Extracto
Resistencia a la insulina es el denominador común de varias enfermedades, incluyendo la diabetes tipo 2 y el cáncer, y la investigación de los mecanismos responsables de la alteración de señalización de insulina es de importancia primordial. Un modelo matemático de la red de señalización de la insulina (ISN) se propone y se utiliza para investigar las curvas de dosis-respuesta de los componentes de esta red. Los datos experimentales de mioblastos C2C12 con fosfatasa y tensina homólogo (PTEN) suprimidos y los datos de miotubos L6 con resistencia a la insulina inducida han sido analizados por el modelo. Nos hemos centrado sobre todo en la fosforilación de Akt simple y doble y señalamos modificaciones de la señalización de la insulina relacionados con la resistencia a la insulina. Por otra parte, se presenta una nueva caracterización de la señalización aguas arriba de la diana mamífera de rapamicina complejo 2 (mTORC2). Ya que es ampliamente reconocido que las proteínas ISN tienen un papel fundamental también en la proliferación celular y la muerte, el modelo ISN estaba vinculado a un modelo de población de células y se aplicó a los datos de una línea celular de leucemia mieloide aguda tratados con un objetivo de mamíferos inhibidor de la rapamicina con actividad antitumoral. El análisis reveló las relaciones simples entre las concentraciones de proteínas ISN y los parámetros del modelo de población de células que caracterizan la progresión del ciclo celular y la muerte celular
Visto:. Bertuzzi A, Conte F, G Mingrone, Papa M, S Salinari , Sinisgalli C (2016) en la señalización de la insulina Resistencia a la insulina Unidos y cáncer: un análisis de modelado. PLoS ONE 11 (5): e0154415. doi: 10.1371 /journal.pone.0154415
Editor: Cong Cao, Universidad de Suzhou, China
Recibido: 14 Diciembre, 2015; Aceptado: 12 Abril de 2016; Publicado: 5 Mayo 2016
Derechos de Autor © 2016 Bertuzzi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Los datos son tomados de la literatura y las fuentes relacionadas se presentan en el documento
Financiación:. FP fue apoyada por SysBioNet, italianos Hoja de Ruta Infraestructuras de investigación 2012. Federica Conte fue apoyada por el Proyecto Epigenómica Flagship (Progetto Bandiera Epigenomica), EPIGEN , financiado por el Ministerio italiano de Educación, Universidad e Investigación (MIUR), y el Consejo Nacional de Investigación (CNR). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
resistencia a la insulina representa el denominador común de una serie de enfermedades, incluyendo la obesidad, la diabetes tipo 2 (DM2), el síndrome metabólico y el cáncer. Surge de la insuficiencia de la acción de la insulina, lo que induce en consecuencia, la hiper-secreción de insulina. Las principales vías de la red de señalización de la insulina (ISN) están bien establecidos [1,2,3], con la serina /treonina proteína quinasa Akt /PKB y los dos mamíferos objetivo de rapamicina Complejos (mTORC1 y mTORC2) juega un papel especial. Akt se fosforila en Thr308 por la proteína phosphoinositide-quinasa dependiente-1 (PDK1) y en Ser473 por mTORC2 [4], y se logra la actividad de Akt máxima cuando la molécula es fosforilado en ambos residuos, lo que permite la translocación de la insulina reguladas transportadores de glucosa (GLUT4) en el músculo y el tejido adiposo [5,6]. PDK1 y mTORC2 también responden a la activación del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1) [3].
La cascada de quinasa a través del receptor de insulina (IR) hasta mTORC1, así como la activación por mTORC1 aminoácidos y energía, se evalúan claramente [7]. Por el contrario, todavía no está bien caracterizado la regulación aguas arriba de mTORC2 [8]. El complejo de esclerosis tuberosa 1/2 (TSC1 /TSC2) parece ser necesario para la activación mTORC2 [2,9]. Sin embargo, este punto de vista fue interrogado en un estudio que informó cursos de tiempo experimentales de varias proteínas de la ISN bajo aminoácidos y la estimulación de insulina [10]. Interpretación de los datos mediante un modelo dinámico de la red, se argumentó que la vía de activación mTORC2 puede originarse a partir del IR o el receptor de insulina sustrato-1 (IRS1), posiblemente a través de una variante de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) [10] . Una vista todavía diferente surgió a partir de experimentos en ratones no diabéticos tanto in vivo como en las biopsias musculares, y en células L6 expuestos a un medio enriquecido con proteínas secretadas por el intestino delgado de ratas diabéticas y para el suero de resistentes a la insulina seres humanos [11]. Este estudio mostró que el factor de yeyunal /s inducen resistencia a la insulina y que estos factores activar mTORC2, según lo revelado por un aumento del valor de la fosforilación de Ser473 Akt, incluso en ausencia de la estimulación de insulina. La presencia de tales factores intestinales también es sugerido por la disminución de la resistencia a la insulina después de la cirugía bariátrica [12]
.
