Extracto
Objetivo
fibrosante lesión hepática crónica es un importante factor de riesgo para hepatocarcinogenesis en los seres humanos. Los ratones con deleción dirigida de Mdr2 (el ortólogo murino de MDR3) desarrollar lesión hepática crónica fibrosante. El carcinoma hepatocelular (HCC) surge espontáneamente en tales ratones por 50-60 semanas de edad, proporcionando un modelo de hepatocarcinogenesis fibrosis asociada. Utilizamos Mdr2
- /- ratones para investigar la hipótesis de que la activación de la hedgehog (Hh) vía de señalización promueve el desarrollo tanto de la fibrosis hepática y carcinoma hepatocelular
Métodos
La lesión hepática y fibrosis. , activación de la vía de Hh, y las poblaciones progenitoras hepáticas se compararon en Mdr2
- /- ratones y controles de tipo silvestre de la misma edad. Un experimento de búsqueda de dosis con la señalización de Hh antagonista del GDC-0449 se llevó a cabo para optimizar la inhibición vía Hh. Los ratones fueron tratados con GDC-0449 o el vehículo durante 9 días, y los efectos sobre la fibrosis hepática y la carga tumoral se evaluó mediante inmunohistoquímica, QRT-PCR, Western blot, y la resonancia magnética.
Resultados
a diferencia de los controles, Mdr2
- /- ratones expresó consistentemente ligandos Hh y se acumula progresivamente miofibroblastos hepáticos y progenitores Hh-sensible con la edad. El tratamiento de ratones con deficiencia de Mdr2 edad con GDC-0449 inhibió significativamente la actividad Hh hepática, disminución de miofibroblastos y células progenitoras del hígado, reducción de la fibrosis hepática, promovido regresión de los HCC intra-hepática, y la disminución del número de metástasis de carcinoma hepatocelular sin aumentar la mortalidad.
Conclusiones
activación de la vía Hh promueve la fibrosis hepática y la hepatocarcinogénesis, y la inhibición de la señalización Hh segura invierte ambos procesos, incluso cuando la fibrosis y el CHC se avanzan
Visto:. Philips GM, Chan es, Swiderska M , Schroder VT, Guy C, Karaca GF, et al. (2011) de señalización Hedgehog Antagonista Promueve la regresión de la fibrosis hepática y Tanto el carcinoma hepatocelular en un modelo murino de cáncer primario del hígado. PLoS ONE 6 (9): e23943. doi: 10.1371 /journal.pone.0023943
Editor: Pranela Rameshwar, Universidad de Medicina y Odontología de Nueva Jersey, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Junio, 2011; Aceptado: 27 Julio 2011; Publicado: 2 Septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Philips et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado, en parte, por los Institutos nacionales de Salud (NIH) SR1 DK077794, NIH RO1 AA010154, NIH T32 DK007568, y NIH T32 CA071341. Una parte de la formación de imágenes se realizó en el Centro Duke para microscopía in vivo, con el apoyo, en parte, por el Centro Nacional de Investigación de Recursos Nacional de Tecnología Biomédica Centro de Investigación (P41 RR005959) y el Programa de Recursos Instituto Nacional del Cáncer de Pequeños Animales de imagen (U24 CA092656). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma hepatocelular (HCC) es un cáncer insidioso que da cuenta de hasta 1 millón de muertes al año y es la tercera causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. Cirrosis, una consecuencia de la lesión hepática y fibrosis progresiva, es el factor de riesgo más grande para el CHC [2]. Una herida alterada respuesta a una lesión hepática crónica curación, con la consiguiente activación desregulada de miofibroblastos y poblaciones de células progenitoras, se ha implicado en la patogénesis de la cirrosis y la eventual carcinogénesis [3].
Mutaciones
La pérdida de función en el canalicular del hepatocito flipasa fosfolípido PRFM3 (ABCB4) se han asociado con una amplia gama de enfermedades biliares humanos incluyendo familiar progresiva tipo de colestasis intrahepática 3 (CIFP3), colestasis del embarazo, la colestasis inducida por fármacos y una cirrosis biliar adulto con características similares a la colangitis esclerosante primaria (PSC) [4], [5], [6], [7]. Los ratones con una deleción dirigida de Mdr2 (ortólogo murino de PRFM3) carecen de la glicoproteína P específico del hígado que transporta la fosfatidilcolina (PC) a través de la membrana canalicular. La ausencia de fosfolípidos en la bilis en los resultados esclerosante progresiva colangitis con el acompañamiento de inflamación portal, la proliferación ductal y fibrosis portal. La lesión hepática se manifiesta poco después del nacimiento y carcinomas hepatocelulares surgen espontáneamente entre 50 y 60 semanas de edad [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14]. A diferencia de los modelos de xenoinjertos que son ampliamente utilizados para examinar los mecanismos y los tratamientos de- por- HCC, Mdr2
- /- ratones proporcionan un modelo que es paralela a la evolución natural del CHC en un fondo de la inflamación crónica, lesión hepática y fibrosis [15] .
