regulación del crecimiento celular o la muerte son bastante controversial, dependiendo de diferentes tipos de células o contextos celulares. Por ejemplo, se ha sugerido que los roles de duelo PKC α, β, delta poseía en la regulación del desarrollo de cáncer o la muerte celular programada, que indica la complejidad de estas isoenzimas PKC [24]. Cruzadas conversaciones entre las isoformas de PKC y con otros transductores de señales intracelulares eran a menudo presentes en un orden o jerarquía de los diferentes compartimentos para guiar a las células para conseguir diferentes resultados. También se demostró que la PKC y Ras vías de señalización estaban interconectados, especialmente en los linfocitos [24], [40]. Tras la estimulación mitogénica, los sitios de unión SH2 de PKC se fosforilaron, que a su vez recluta el complejo Grb2 /SOS y Ras activados más de señalización en los linfocitos T [24]. Se informó de PKC para regulada negativamente vía Ras, a través de que afecta a su efector Rel [24]. En las células NIH3T3 que expresan ectópica
v-Ha-ras
, p73 funcionó aguas abajo de PKCa y β y como un sensor para determinar el umbral de la apoptosis [22]. Utilizando el Gö6976 inhibidor de PKC que inhibe el éster dependiente de PKC isoformas de forbol, que en este estudio mostraron que las células del cáncer pancreático con hiperactividad K-Ras pueden ser sensibilizados de manera eficiente a la apoptosis. La investigación para identificar isoforma PKC clave (s) en la regulación de este proceso de apoptosis está en marcha.
ROS a menudo actúa como un transductor de señales intracelulares de factores de crecimiento [36]. Algunos estímulos mitógenos son capaces de aumentar el nivel intracelular de ROS, lo que resulta en la alteración de la estructura del citoesqueleto y la inducción de la transformación adicional [36]. En las células PC12, Ras se demostró que regular positivamente la producción de ROS en EGF estimulación [41]. Los estudios también demostraron que los oncogenes (tales como
myc
o
ras
), a través de la perturban persistentemente el estado de redox intracelular, fueron capaces de causar aberraciones cromosómicas y, posteriormente, interrumpir la integridad genética para promover la tumorigénesis [36 ]. A pesar de la regulación de la proliferación celular y transformación, se sugirió un aumento de ROS a desempeñar un papel obligatorio en la inducción de la apoptosis [22]. En la muerte celular programada TNFa inducida por NF-kappa B y JNK cooperaron para estimular la producción de ROS, lo que lleva a la cascada de caspasas y la despolarización mitocondrial [42]. La expresión ectópica de
Ha-ras Hoteles en fibroblastos murinos inducidos muerte celular a través de la obtención de estrés ER (retículo endoplasmático) y la activación de la UPR (respuesta a proteínas desplegadas) [22]. El presente estudio demostró que a pesar de ROS se elevó moderadamente en células de cáncer pancreático que expresan mutado
K-ras
en condiciones de crecimiento normales, la inhibición de PKC gravemente perturbado el equilibrio del estado redox e indujo una acumulación significativa de ROS en el Células. Por lo tanto, la PKC aparece un factor importante para mantener la homeostasis de las células de cáncer de páncreas que albergan una aberrante
K-ras
.
P73 pertenece a la familia de proteínas p53 y, comparte el homólogo estructural y funcional con p53 [38]. Los estudios mostraron que p73 juega un papel significativo en el ADN o Daños a la apoptosis inducida por el estrés. Nuclear c-Abl se activa por el estrés genotóxico y más p73 fosforilada para la inducción de la apoptosis [43]. En este proceso de muerte celular, nuclear c-Abl interactuó con p73 y p73 estimuló aún más las actividades reguladas. También se demostró que, en respuesta a tratamiento con radiación ionizante o cisplatino, p73 juega un papel clave en la transmisión de la señalización de apoptosis [44]. En fibroblastos murinos que sobreexpresan
V-Ha-ras
, PKC δ interactuado con más y activado p73 para desencadenar una crisis de apoptosis [28]. En este estudio, hemos demostrado que p73 se fosforila en células de cáncer de páncreas que alberga mutados
K-ras
, y posteriormente regulada por incremento del nivel de la expresión del factor de apoptosis PUMA. El mecanismo subyacente por el cual PUMA participa en este proceso de apoptosis aún no se ha investigado más a fondo.
En resumen, las mutaciones genéticas en
K-ras
aparecen únicamente presente en el 90% de las lesiones de cáncer de páncreas humano y esta enfermedad es una de las principales causas de muerte por cáncer. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de descubrimientos de tratamientos eficaces clínicamente. Nuestro estudio demostró que la aberrante K-Ras podría volver a dirigir a las células de cáncer de páncreas hacia la apoptosis, en el que se consideró necesario ROS y P73 para el inicio de este programa de muerte celular.