Extracto
receptor de andrógenos (AR) mediada es necesaria para el desarrollo normal de la glándula prostática y también impulsa el cáncer de próstata (CaP) el crecimiento y la supervivencia celular, con muchos estudios que muestran una correlación entre el aumento de los niveles de receptor y resistencia a la terapia con la progresión a fatal castración recurrente CaP (CRPC). Aunque se ha sostenido desde hace tiempo que el factor de transcripción Sp1 es el principal estimulador de la transcripción del gen AR, el conocimiento exhaustivo de la regulación del gen AR sigue siendo incompleta. Aquí se describen y caracterizan con detalle dos elementos reguladores activos novedosos en el 5'UTR del gen AR humana. Ambos de estos elementos contienen la superposición de sitios de unión para el factor de transcripción Sp1 positiva y la proteína represora pur-α. la señalización celular aberrante es característico de PCa y la actividad transcripcional del promotor de AR en células de CaP depende de las cantidades relativas de los dos factores de transcripción. Junto con nuestra corroboración del papel dominante de SP1, los resultados apoyan la razón de ser de la orientación de este factor de transcripción para inhibir la progresión del tumor. Esto debería ser de particular importancia terapéutica en CRPC, donde se reducen los niveles del represor pur-α
Visto:. Hay CW, Hunter, MacKenzie A, McEwan IJ (2015) Un Sp1 Modulada región reguladora única de Regula los primates superiores de andrógenos, receptor de la actividad del promotor en células de cáncer de próstata. PLoS ONE 10 (10): e0139990. doi: 10.1371 /journal.pone.0139990
Editor: Zoran Culig, Universidad Médica de Innsbruck, Austria |
Recibido: 16 Junio, 2015; Aceptado: September 20, 2015; Publicado: 8 Octubre 2015
Derechos de Autor © 2015 Hay et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Oficina del Jefe Científico (OSC) del Gobierno de Escocia (http://www.cso.scot.nhs.uk/) : CWH (CZB-4-477) e IH (ETM /382)
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
próstata cáncer (CP) es el segundo cáncer más frecuente en los hombres y constituye la segunda causa principal de muertes por cáncer en varones en los países occidentales y el sexto a nivel mundial, respectivamente [1]. Además, la incidencia de CaP está aumentando en casi todos los países con la tasa de nuevos casos esperados para duplicar en 2030 a 1.7 millones producto de 500.000 muertes adicionales [2].
El crecimiento y la diferenciación de células epiteliales normales de la próstata células, así como el desarrollo y la progresión de CaP, son impulsados por la señalización de andrógenos que está mediada por el receptor de andrógenos (AR) [3]. Por lo tanto, la inhibición de la función de AR por la terapia de privación de andrógenos (ADT), utilizando antagonistas o abatimiento de los testículos o la síntesis de andrógenos intratumoral constituye el procedimiento principal para hacer frente a avanzado y metastásico CaP [4-6]. Inicialmente, la mayoría de los pacientes experimentan una mejoría significativa y la remisión, pero el cáncer invariablemente evoluciona para convertirse en independiente de los andrógenos circulantes y se conoce como la castración resistente CaP (CRPC) [7]. Esta etapa tardía, metastásico suele ser mortal y representa el mayor desafío para el desarrollo de nuevas terapias eficaces, [8]; que requieran múltiples regímenes AR-dirigida (revisado en [9]). Fundamentalmente, los tumores CRPC siguen dependiendo de AR señalización; ejemplifica tanto en las células sensibles (AS) y CRPC de andrógenos en disminución de la expresión AR induce una pérdida concomitante de la viabilidad celular [10].