análisis de la expresión génica en ratones heterocigotos y controles Mdr2 deficientes han demostrado la inducción robusta y sostenida de múltiples mecanismos de adaptación que controlan las respuestas celulares relacionadas con el estrés oxidativo, inflamación, metabolismo de los lípidos, y la proliferación, lo que provocó la especulación de que estos procesos contribuir a hepatocarcinogénesis [16]. Aunque no se evaluaron formalmente por estudios anteriores de los ratones deficientes en Mdr2, otra vía que podrían desempeñar un papel en hepatocarcinogenesis fibrosis asociada es Hedgehog (Hh), ya que la señalización de Hh se ha implicado tanto en la reparación fibrogénicos de lesión hepática y carcinoma hepatocelular.
la vía Hh es una vía de señalización conservadas evolutivamente que se activa cuando ligandos Hh (sonic hedgehog y Indian hedgehog) se unen a parcheado (PTC), un receptor transmembrana que se expresa en la superficie de las células que responden a Hh. Tras la unión del ligando, Ptc se inactiva, aliviando la represión de Smoothened (Smo), una proteína trans-membrana que media la señalización de Hh en el interior de la célula. la activación smo culmina en la localización nuclear de factores de transcripción Gli-familia, Gli1, Gli2 y Gli3, que, a su vez, regulan la expresión génica aguas abajo. La vía está en reposo en el hígado normal [17], [18], pero se reactiva como un mecanismo de reparación de la lesión hepática crónica [19], [20], [21], [22], [23]. ligandos Hh promover el crecimiento y la viabilidad de miofibroblastos, la acumulación de lo que conduce a la reparación anormal del hígado, fibrosis y cirrosis eventual [24], [25]. ligandos Hh también sirven como la viabilidad y los factores de proliferación de progenitores epiteliales de hígado, y la expansión de este compartimento se ha relacionado con la formación y mantenimiento de los carcinomas hepatocelulares [26]. La posibilidad de que la vía de activación Hh contribuye a hepatocarcinogenesis es apoyado por el hecho de que Sonic hedgehog (Shh) expresión ligando se observó en aproximadamente el 60% de los HCC humano, y la expresión de los genes regulados por la Hh, Gli1 y Ptc, se produce en 50% de tumores humanos [27], [28], [29], [30].
sobre la base de estas observaciones, se postula que la activación vía Hh contribuye a la patogénesis de la fibrosis hepática y tanto HCC fibrosis asociada. Para probar esta hipótesis, se trataron los ratones con deficiencia de edad Mdr2 con el inhibidor de la vía Hh, GDC-0449, un inhibidor de molécula pequeña que se une a Smoothened (SMO). Este agente fue seleccionado debido a su perfil de seguridad humana en los ensayos de fase 1, así como su eficacia en tumores de órganos sólidos como el carcinoma de células basales (BCC) y meduloblastoma [31], [32], [33]. Nuestro objetivo fue determinar si los ratones con enfermedad hepática avanzada y los HCC toleraría inhibición vía Hh y experimentan mejoras en la fibrosis hepática y /o la carga tumoral.
Métodos
Ratones
Mdr2
- /- ratones fueron un regalo del Dr. Detlef Schuppan (Beth Israel Deaconess Medical Center, Boston, MA). emparejaron ratones de tipo salvaje FVB /NJ edad se obtuvieron de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Todos los animales fueron alojados con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h y se les dio agua y comida estándar
ad libitum
. A edades, 2, 4, 12, 36 52 y 62 semanas, los ratones fueron sacrificados bajo anestesia general. El peso del hígado y el peso corporal se registraron, se recogieron el suero y el tejido hepático. Los estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional que rige por el Instituto Nacional de la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" de la Salud, Universidad de Duke Animal Welfare Aseguramiento Número A3195-01.