El p70S6 quinasa sustrato mTORC1 1 (S6K1) está implicada en la regulación de la síntesis de proteínas y el crecimiento de células tamaño y S6K1 activo inhibe IRS1 en un bucle de retroalimentación negativa [3]. Por otra parte, la proteína Akt cuadro de sustrato forkhead O1 (FoxO1) está implicado en la regulación de la proliferación y la apoptosis, por lo que la red de señalización de la insulina tiene un papel importante no sólo en la obesidad y la diabetes, sino también en el cáncer [3,13,14].
Tras los trabajos seminales de Wanant y Quon [15] y de Sedaghat et al. [16], varios estudios han investigado el comportamiento de la ISN inducida por estímulo de insulina mediante el desarrollo de modelos matemáticos y el análisis de los datos experimentales. En algunos estudios se centraron en la respuesta a un incremento gradual de la concentración de insulina extracelular [15,16,17,18,19,20]. En particular, el modelo matemático propuesto por Kiselyov et al. [17] representaron tanto para los sitios de alta y baja afinidad en los dos monómeros de receptor de insulina. Brännmark et al. [18] estudiaron posibles esquemas que explican el comportamiento peculiar observado en la fosforilación del receptor de insulina y el sustrato receptor de insulina. modelos dinámicos más completos, apoyados por el análisis de la evolución temporal de las concentraciones de proteína después de la estimulación de la insulina, se desarrollaron e investigaron [10,19,20]. Se propusieron modelos dinámicos complejos para representar la señalización a través de la ErbB de receptores hasta PI3K y Akt, con el objetivo de explorar la respuesta a un fármaco contra el cáncer [21], y para modelar la iniciación inducida por la insulina de la traducción eucariótica [22].
las curvas de dosis-respuesta, es decir, las concentraciones en estado estacionario en los niveles de insulina dado, se consideraron en otros estudios. Giri et al. [23] y Wang [24] estudiaron el comportamiento de las curvas de respuesta a la dosis de los componentes de la ISN frente a la concentración de insulina extracelular, para determinar las condiciones que producen una histéresis en las curvas, como resultado de las interacciones entre los circuitos de retroalimentación negativa y positiva presente en el sistema. Aunque el experimental curso temporal de la concentración de proteínas en virtud de la insulina constante programa de estimulación que algunas proteínas pueden no alcanzar un estado de equilibrio evidente hasta 2 horas [10], las curvas de dosis-respuesta se utilizan ampliamente en la literatura para evaluar el comportamiento de los componentes de ISN en varios niveles de estimulación de la insulina y para evaluar la respuesta a los agentes perturbadores y las drogas.
Objetivo del presente estudio es investigar los factores que afectan a las concentraciones de proteína basales y las curvas de dosis-respuesta de la ISN. Usando el esquema de Michaelis-Menten de las reacciones químicas, hemos desarrollado un modelo matemático de la red en el estado estacionario, que se centra en la fosforilación de Akt simple y doble y la señalización aguas arriba de mTORC2. Con base en datos de la literatura de las líneas del músculo esquelético, se muestra cómo el modelo puede representar a los efectos de silenciamiento génico. Los factores que inducen resistencia a la insulina se modelan de acuerdo con los hallazgos en [11]. Mejora el modelado de los complejos de Akt y mTOR también se utiliza aquí para simular la respuesta ISN en condiciones tales como la rapamicina TSC2 tratamiento nulo y largo plazo. En vista de la estrecha relación entre la resistencia a la insulina y el cáncer, debido principalmente a Akt y la señalización de mTOR, se combinaron el modelo de señalización con un modelo de población de células con el fin de investigar los efectos de los inhibidores de mTOR con actividad antitumoral en las proteínas ISN y en la insulina respuesta de la población celular.