Las funciones del receptor de andrógenos como un factor de transcripción activado por andrógenos que se une a elementos de respuesta a andrógenos ( Ares) [4] en los promotores y potenciadores distales (86% a 95% de la ARE [11]). La capacidad de transactivación del receptor es modulada por la interacción con una lista cada vez mayor de coregulators y factores de transcripción (revisado en [12]), que actúan en el propio receptor o alterar el entorno de la cromatina. Por ejemplo, la transcripción pionera factores FOXA1 y GATA2 promueven una estructura de cromatina abierta que facilita la unión de AR, y el genoma estudios muestran amplias co-localización de los sitios de estos tres factores [13,14] vinculante. GATA2 juega un papel particularmente importante porque, así como aumentar la unión a AR potenciadores, participa en bucle de la cromatina y regula al alza directamente la expresión génica AR [13,14]. Los niveles elevados de GATA2 en CaP se correlacionan con altas puntuaciones Gleeson, y reducción de la actividad a través de la expresión humedecido [13,14] o la inhibición de la ocupación GATA2 en Ares con la curcumina isoflavonas [15] como resultado la proliferación de células CaP inferior.
la mayoría de los tumores CRPC sobreexpresan el receptor de [16-19] con la selección clonal exacerbar el problema [20]. Los niveles elevados de permiso de AR de unión a la cromatina en 100 veces menor concentración de ligando de lo normal [21] y el programa transcripcional AR-impulsado aberrante en tumores CRPC permite a las células crecer en concentraciones bajas de andrógenos [22] o la ausencia aparente de hormonal [23-25], la derogación de ese modo ADT [26] y el tratamiento con abiraterona [20].
En los humanos, el gen AR se extiende por aproximadamente 180 kpb del cromosoma X (Xq11.2-q12) y da lugar a una transcripción de 4,3 kb que incluye una larga región extraordinariamente 5 'no traducida (5'UTR) de 1,1 kb. El promotor carece de cajas TATA y CCAAT y, en común con muchos genes TATA-menos, la transcripción es impulsado principalmente por la unión del factor de transcripción de dedo de zinc de expresión ubicua, la especificidad de la proteína 1 (SP1) a elementos reguladores de la caja GC. El promotor central se encuentra entre -74 y 87 pb [27] y las cajas GC activos se han confirmado en -46 a -41 pb, así como en el 5'UTR en 429 y 442 pb [27-29]. expresión Sp1 guiado del gen AR es facilitado por un tramo de aproximadamente 90 pb de homopurina /homopirimidina inmediatamente aguas arriba del promotor (-150 a -60 pb) que proporciona una fuente abundante de factor de transcripción para unirse al promotor central [30 ]. Una vez unido al promotor, asociados SP1 directamente con la proteína de unión a TATA y asociados-TBP factor de 4 (TAF4) [31] para establecer el complejo de iniciación. Además, Sp1 puede formar multímeros y múltiples tetrámeros apilados proporcionan numerosos sitios de atraque para una variedad de otras proteínas para regular la transcripción tanto directamente como a través de la acetilación de histonas y remodelación de la cromatina (revisado en [32]). Además de las cajas GC upregulatory, la región 5'UTR codifica varios elementos reguladores inhibitorios, incluyendo un compuesto de NF-kappa B, el sitio B-myb de unión [33], un negativos son [34] y un supresor del receptor de andrógenos (ARS) [35 ] que se une pur-α y hnRNP-K en cadenas opuestas del ADN [36].
el AR representa claramente talón de cáncer de próstata de Aquiles sin embargo, el tratamiento primario actual de los antagonistas de los andrógenos tiene limitaciones y también conduce a la expresión de un transcriptoma AR-driven alternativa con resultados variables CaP [37]. Un enfoque mucho más eficaz sería la reducción de la actividad de AR través de la expresión reducida o interferencia con cofactores esenciales de transcripción por ejemplo, un inhibidor de molécula pequeña de GATA2 ha demostrado ser eficaces [13]. Ambos enfoques dependen de un conocimiento detallado de las interacciones de los múltiples factores de transcripción y los elementos reguladores implicados en la expresión AR. Por lo tanto, como el factor de transcripción Sp1 se considera generalmente que es un estimulador importante de la expresión génica AR, hemos estudiado la función de Sp1 en el promotor inmediato y 5'UTR del gen AR humano. En este informe se describen dos nuevos elementos reguladores activos en el 5'UTR AR humana que ambos contienen la superposición de sitios de unión para factores de transcripción positivos y negativos. El resultado de la transcripción en células de CaP depende de las cantidades relativas de Sp1 estimuladores e inhibidores pur-α. Los resultados también corroboran el papel dominante de Sp1 en la conducción de la expresión del RA y refuerzan así la razón de la orientación de este factor de transcripción, ya que esta acción se promueve la unión de competir pur-α e inhibir la progresión del tumor. Por último, los elementos reguladores exhiben muy mala conservación evolutiva que ilustra la naturaleza distintiva de la regulación génica AR humana.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
líneas celulares de carcinoma de próstata humano LNCaP y DU145 se obtuvieron de la Colección Europea de cultivos celulares y la American Type Culture Collection, respectivamente. DU145 se cultivaron en DMEM mientras LNCaP se mantuvieron en RPMI que contiene 1 mM Na piruvato y HEPES 10 mM. Todos los medios se complementaron con suero bovino fetal al 10% (PAA) y se mantuvieron a 37 ° C sin antibióticos en una atmósfera humidificada que contiene 95% de aire y 5% de CO
2.