Suero AST /ALT determinación
aminotransferasa sérica aspartato (AST) y alanina aminotransferasa (ALT) se midieron usando kits disponibles comercialmente de BIOTRON de diagnósticos (66-D y 68-D, respectivamente; Hemet, CA) según las instrucciones de los fabricantes .
Western Blot
La proteína total se extrae de congelaron tejido hepático todo en tampón RIPA. Las muestras se agruparon por edad (2-4 muestras por grupo de edad) excepto cuando se indique. Se realizó análisis de transferencia de Western como se describió previamente. Las membranas se probaron con los siguientes anticuerpos primarios: Sonic hedgehog (sc-9024; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), Indian hedgehog (ab39634; Abcam), β-actina (sc-47778, Santa Cruz Biotechnology), Gli2 (18 -732-292462, Genway, San Diego, CA). Todos los anticuerpos se diluyeron 1:1000 y se incubaron a 4 ° C durante la noche. Western blot imágenes fueron adquiridas mediante un sistema digital de FluorChem HD2 cuarto oscuro (Biosciences celulares, Santa Clara, California).
La inmunohistoquímica
4 micras, fijado en formol, las muestras incluidas en parafina se eliminó la cera y rehidratada. Para evaluar la arquitectura del tejido, los portaobjetos se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E) y rojo sirio según el protocolo estándar. Para la inmunohistoquímica, los portaobjetos se incubaron en 3% de peróxido de hidrógeno /metanol. La recuperación del antígeno se llevó a cabo por calentamiento en un tampón de 10 mM citrato de sodio o 0,25% de pepsina (K19; Invitrogen, Carlsbad, CA) durante 10 minutos. Las secciones se bloquearon (Dako Envision, Carpinteria, CA) y se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C: glioblastoma-2 (Gli-2; 18-732-292462; 1:2000; Genway, San Diego, CA); citoqueratina 19 (Troma-III; Banco hibridoma, Iowa City, IA; 1:500); α-fetoproteína (AFP) (Dako, 1:1000); Indian hedgehog (Abcam; 1:750, Cambridge, MA); Polímero-HRP anti-conejo (K4003, Dako) o anti-ratón (K40011; Dako) o kit de polímero MACH3 ratón AP (MP530, Biocare médica, Concord, California, EE.UU.) se utilizaron como anticuerpos secundarios. 3,3'-diaminobencidina (DAB) cromógeno sustrato Sistema (K3466, Dako) y /o Ferangi Azul (Biocare) se emplean en el procedimiento de detección. La omisión de anticuerpos primarios a partir de las reacciones eliminados tinción que demostraron la especificidad de la tinción. Las imágenes fueron adquiridas en una Olympus IX71 (Tokio, Japón) microscopio invertido usando el sistema de software DP2-BSW (Olympus) de adquisición de imágenes.
Quantitative Real-Time PCR de transcripción inversa
RNA fue aislado de todo el hígado, así como a partir de muestras de tumores resecados tenían extracción TriZol estándar como se ha descrito anteriormente [24]. Una tabla de cebadores se ha incluido en el material complementario.
Morfometría
secciones de hígado y tumores fijados con formalina fueron teñidos para CD44 y la osteopontina como se describió anteriormente, y se cuantificaron mediante análisis morfométricos con MetaView software (universal Imaging, Downington, PA). Un mínimo de 5 seleccionados al azar 10 × 20 × o campos /sección se evaluaron para cada ratón.
Análisis Cuantitativo inmunohistoquímica
secciones de hígado y tumores fijados con formalina se costained para Gli2 y CK19. Un mínimo de 5 regiones ductular, 20 × campos por sección, se evaluaron para cada ratón mediante el recuento del número de células co-etiquetado.