resultados
el esquema de nuestro modelo en la figura 1 se basa en la visión actual de la estructura de ISN [2,3,14,25]. Desde Akt puede ser fosforilada en Ser473 de forma independiente por mTORC2 y al Thr308 por PDK1 [8], se incluyeron todas las vías que conducen a la activación de Akt total. mTORC2 se supone que es activado por el fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato (PIP3), como se sugiere en [3,26], y en un factor J no dependiente de PI3K, que se posiblemente mediado a través de los receptores de factores de crecimiento [11 ]. La activación de mTORC1 está representado aquí de una manera bastante simple, omitiendo la inhibición TSC por Akt y la consiguiente activación mTORC1 través del homólogo de Ras enriquecido en el cerebro (Rheb). El régimen incluye también la directa sustratos Akt glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK3) y forkhead cuadro de proteínas O1 (FoxO1). El S6K1 activada fosforila IRS1 y Rictor en bucles de retroalimentación negativa [25]. Un bucle de retroalimentación positiva de Akt a la proteína tirosina fosfatasa 1B (PTP1B) también se incluye [16]. Mientras que la vía de activación de mTORC2 través TSC2 (Huang, Dibble, Matsuzaki, & amp; Manning, 2008) no se consideró a la vista de los resultados en [10], el modelo actual no incluye por razones de simplicidad algunas vías establecidas de la red, para ejemplo, la piscina IR intracelular y el reciclaje del receptor, la activación TSC2 promovido por FoxO1 [27] y la activación S6K1 por GSK3 [28].
activación por la insulina (I) de receptor de insulina (IR) cataliza la tirosina fosforilación de IRS1. IRS1 fosforilado se une a la subunidad reguladora p85 de PI3K, la activación de la subunidad catalítica de p110. PI3K media la fosforilación de PI (4,5) -bisphosphate (PIP2) a PI (3,4,5) -trisphoshpate (PIP3), cerca de la membrana plasmática (PM) y la fosfatasa y tensina homólogo (PTEN) dephosphorylates PIP3 de nuevo a PIP2. PIP3 recluta Akt y PDK1 a PM, donde PDK1 fosforila Akt en Thr308 (fosfatasa PP2A). mTORC2 es activado por PIP3 y por el factor de J, y cataliza la fosforilación de Akt en Ser473 (fosfatasa PHLPP). la actividad máxima de Akt se logra cuando la molécula es fosforilado en ambos residuos Thr308 y Ser473, lo que permite la translocación de transportadores de glucosa GLUT4 a PM. GSK3 y FoxO1 son sustratos Akt directos. Akt también activa mTORC1, que a su vez activa S6K1. S6K1 activada fosforila IRS1 y Rictor en los bucles de retroalimentación negativa. También se incluye el circuito de retroalimentación positiva de Akt a PTP1B. Los circuitos de retroalimentación están representados por líneas en negrita.
Las reacciones químicas dentro de nuestro modelo ISN están representadas en su mayoría por el esquema de Michaelis-Menten clásica [29,30], y se discuten en S1 archivo (Texto S1) . Varias hipótesis nos permitió simplificar el modelo. La localización intracelular de las proteínas (citosólica vs. asociada a la membrana), así como el tráfico intracelular, fueron descuidado. Los complejos de proteínas (por ejemplo, mTORC1 y mTORC2) fueron tratados como componentes moleculares simples.