Western Blot
Los extractos celulares se prepararon a partir de células LNCaP y DU145, y transferencias de Western realizaron como se detalla anteriormente [38]. Sp1 humana, pur-α, hnRNP-K, y GAPDH fueron detectados utilizando anticuerpos ab13370, ab79936, ab52600 y ab36840 (todos de Abcam) a diluciones de 1: 6.000, 1: 60.000, 1: 17.000 y 1: 12.500, respectivamente. Anti-AR de Santa Cruz Biotechnology (sc-7305) se utilizó a una dilución 1: 100. Los complejos antígeno-anticuerpo se detectaron utilizando rábano picante anti-conejo IgG anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (Sigma) como se describió anteriormente. análisis de la integración de transferencias de Western se llevó a cabo utilizando el software Image J.
RT-PCR
células LNCaP se trataron con DMSO o 50 nM mitramicina A (Sigma) durante 24 horas. Extracción de ARN y RT-PCR para la AR y GAPDH mRNA se llevaron a cabo como se describe anteriormente [34].
Plásmidos y mutagénesis dirigida al sitio
Las mutaciones de potenciales elementos reguladores se introdujeron en el plásmido phAR1. 6Luc, en el que la expresión de luciferasa es conducida por 1,6 kpb del promotor y 5'UTR del gen del receptor de andrógenos humano (entre -741 y 842 pb) [34], usando dos metodologías. sustituciones de bases fueron creados usando el kit QuikChange II Mutagénesis (Agilent Technologies) utilizando los oligonucleótidos que figuran en la Tabla A en S1 de archivo, junto con sus complementos inversos. Las mutaciones por deleción se hicieron usando el sistema de clonación de PCR In-Fusión ventaja de Clontech utilizando los oligonucleótidos que figuran en la parte B S1 del archivo. Ambos protocolos se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante y la integridad de todas las construcciones fue confirmada por secuenciación del ADN.
La transfección de luciferasa y ensayos de gen reportero
Veinte placas de cuatro pocillos se sembraron con LNCaP o DU145 células a una densidad de 5 x 10
4 células /cm
2 y 1,2 x 10
4 células /cm
2, respectivamente. Las células se cultivaron en medio completo durante 24 h, a continuación, transfectadas con 440 ng /pocillo de luciérnaga plásmido indicador de luciferasa usando JetPEI polietilenimina (Polyplus transfección) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de 24 h, se sustituyó el medio y las células se cultivaron durante otras 24 o 48 h.
plásmido transfección se llevó a cabo en al menos la actividad por triplicado y luciferasa se midió por duplicado o triplicado usando una microplaca de 96 GloMax luminómetro (Promega) y se normalizaron para la concentración de proteínas como se describe anteriormente [38].