hidroxiprolina hepática ensayo
El contenido de hidroxiprolina en las muestras de hígado enteros se cuantificó por colorimetría como [34]
tratamiento GDC-0449
En la cohorte inicial, de búsqueda de dosis de los animales, 16 Mdr2
se informó anteriormente -. /- ratones (edad 57- se asignaron 68 semanas) con el tratamiento con vehículo de control (DMSO, n = 5), 20 mg /kg GDC-0449 (n = 5), o 40 mg /kg GDC-0449 (n = 6). relaciones entre varones y mujeres fueron equilibrados entre los grupos. GDC-0449 (Selleck químicos, Houston, TX) estaba recién constituidas diaria en DMSO. Todos los ratones recibieron una inyección intraperitoneal al día durante 9 días. El día 10, se sacrificaron los animales. Las muestras se recogieron como anteriormente. Una segunda cohorte de 20 Mdr2
- /- ratones (edad 51-59 semanas de edad) se sometieron a formación de imágenes de resonancia magnética de todo el cuerpo para evaluar la carga tumoral y luego pares de ratones con cargas tumorales comparables fueron asignados al tratamiento con DMSO (control, n = 10) o 40 mg /kg GDC-0449 (n = 10). Los fármacos se entregan como se describe anteriormente; La RMN se repitió después de la 9
º día de tratamiento; los ratones fueron sacrificados para la cosecha necropsia y el tejido
Patología
H & amp;. E y tinción con rojo Sirius de secciones de hígado fue evaluada por un patólogo certificado por el consejo. Se examinaron secciones representativas de tumor y el tejido no tumoral. El tejido tumoral se definió como nódulos macroscópicos visibles que eran al menos 10 mm de tamaño y resecable.
abdominal resonancia magnética
Los animales fueron asignados un código de cegamiento, que se mantuvo durante la resonancia magnética (MR ) de adquisición de datos y análisis. de formación de imágenes MR de hígado de ratón se realizó en un 70/30 sistema de perforación horizontal 7T Bruker Biospec (Billerica, MA). Los animales se anestesiaron ligeramente bajo isofluorano con monitorización continua y el mantenimiento de los parámetros fisiológicos durante toda la sesión de formación de imágenes (~ 60 min para cada animal). Axial y coronal 2D ponderadas en T2 rápida de spin eco de las imágenes (TURBO-RARA, TE /TR = 11/4200 ms con 1 mm de espesor rebanada, matriz = 256 × 256 y FOV de 2,4 cm x 2,4 cm, 5 medias, 0,0 mm entre cortes gap), las imágenes se obtuvieron por primera vez para fines de selección e información anatómica suplementario. Para el análisis volumétrico tumoral dirigida, 64 contiguas a 500 m de espesor imágenes de densidad de protones 3D FSE sesgados hacia ponderación T1 (TURBO-RARA, TE /TR = 9/1500 ms, matriz = 256 × 256 × 64 y FOV 2.2 cm x 2.2 cm x 2.2 cm, se adquirieron 25 minutos de duración). Todas las secuencias de imágenes se realizaron con el control del movimiento respiratorio.
El análisis volumétrico de los conjuntos de datos de RM se realizó en el software Osirix, una aplicación de procesamiento de imágenes de código abierto desarrollado y mantenido por Pixmeo (Ginebra, SUI). Los tumores hepáticos fueron segmentados manualmente en cada animal por un radiólogo certificado por el consejo (cegados al tratamiento) después del tratamiento. Las áreas seleccionadas fueron revisados para mantener la coherencia en las representaciones coronal y sagital y transversal-correlacionados con axiales imágenes 2D FSE. Para volumetría, se obtuvieron dos mediciones de volumen independientes para cada lesión, con el volumen promedio luego llevado. La fiabilidad entre (valor kappa) fue = 0,97. Se realizaron T1 y secuencias de imagen ponderadas en T2.
Los análisis estadísticos
Los resultados se expresan como media ± desviación estándar. Importancia establecido mediante la prueba t de Student. Las diferencias se consideraron significativas cuando p & lt; 0,05
Resultados
La acumulación progresiva de las células que responden a Hh en Mdr2
- /- ratones
Varias formas de aguda y crónica. lesión hepática induce la expresión hepática de ligandos Hh y la activación de las células sensibles a Hh. Los niveles séricos de AST y ALT fueron consistentemente más altos en Mdr2
- /- ratones que en los controles emparejados por edad (Figura S1), lo que confirma que los ratones knock-out tenían lesión hepática crónica. Por lo tanto, inspeccionamos los hígados de Mdr2
- /- ratones para la activación de la vía Hh. En comparación con la proteína lisados de hígado de controles de tipo salvaje, lisados de Mdr2
- /- ratones demostraron un aumento en Sonic hedgehog (Shh) e Indian hedgehog (Ihh) por Western blot. Esto fue evidente en el primer punto de tiempo examinado (2 semanas después del nacimiento) y se mantuvo durante toda la vida de los animales (hasta 64 semanas de edad) (Figura 1A). La inmunohistoquímica para el factor de transcripción regulados por Hh, Gli2, demostró la acumulación progresiva, relacionada con la edad de las células con tinción nuclear en Gli2 Mdr2
- /- ratones. Tales células GLI2-positivos incluyen células estromales, así como células hepatocíticas y ductular (Figura 1B-C). En conjunto, estos datos sugieren que la vía de Hh se activa en los hígados lesionados crónicamente de ratones Mdr2 deficientes, lo que resulta en la expansión progresiva de diversas poblaciones de células Hh sensible.