Según informes, las ecuaciones cinéticas de las concentraciones de las proteínas, que también contienen los términos de la síntesis y la degradación de sustratos y enzimas, en archivo S1 (S2 texto). Como nuestro objetivo es el análisis de las curvas de dosis-respuesta, que luego derivó las concentraciones de los productos químicos en el equilibrio. Bajo el supuesto crucial, como se sugiere en [31], que la constante de velocidad de degradación de un complejo enzima-sustrato es despreciable en comparación con la suma de disociación y las constantes catalíticas, las ecuaciones de equilibrio toman una forma bastante simple. Las ecuaciones del modelo ISN en la forma normalizada utilizada para el análisis de las líneas celulares musculares C2C12 y L6 se informan en la sección de modelos, las ecuaciones (1) - (16). Tabla S1 da las expresiones de los parámetros en las ecuaciones (1) - (16) en términos de los parámetros cinéticos de las ecuaciones en S1 de archivos (texto S2)
C2C12 mioblastos
La experimental. los datos en [32] mostrar los niveles de fosforilación normalizadas en las células de mioblastos C2C12 de IR (Tyr1146), Akt (Ser473) y (Thr308), GSK3 (Ser9), S6K1 (Thr389), y AS160 (Thr642) en cero a la insulina y en la insulina concentraciones de 1, 10, y 100 nM, más las concentraciones normalizadas de PIP3 y GLUT4
pm a cero a la insulina y a un valor asignado a la insulina. Los autores informan de los datos de control y células suprimidas-PTEN, donde la concentración de la proteína PTEN se redujo hasta el 10% del control. Utilizamos estos datos, excepto los de PIP3 y AS160 que fueron utilizados para la predicción, para estimar los parámetros del modelo ISN. El bucle de realimentación positiva de Akt a la PTP1B no se incluyó porque los datos de fosforilación IR fueron similares en células control y PTEN-silenciada (Figura 2 Panel A). Como se ha hecho en [20], los datos experimentales normalizados de pAkt (Ser473) eran aptos por la suma, dadas por las ecuaciones (10) y (11) en la sección Modelos, debido a que el anticuerpo monoclonal específico es probable que se unen Akt fosforilada en Ser473 independientemente de la presencia de la fosforilado Thr308. Del mismo modo, los datos de pAkt (Thr308) se ajustaron por.
[32] Las células
datos (media ± SEM) dibujado de nuevo de la referencia para el control (cuadrados negros) y (cuadrados rojos) PTEN-suprimida. Las líneas continuas son las curvas de dosis-respuesta predichas por el modelo de control (negro) y las células PTEN-suprimida (rojo). (A) Pir relativa (Tyr1146). (B, C) pAkt relativa (Ser473) y pAkt (Thr308). (D) pGSK3β relativa (Ser9). (E) pS6K1 relativa (Thr389). (F) GLUT4 relativa al PM en cero (caja blanca) y 100 nm (caja gris) a la insulina.
La figura 2 muestra los datos de las células C2C12, dibujado de nuevo de la referencia [32] y se utiliza para el estimación de los parámetros de las ecuaciones (1) - (16), con
PTEN
n
en la ecuación (6) se establece en uno para control y de 0,1 para los datos de PTEN-silenciada . La figura 2 también muestra las curvas de ajuste óptimo calculadas por el modelo y S2 tabla presenta los parámetros estimados (con
I
e
, 0,5 y
S
0,5 dada en lugar de
a
0 y
a
1).
I
e
, 0,5 se encontró igual a 44,68 nM. A medida que se vuelven a normalizar los datos experimentales para tener un valor de unidad en la concentración de insulina máxima en el control, hemos calculado las curvas de dosis-respuesta en la figura 2 de acuerdo con esta restricción.
Un subconjunto de las predicciones del modelo se muestra en S1 Higo. El panel A muestra la predicción, obtenida por el modelo estimado, de pAS160 (Thr642) junto con los datos que no se utilizaron en el procedimiento de estimación. Mientras que el perfil de pAS160 de datos (Thr642) Se siguió con bastante precisión, el modelo no para predecir los datos de concentración PIP3 en las células PTEN-silenciado (panel B). Observamos que si mTORC2 se activaron por PI3K en lugar de PIP3, el modelo no podría encajar adecuadamente los datos pAkt (Ser473) en cero y bajo la insulina en las células PTEN-silenciado, ni la predicción de los datos de concentración PIP3 mejoraría (S1 higo, paneles C A, C). El pAkt total () a 100 nM de insulina en el control es 8,61% de Akt total (S1 Fig panel de F) y GLUT4 en la membrana plasmática es 48,3% de GLUT4 total. Estos valores están de acuerdo con los resultados del modelo reportados en [16], donde pAkt es aproximadamente el 9% del total de Akt y GLUT4 superficie alcanza el 40% de GLUT4 total después de 15 min 100 nM de insulina.