A. Western blot para Sonic Hedgehog (Shh) e Indian hedgehog (Ihh) en extractos de hígado enteros agrupado de joven Mdr2
- /- ratones (2-16 semanas de edad), edad (36-64 semanas de edad) Mdr2
- /- ratones y controles emparejados por edad (n = 3-5 ratones /grupo /punto de tiempo). Se muestra un Western blot representativo que demuestra los resultados de los ratones jóvenes. La media ± SEM de datos de los ratones más viejos se representan gráficamente. B. cortes de hígado teñidos Representante para demostrar Gli2 del joven (4 semanas de edad), de mediana edad (36 semanas de edad) y adultos (52 semanas de edad) Mdr2
- /- ratones. expresión poco Gli2 se observó en los ratones de tipo salvaje a cualquier edad, por lo que los resultados de un representante de las 36 semanas de edad se muestra ratón de tipo salvaje. (10 ×) C. cuantitativa gli2 inmunohistoquímica datos. El número de células nucleares Gli2 (+) se contó en un mínimo de 5 campos de alta potencia (HPF) por sección de hígado en Mdr2
- /- ratones y controles de tipo salvaje a las 4, 36 y 64 semanas de edad (n = 3 -4 ratones /grupo /punto de tiempo) y la media ± SEM se representan gráficamente. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 en Mdr2
- /- frente a los controles respectivos grupos
Tratamiento de Mdr2
- /- ratones con el inhibidor de alisado, GDC-. 0449, es segura y disminuye la vía de señalización de Hedgehog
Para determinar la dosis apropiada de GDC-0449, un estudio piloto se realizó con 16 años de edad (57-68 semanas de edad) Mdr2
- /- ratones. Los animales recibieron una inyección intraperitoneal diaria de 20 mg /kg GDC-0449 (n = 5), 40 mg /kg GDC-0449 (n = 6), o control de vehículo DMSO (n = 5) durante 9 días y luego se sacrificaron. No hubo diferencia estadísticamente significativa en la mortalidad entre el control y la dosis alta (40 mg /kg) grupos GDC-0449. En el sacrificio, relaciones de peso hígado /peso corporal de los ratones en los tres grupos fueron similares, lo que sugiere que un curso relativamente corto de tratamiento sistémico con GDC-0449 a 40 mg /kg es bien tolerada por los ratones con enfermedad hepática avanzada y HCC (Figuras S2A -SEGUNDO). El análisis de transferencia Western de lisados de hígado de esta cohorte de animales demostró que el tratamiento GDC-0449 causó una disminución en los niveles de ligando de Shh en la dosis más alta, y Gli2 atenuación expresión en ambas dosis (Figura S2C).
Hedgehog inhibición de señalización con GDC-0449 anula los efectos de la señalización de Hh sobre la expresión del gen diana
a partir de los datos obtenidos en nuestro estudio de búsqueda de dosis, una segunda cohorte de Mdr2
- /- ratones (51-59 semanas de edad ) fueron asignados al tratamiento con vehículo (DMSO; n = 10) o 40 mg /kg GDC-0449 (n = 10) a través de la inyección ip diariamente durante 9 días. La supervivencia global entre los dos grupos en la segunda cohorte fue igual, sin ninguna muerte en el grupo de tratamiento DMSO y 1 muerte en el grupo de tratamiento GDC-0449 secundaria a una lesión iatrogénica. Tanto el parénquima hepático y tumores de los ratones tratados mostraron disminución de la expresión de la diana vía Hh Gli2 (figuras 2A-B). En tiempo real el análisis de PCR de tumores resecados reveló que el tratamiento GDC-0449 dio a conocer los efectos inhibidores de la señalización de Hh en PPARa, provocando un aumento significativo en su expresión de genes (Figura 2C). El tratamiento con GDC-0449 también causó una disminución significativa en la expresión de Gli1, otro Hh gen diana (Figura 2D).
A. cortes de hígado teñidos para Gli2 de DMSO representativa y los ratones tratados con GDC-0449- (40 ×). Gli2 datos cuantitativos de inmunohistoquímica en hígados no tumorales de los ratones tratados con DMSO o GDC-0449 (n = 9-10 /grupo) se representan como media ± SEM (
** p & lt;. 0,01 Francia El número de ductular células con tinción positiva Gli2 se contaron en cada tubo /sección del portal bajo 40 aumentos. B. Tumor secciones de los mismos ratones también se tiñeron para demostrar Gli2. los resultados de DMSO representativa y los ratones tratados con GDC-0449 se muestran. Gli2 cuantitativa datos de inmunohistoquímica fueron generados por contar ductular nuclear Gli2 positivo y las células hepatocíticas en secciones de tumor bajo 40 aumentos Los resultados se representan gráficamente como media ± campo de alta potencia SEM Gli2-positivas células /40 × (** p & lt; 0,01). C-D inversa cuantitativa los ratones de transcripción-PCR (QRT-PCR) análisis de ARN de hígado entero de DMSO (barra libre) y GDC-0449 (barra de color negro). C. tratados PPAR-γ, un gen que normalmente se reprime por la señalización de Hh. D. Gli1 ., un gen que es inducida por la señalización de Hh media ± SEM se representan gráficamente (** p & lt; 0,01) guía empresas
Hedgehog inhibición de la señalización con GDC-0449 reduce la fibrosis hepática
Mdr2
- /- ratones demostraron aumentos progresivos relacionados con la edad en la expresión hepática de actina alfa del músculo liso (α-SMA), un marcador de las células estrelladas hepáticas myofibroblastic (Figura 3A, panel superior). Esto fue acompañado por un aumento de la expresión de factores pro-fibrogénicos, tales como la transformación del factor de crecimiento TGF-β y plaquetas de crecimiento derivado de factor de PDGF-β (Figuras S3A-B), y fibrosis progresiva, como se evidencia por Sirius tinción con rojo (Figura 3A, parte inferior panel) y la cuantificación del contenido de hidroxiprolina hepática (Figura 3B). El tratamiento con GDC-0449 disminuyó células myofibroblastic-SMA-expresión de alfa, la expresión hepática de TGF-β y PDGF-β, Sirius tinción con rojo, y el contenido de hidroxiprolina, lo que demuestra que la inhibición de la vía Hh reduce la fibrosis hepática (Figuras 3C-D y las figuras S3C- D).
A. La tinción inmunohistoquímica de α-SMA (panel superior) y rojo Sirius (panel inferior) en las secciones de hígado no tumoral de representante de la misma edad Mdr2
- /- ratones de tipo salvaje y (10 ×). B. Fondo Común de contenido de hidroxiprolina hepática de 2 a
52 semanas de edad Masculino de tipo salvaje (WT) y emparejados por edad Mdr2
- /- ratones (n = 3-5 /grupo). Los resultados en Mdr2
- /- ratones se normalizaron a la de los ratones WT de la misma edad y se representan como factor de cambio. Los datos se muestran como la media +/- SD (* p & lt; 0,05) las secciones de hígado C. no tumorales teñidas para α-SMA (panel superior, 20 ×) y rojo Sirius (panel inferior, 10 ×) en DMSO representativa y GDC - tratada Mdr2
- /- ratones. D. Heptic contenido de hidroxiprolina de DMSO y GDC- ratones tratados (n = 9 /grupo). Los resultados en los ratones tratados con GDC-0449 se normalizaron a la de los ratones tratados con vehículo DMSO y se representan como factor de cambio. Los datos se muestran como media +/- SEM (* p & lt; 0,05) guía empresas
Hedgehog inhibición de la señalización con GDC-0449 disminuye la acumulación de células progenitoras hepáticas
En respuesta a una lesión, las células progenitoras. poblaciones en el hígado proliferan. Por lo tanto, el análisis inmunohistoquímico de marcadores progenitoras, tales como citoqueratina-19 (CK-19) y α-fetoproteína (AFP), mostró aumentos relacionados con la edad en Mdr2
- /- ratones (Figura 4A). Co-tinción para CK19 y Gli2 confirmó que la población de progenitores era Hh sensible (Figura 4B). Tras el tratamiento con GDC-0449, marcadores progenitoras disminuyó (Figura 4C), lo que indica que se requiere la señalización de Hh para mantener poblaciones progenitoras durante la tumorigénesis, y que la inhibición de Hh fue suficiente para reducir el tamaño de las poblaciones progenitoras, incluso en ratones con carcinoma hepatocelular avanzado.