S2 figura muestra la sensibilidad de las concentraciones de proteína sobre una perturbación ± 10% de los parámetros estimados en la concentración de insulina extracelular de 44,68 nM. A medida que esta concentración es igual a
I
e
, 0,5, la sensibilidad a
S
0.5 está desapareciendo. Lo mismo ocurre con las sensibilidades a
a
12 (por debajo de 10
-5), mientras que y tienen valores pequeños (S2 Tabla). Las sensibilidades positivos más grandes se encuentran en
a
9 y
a
10, cuyos valores se hace igual (ver Tabla S2) como se dispone de datos sobre la fosforilación de PDK1 y mTORC2 estaban disponibles. Los parámetros que afectan directamente abajo proteínas, como mTORC1 y S6K1, también afectan a las proteínas de aguas arriba, como IRS1 y PI3K, a causa de la señalización a través del bucle de retroalimentación negativa. El comportamiento opuesto de
IRS
1
Y
y
IRS
1
S
se observa también.
Como se esperaba, PTEN eliminación mejora la respuesta de la insulina y el nivel basal se incrementó en casi todas las proteínas, de acuerdo con la sensibilidad negativa a
a
8 de todas las proteínas PTEN aguas abajo, mientras que
IRS
1
y
y PI3K están regulados positivamente (S2 figura). En particular, la supresión de la proteína PTEN causa un incremento en la fosforilación basal Ser473 Akt, que puede fosforilar y desactivar FoxO1 con la posible mejora de la señalización de las vías que regulan la proliferación celular.
miotubos L6
Como se muestra en la Fig 3, los datos en [11] dar los niveles de fosforilación en células L6 normalizados de pAkt (Ser473) y (Thr308) a cero a la insulina y en las concentraciones de insulina de 0,1, 1, 10, y 100 nM. pGSK3β (Ser9) Se informa a cero y 100 nM de insulina. Por otra parte, pAkt (Ser473) y pS6K1 (Thr389) a cero insulina se midieron en presencia de los inhibidores de la rapamicina y PP242 que se dirige ambos complejos de mTOR [33]. Se obtuvieron los datos en el medio de control, enriquecido por las proteínas secretadas por mucosa yeyunal de los ratones no diabéticos, y en un medio enriquecido con proteínas secretadas por la mucosa de ratones diabéticos (denotadas en el siguiente medio condicionado o medio db /db). Basándose en experimentos en ratones no diabéticos tanto in vivo como en las biopsias musculares, y en células L6 expuestos al medio de db /db y para el suero de los seres humanos resistentes a la insulina, se ha planteado la hipótesis de que el factor de yeyunal /s inducir resistencia a la insulina [11] . El factor que activa J mTORC2, ver la ecuación (8), se ha incluido en el modelo para representar la acción de este factor putativo.
Los datos (media ± DE) dibujado de nuevo de la referencia [11], salvo el panel D de Ref [34]. Los datos (cuadrados) y el modelo de ajuste (líneas continuas) representan en negro para el control y en el azul para las células expuestas a condicionado (db /db) medio. (A, B) pAkt relativa (Ser473) y pAkt (Thr308). (C) pGSK3β relativa (Ser9) al (caja blanca) cero y 100 nM (caja gris) a la insulina. (D) la captación relativa 2-DG en mioblastos L6 de rata. (E) pAkt relativa (Ser473) en el cero de la insulina en el control (negro) y las células expuestas a db medio /db (rojo), en ausencia de inhibición y en las células tratadas con rapamicina (50 nM) y PP242 (500 nM). El color rojo indica que los valores experimentales no conservan el aumento de pAkt basal (Ser473) de control para medio db /db en ausencia de inhibición, y los asteriscos señalan que estos datos no se utilizan en el ajuste del modelo. Verde (sin inhibidor), amarillo (rapamicina), y rosa cajas (PP242) representan el ajuste del modelo. (F) pS6K1 relativa (Thr389) en cero la insulina en ausencia de inhibición y en las células tratadas (los cuadros representan el modelo adecuado).
ajustar los datos experimentales suponiendo que J tiene la concentración insignificante en el medio de control y una mayor concentración, que deben estimarse, en el medio db /db. Para ajustar los datos obtenidos en un medio de db /db, la hipótesis de que la resistencia a la insulina también aumenta debido a un aumento de la degradación IRS1 debido a la mejora de mTORC2 señalización [35]. Esta retroalimentación negativa estuvo representada mediante la regulación adecuada de los parámetros de PI3K. Fig 3 muestra los datos experimentales de células L6, dibujado de nuevo a partir de [11] y [34], junto con las curvas de ajuste óptimo, y S2 Tabla informa de los parámetros estimados. Se observa que un alto valor de pAkt (Ser473) en cero a la insulina, como se observa en la figura 3, panel A sólo puede obtenerse si mTORC2 también se activa a través de una vía de señalización independiente de la PI3K, y si no se requiere la fosforilación de Thr308 Akt para Ser473 fosforilación.