A. La tinción inmunohistoquímica de secciones de hígado de representante, emparejados por edad Mdr2
- /- ratones de tipo salvaje y para los marcadores progenitoras, citoqueratina-19 (CK-19) (paneles superiores) y la alfa-fetoproteína (AFP) (paneles inferiores) (20 ×). micrografía B. Representante de una tríada portal en el hígado de un Mdr2
- /- ratón, demostrando co-localización de CK-19 (azul) y Gli2 (marrón) en el compartimiento ductular (40 ×). C. cuantitativa Gli2 e inmunohistoquímica CK19 en DMSO y GDC-0449-tratados Mdr2
- /- ratones (n = 9-10 /grupo). El número de células de apariencia ductular gli2 y CK19 de doble positivas fueron contados dentro de los tumores menores de 20 × magnificación. La media ± SEM células dobles (+) t por campo de gran aumento (CGA) se representan gráficamente (* p & lt; 0,05) D. Análisis de QRT-PCR de la AFP en el ARN del tumor de los ratones tratados con DMSO (barra libre) o GDC-0449 (cerrado bar) los resultados en los ratones tratados con GDC-0449 se normalizaron a la de los ratones tratados con vehículo DMSO y se representan como media ± SEM (* p & lt;. 0.05)
la disminución de la señalización de Hedgehog reduce la expresión de osteopontina y previene la acumulación de células de osteopontina sensible (CD44-positivo)
Stem /poblaciones de células progenitoras para muchos tipos de cáncer, incluyendo HCC, se cree que están enriquecidos con células que expresan CD44, un receptor para el vástago factor de crecimiento celular, la osteopontina [35], [36]. la expresión de osteopontina está regulada por la señalización de Hh [37]. Por lo tanto, hemos examinado los efectos de la GDC-0449 en la osteopontina y su receptor, CD44. La inmunohistoquímica y morfometría cuantitativa demostraron que la inhibición de la vía de Hh con GDC-0449 disminuyó significativamente tinción osteopontina dentro de los tumores hepáticos primarios (Figura 5A). disminuciones relacionadas con el tratamiento similares en las células tumorales CD44 + también se observaron (Figura 5B). La expresión de genes mostró que la expresión tanto de la osteopontina y CD44 mRNAs también tendió a disminuir en los ratones tratados con GDC-0449 (Figura 5C). En conjunto, estos resultados sugieren que la señalización de Hh puede regular de cáncer de hígado células madre /progenitoras putativo modulando la disponibilidad de la osteopontina.
A. secciones tumorales de DMSO representativa y GDC-0449 tratados Mdr2
- /- ratones fueron teñidas para demostrar la osteopontina (OPN) secciones representativas se muestran (
Panel derecho
). tinción OPN se cuantificó por análisis morfométrico de al menos 5 HPF por sección tumor utilizando 20 × ampliación (n = 5 ratones /grupo). Los resultados en el grupo tratado con GDC-0449 se normalizaron a la del grupo tratado con vehículo DMSO y se representan como factor de cambio. Los datos se muestran como media ± SEM (** p & lt; 0,01). La tinción inmunohistoquímica B. para el receptor de la osteopontina, CD44, en los tejidos peri-tumoral de DMSO representativa y GDC-0449- tratado Mdr2
- /- ratones. (
Panel derecho
) tinción CD44 se cuantificó por análisis morfométrico tal como se describe en A. Los resultados en los ratones tratados con GDC-0449 se normalizaron a los de los controles tratados con vehículo y se representan como media ± SEM (** p & lt; 0,01). C. Análisis de QRT-PCR del ARN tumor en el hígado a partir de DMSO (barra libre) y GDC-0449- (barra cerrada) tratados Mdr2
- /- ratones de OPN (izquierda) y CD44 (derecha). Después de la normalización de los resultados en el grupo tratado con DMSO, media ± SEM se graficaron (* p & lt; 0,05) guía empresas
RM y evidencia histológica de la involución del tumor de hígado después del tratamiento GDC-0449
Para evaluar el impacto potencial de los cambios en las células progenitoras de la matriz y en HCC, los volúmenes de pre y post-tratamiento de tumores se analizaron mediante resonancia magnética (figuras 6A-B). Un análisis de los tumores en ratones sin metástasis abierta demostró que los volúmenes tumorales se redujeron en ratones que recibieron un curso de 9 días de GDC-0449-tratamiento, mientras que los animales tratados con vehículo en evidencia el crecimiento del tumor persistente (Figura 6C; -6,7% + /- 11,7% vs 22,7% +/- 9,1%, p = 0,03). Estos datos se correlacionan con resultados de la necropsia: Sólo 56% de los ratones tratados con GDC-0449 tenían nódulos tumorales de hígado visibles, en comparación con 80% de los ratones de DMSO (Tabla 1). Además, tanto el MRI y necropsias mostraron una disminución del número de metástasis en los ratones tratados con GDC-0449 en comparación con los controles tratados con vehículo (Tabla 1). El análisis histológico de H & amp; cortes de hígado teñidos-E también se realizó en todos los animales de ambos grupos. Si nódulos tumorales no fueron manifiestamente visible o superior a 10 mm de tamaño, las muestras se excluyeron del análisis. nódulos tumorales microscópicas en animales-0449 GDC tratados mostraron mayores tasas de infarto hemorrágico (20% frente al 0%; Figura 6D, panel superior), esteatosis microvesicular (40% frente al 0%, la figura 6D, panel central), la necrosis acidófilo y citoplasmática degenerativa cambios (70% vs 40%, la figura 6D, panel inferior) en comparación con los tumores de los animales tratados con vehículo. Por lo tanto, los hallazgos en la RM, la necropsia, y la histología hepática fueron consistentes y demostraron que la inhibición de la vía Hh provocó una regresión significativa del CHC primario y metastásico.