los datos medidos de fosforilación en los experimentos con medio db /db son aptos con un valor de
J
sustancialmente mayor en comparación con el control (0,07 frente a 0,001). pAkt (Ser473) en cero la insulina se aumenta en gran medida, pero su respuesta a la insulina se embota (Fig 3A). La respuesta de pAkt (Thr 308) y de pGSK3β (Ser9) también está deprimido (paneles B y C). Los datos de absorción 2-DG reportados en la figura 3D se ajustaron adecuadamente por el modelo. La captación de 2-DG predicho en presencia de medio (panel D) db /db se calcula suponiendo que las constantes de velocidad que regulan la translocación de GLUT4 a la membrana plasmática son más pequeños en comparación con el control de [5,6], ver Tabla S2.
los datos medidos en presencia de rapamicina y PP242 se muestra la figura 3 paneles EF. El modelo se ajusta adecuadamente a la inhibición de la basal (sin insulina) pS6K1 (Thr389) tanto en el control y db /db medio (panel F). inhibición S6K1 conduce a su vez, debido a la retroalimentación negativa atenuada, a una disminución de y un aumento en (S2 Fig, paneles A-D), mejorando así la señalización de la insulina. En los datos basales pAkt (Ser473) (Figura 3, panel E), la mala predicción para las células expuestas a medio db /db es causado por la variabilidad experimental y los datos no se utilizaron para el ajuste del modelo. En las células tratadas con rapamicina, la retroalimentación negativa atenuada condujo a un aumento de
mTORC página 2
n
, mejorando así pAkt. Por el contrario, PP242 afecta a la fosforilación de Akt en Ser473, por lo que
Akt
S
y
AKT
T
,
S ¿Cuáles son fuertemente reducido. Un subconjunto de las predicciones del modelo se muestra en la figura S3, donde el panel F da una representación 3D de los componentes de pAkt. A 100 nM de insulina, pAkt total es de 78,7% del total de Akt en control. En general, parece que el presente modelo proporciona un ajuste adecuado de los datos de L6.
S4 Fig muestra las sensibilidades de las concentraciones de proteína a los parámetros estimados del modelo en la concentración de insulina extracelular de 9,69 nM (estimado
I
e
, 0,5). El patrón general de las sensibilidades de las células L6 en el control y medio db /db es similar a la encontrada para C2C12 células, confirmando que el modelo es capaz de representar ambos tipos de datos. Además, la sensibilidad a pequeñas y son de acuerdo a los pequeños valores de las estimaciones mientras que, como se esperaba, las sensibilidades a los aumentos de J factor en las células expuestas al medio db /db comparación con el control. La sensibilidad a
a
12 es pequeña tanto en las células C2C12 y L6, lo que sugiere que el bucle de realimentación negativa de S6K1 a mTORC2 tiene un papel insignificante en estas líneas.
La célula L6 también se analizaron los datos en presencia de la retroalimentación positiva, con la constante
a
P
en la ecuación (4) se establece en un valor menor para las células en medio db /db en comparación con el control. Los resultados, sin embargo, no parecen mejorar en los obtenidos con el modelo actual.
Las simulaciones con modelos mejorados de Akt y mTOR complejos
Tres posibles extensiones de los modelos de Akt y mTOR complejos por lo tanto más:. localización subcelular de Akt, la activación mTORC1, y la respuesta a la rapamicina mTORC2
el tráfico de moléculas dentro de la célula es regulada por la difusión y transporte activo, procesos que requieren un tratamiento matemático complejo basado en parciales ecuaciones diferenciales [36,37]. Para dar un modelo simplificado de la localización subcelular de Akt, sólo hemos considerado la fosforilación de Akt en Thr308. Por lo tanto, tenemos moléculas de Akt en el compartimento citosólico (Akt
cyt y pAkt
CYT), los ubicados en el PM (Akt
pm y pAkt
pm), y los que están en el núcleo (pAkt
Nuc). La figura 4 el panel A muestra un esquema del modelo.