A. Representante imagen en sección transversal de tumor intrahepático tal como se identifica por resonancia magnética realzada con contraste después del tratamiento GDC-0449. B. Representante imágenes por resonancia magnética de puntos de vista sagital, coronal y oblicuos utilizados para el análisis volumétrico. C. Cambio en el volumen del tumor se cuantificaron por medio de mediciones volumétricas informatizar generada y representada gráficamente como la Media ± SD (* p & lt; 0,05). D. Las micrografías de cambios histológicos representativos inducidos por, GDC-0449, tratamiento. El panel superior muestra necrosis tumoral; El panel medio muestra la degeneración grasa; demostración del panel inferior vacuolado células tumorales con núcleos picnóticos
Discusión
Se estudiaron Mdr2
-. /- ratones para determinar si es o no activación de los Hh vía contribuye a hepatocarcinogénesis durante la lesión hepática crónica fibrosante. los ratones deficientes en Mdr2 carecen de una flipasa fosfolípido que se requiere para la formación normal de la bilis, y por lo tanto presentan daño hepático y la proliferación ductal de una edad joven. Todos los ratones afectados eventualmente desarrollan fibrosis hepática significativa y HCC metastásico. Nuestros resultados demuestran que esta patología está acompañada por la activación progresiva de la vía de Hh. se requiere la introducción de un inhibidor específico de la señalización Hh actividad clave intermedia, alisado, la reducción de la vía y ha demostrado que sustenta la señalización de Hh a mantener las poblaciones expandidas de miofibroblastos hepáticos y progenitores que se habían acumulado en los hígados dañados. Por otra parte, el tratamiento de ratones Mdr2 con deficiencia de edad (que ya tenía fibrosis hepática avanzada y HCC) con el inhibidor de la vía Hh reducido significativamente la fibrosis hepática y la carga tumoral, lo que demuestra por primera vez que la inhibición de la señalización de Hh tiene un valor clínicamente relevante, terapéutico tanto para el hígado fibrosis y HCC. Aún más interesante es la evidencia de que las medidas de prohibición sobre el crecimiento tumoral hepática
in vivo
pertenece tanto HCC intra-hepática y metástasis a distancia.
Además, nuestros resultados proporcionan una idea de algunos de los que subyace mecanismos involucrados. producción hepática de ligandos Hh se incrementó en ratones que desarrollaron fibrosis hepática progresiva y HCC invasivo. Estos ratones también mostraron niveles de transaminasas séricas consistentemente más altos, de acuerdo con otra evidencia de que la deficiencia de Mdr2 provoca una lesión crónica de hepatocitos [38], [39]. Varios factores de estrés que reducen la viabilidad de los hepatocitos se han mostrado para inducir la producción y liberación de ligandos Hh por los hepatocitos heridos [40], [41]. Por lo tanto, la lesión de los hepatocitos es probablemente uno de los factores que incrementan la generación de ligando Hh en hígados Mdr2 deficientes. células myofibroblastic y de tipo ductular progenitores que se acumulan progresivamente en los hígados lesionados crónicamente también producen ligandos Hh, así como otros factores, tales como PDGF-β, que estimulan la síntesis autocrina-paracrina de ligandos Hh [20], [42].