(A) PIP3 recluta PDK1 y Akt a la membrana plasmática. En la tarde, Akt fosforilada por PDK1 se desfosforiló y por PP2A. Transporte de momento no Akt fosforilada de la tarde de nuevo a citosol está regulada por la constante de velocidad
k
-13. Akt fosforilada se transporta al citosol (constante de velocidad
k
mc
) donde se desfosforiló por PP2A o importados en el núcleo (
k
cn
). La exportación desde el núcleo está regulada por
k
nc
. (B) Akt fosforilada inactiva TSC2. TSC2 activa promueve la unión a Rheb PIB y TSC2 inactivación estimula la conversión de Rheb /PIB a Rheb activa /GTP, que a su vez activa mTORC1. mTORC1 también es inhibida por PRAS40. La caja incluyendo mTORC1 activo y sustrato Akt rico en prolina de 40 kDa (PRAS40) representa la reacción (3) en S1 File (Texto S3). (C) PRAS desmontables (KD:
K
mTOR
aumentado en comparación diez veces para controlar y
φ
= 0,7, cajas de color rosa) y la sobreexpresión (OE:
K
mTOR
reducido a la mitad en comparación con el control y
φ
= -5/6, cajas amarillas) y el efecto sobre la activación mTORC1 a 1 nM de insulina. (D) las concentraciones normalizadas Rheb /GTP y de S6K1 T389 a la insulina 1 nM con PRAS desmontables (diez veces
b
PRAS
disminución, cajas de color rosa), la sobreexpresión PRAS (doble
b
PRAS
aumento, cajas amarillas), y con tanto PRAS (doble
b
PRAS
aumento) y Rheb (cinco veces
B Opiniones
Rheb
aumento) sobreexpresión (cajas de color naranja). (E) las concentraciones de proteína en las células normalizadas TSC2 nulo a 1 nM de insulina. (F) Respuesta a corto plazo y el tratamiento de rapamicina a largo plazo de mTORC1 y mTORC2, y el efecto sobre la fosforilación de Akt en 10 nM de insulina. tratamientos a corto y largo plazo:
K
mTOR
en la ecuación (14) de S1 de archivos (texto S3) se establece en 0.1 de control. Plazo del tratamiento a largo: parámetros y de Akt las ecuaciones (9) - (11) ajustado en 0.1 de control de
Las ecuaciones de las concentraciones de Akt se dan en la S1 de archivos (texto S3) y el espectáculo. que, en el estado estacionario, las tres concentraciones de Akt fosforilada tienden a ser igual, siempre que
k
nc
≅
k
cn
y
k
mc
≅
K
15
PP página 2
Un
.
Akt
cyt
tiende a ser igual a
Akt
pm
siempre que es igual a
K
13
PDK
1 y
k
-13 es mucho más pequeña que estas dos cantidades también a niveles bajos de insulina. Por otra parte,
k
mc
debe ser mucho mayor que
K
14
PP página 2
Un
. Aunque no tenemos datos que garanticen que se cumplen estas condiciones, se garantiza que la mayor parte de Akt
cyt alcanza con seguridad pm y está fosforilada, y que pAkt
de la tarde se transloca rápidamente de PM a citosol, donde tiene que fosforilan varios sustratos . En estas condiciones, el modelo Akt considera en S1 archivo (Texto S1, Texto S2) y las ecuaciones (9) - (11), donde se tuvo en cuenta la localización subcelular, se puede considerar un modelo adecuado de la cinética de Akt en el estado estacionario . Observamos, sin embargo, que la respuesta transitoria de las concentraciones de Akt a un cambio repentino en la concentración de insulina es probable que sea diferente si la localización sub-celular se considera o no.
Fig 4 el panel B muestra el esquema de el modelo mejorado de la activación mTORC1. Las ecuaciones (12) - (15) en S1 de archivos (texto S3) dan las concentraciones normalizadas de los componentes moleculares y los datos científicos que proporcionan información sobre la respuesta de las proteínas de la Akt. TSC2 nivel de fosforilación en T1462 tiene un aumento de más de 10 veces en células HEK-293 tras la estimulación de suero [38]. El aumento en el nivel de fosforilación en PRAS40 T246 puede variar de aproximadamente 10 veces a 20 veces en el músculo esquelético aislado con valores más pequeños en el corazón, el hígado y el tejido adiposo [39]. Estas limitaciones de los datos proporcionados en la estimación de los parámetros en las ecuaciones (12) - (15), y la singularidad de las estimaciones se garantizaba mediante el establecimiento de
φ
= -0.67 (
b
PRAS
= 3
b
mTORC
1, es decir, la tasa de síntesis PRAS es tres veces mayor que la de la heterotrımero mTOR, rapaz, mLST8) y. Para estimar los parámetros restantes, tomamos los perfiles de y de
mTORC
1
n
como una función de
I
e
obtenido a partir del modelo de células L6. El perfil de se utilizó como fuente de entrada en (12) y (15) de S1 de archivos (texto S3), y los valores de los parámetros que se reproducen de forma óptima
mTORC
1
n
perfil ha sido el siguiente:
K
TSC
= 65.95,
K
Rheb
= 6,48,
K
mTORC
1 = 7,2 · 10
-3,
K
PRAS
= 16,72.
las simulaciones presentadas en la figura 4, los grupos CF, se utilizó el modelo ISN completa de las ecuaciones (1) - (16) con la ecuación (14) de
mTORC
1
n
sustituye por las ecuaciones (12) - (15) de S1 File (Texto S3). La pérdida de expresión PRAS40 estuvo representada en el modelo por una disminución de diez veces de
b
PRAS
comparación con el control, con los consiguientes cambios de
K
mTOR
, y
Hoteles en φ (14) - (15) de S1 de archivos (texto S3). La figura 4C muestra la disminución de
PRAS
40
n
y el aumento de los
mTORC
1
n
en esta condición, en comparación con el control. Por el contrario, la sobreexpresión PRAS40 con un aumento del doble en
b
PRAS
inhibe la activación mTORC1. En la figura 4D, las concentraciones normalizadas de S6K1 T389 bajo desmontables y sobreexpresión PRAS (cajas de color rosa y amarillo, respectivamente) siguen la respuesta de los
mTORC
1
n
se muestra en el panel C. tanto bajo PRAS y la sobreexpresión de Rheb (recuadros naranja), mTORC1 y S6K1 ya no inhibió son comparados con el control debido a GTP cargado Rheb supera la inhibición mTORC1 PRAS40 mediada, como se señala en [38] y la predicha por la ecuación (14) en S1 Archivos (Texto S3). Los resultados de las simulaciones en el panel D parecen estar de acuerdo, cualitativamente al menos, con la fosforilación T389 S6K1 aumento mostrado por las manchas de la figura 4E (células HEK293E) y Fig 5E (MEFs y 29 HT-cáncer de colon células) de [40] .
(a) Esquema del modelo utilizado para el análisis de datos de la población de células de AML en ausencia y presencia de AZD8055. Los bloques representan /G1, S y G2M células G0, con el bloque de 2 x denota la división celular binario.
λ
1 es la constante de velocidad de la transición G1S,
T
2 y
T
3 los tiempos de tránsito en las fases S y G2M y
μ la constante de velocidad de la pérdida de células de búsqueda: '. D
1-D
3 representan las células perdidas de compartimentos viables pero todavía medible, y A los cuerpos y fragmentos apoptóticos, con
μ de búsqueda: '' la constante de velocidad de la fragmentación celular. (B) de datos, dibujado de nuevo de Ref [44], las fracciones de células en fases del ciclo celular en el control y las células tratadas con 10, 100, y 1000 nM AZD8055 (cuadrados cerrados), y ajuste del modelo (líneas sólidas). El panel también muestra los datos y la instalación de LI normalizaron para controlar, y de la fracción total de las células muertas y fragmentos. (C) Correlación entre los datos de tinción con naranja de acridina en las células A549, dibujado de nuevo de Ref [43], y la fracción de células muertas. (D) La relación entre la disminución de pAkt (Ser473) (cuadrados) y el de
λ
1 en el aumento de las concentraciones de drogas. línea de montaje
y
= 1,03
x
/(0.18·10
-2+
x
), con
y =
pAkt (Ser473 ) y
x =
λ
1. Una función similar se ajusta a la relación entre GSK3 (Ser9) (triángulos) y
λ
1.