Preparación de extractos nucleares
los extractos nucleares se prepararon a partir de células DU145 en presencia de inhibidores de la proteasa (proteasa completo cóctel inhibidor de Roche, más PMSF 1,0 mM) y los inhibidores de la proteína fosfatasa (5 mM β-glicerofosfato y 100 M activan Na
3Vo
4) usando el método de Dignam
et al
[39].
electroforética ensayos de movilidad (EMSA) guía
Cualquiera de 10 mg LNCaP extracto nuclear de células o 120 nM purificaron la proteína Sp1 humana recombinante (Active Motif) se incubaron con 20 fmol biotina 3 'de ADN de doble cadena marcado en el extremo oligonucleótidos usando condiciones descritas anteriormente [34]. Las secuencias delanteras de los oligonucleótidos fueron: SP1-1, 5'-CGGCCCGGTGGGGGCGGGACCCGACTCGCA-3 '; ARS, 5'-TCTCCACCCCGCCTCCCCCCACCCTGCCTT-3 '; y Sp1-3, 5'-TTCTCCCCACCCGCCCCCCCGCCCCCGTCG-3 '. Se añadió un oligonucleótido no marcado de un elemento de consenso Sp1 regulador, contras SP1, 5'-ATTCGATCGGGGCGGGGCGAGC-3 '15 min antes de la sonda marcada. Para los ensayos de supershift los anticuerpos ab13370 y ab52600 (Abcam) contra Sp1 humano y hnRNP-K, respectivamente, se añadieron 15 min antes de la adición de sonda marcada
El ADN resultante:. Productos de proteína se resolvieron en enfriado desnaturalizante 6% geles de poliacrilamida en tampón TBE 0,5x, pH 8,3 (45 mM Tris-borato, EDTA 1 mM) y detectados utilizando reactivos de Pierce LightShift quimioluminiscente (Thermo Scientific) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las cifras fueron compiladas utilizando geles de autorads EMSA con el fin de carriles dentro de algunos geles siendo alterados para facilitar la claridad y facilitar las comparaciones. integración digital del ADN:. complejos de proteínas se llevó a cabo utilizando un Vilber Loumat Fusión SL enfría sensor CCD teniendo cuidado para asegurarse de que no se produjo la saturación de píxeles
inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) ensayo de
Una descripción detallada de la metodología chip ha sido presentado previamente [34]. En resumen, las células LNCaP fueron transfectadas con el plásmido basado en phAR1.6Luc relevante y se cultivaron de la manera habitual. Las células se fijaron en 1% de formaldehído durante 10 min a 37 ° C y se prepararon núcleos. La cromatina y el plásmido se digirieron con 200 unidades HphI (NEB) durante 20 min a 37 ° C; seguido de la lisis y la eliminación de los restos insolubles por centrifugación. El sobrenadante se diluyó en tampón de chip y precleared usando proteína-G y la Proteína-A Dynabeads (Life Technologies). Las muestras de lisados despejadas se retuvieron como entrada (IP) y el resto se incubó con anticuerpos contra cualquiera de Sp1 (07 a 645, Millipore) o IgG. Los inmunocomplejos se recogieron por magnetización, se lava dos veces cada uno con: bajo contenido de sal; alta concentración de sal; LiCl y TE tampones, seguido de elución. DNA-proteína enlaces cruzados se invirtieron con NaCl a 65 ° C y se purificaron ADN. ADN aislado se cuantificó la fase de registro semi-PCR cuantitativa y se resolvió mediante electroforesis en gel de agarosa en tampón TAE. El avance (F) y atrás primers (R) fueron: ARS-H, 5'-GCTGCTAAAGACTCGGAGGA-3 '; ARS-R, 5'-CTGAGAGTAGCCGACTGAGG-3 '; Sp1-3-F, 5'-CCCGAGTTTGCAGAGAGGTA-3 'y vect-R, 5'-TCTTCCATGGTGGCTTTACC-3'.
El análisis estadístico
La significación estadística de las diferencias en los conjuntos de datos de ADN :. la formación de complejos de proteínas en experimentos EMSA se determinó a través de dos vías ANOVA y la prueba t emparejado se empleó el análisis de varianza para todas las otras comparaciones entre los datos complementarios
Resultados
El gen AR humana 5 ' UTR contiene dos regiones con la superposición de elementos reguladores
el examen del gen AR humano que codifica la región 5'UTR de la transcripción (figura 1A) reveló un posible cuadro de GC unión Sp1 (328-332 pb) que se encontró que estar dentro de la secuencia anteriormente descrita supresor del receptor de andrógenos (ARS) [35] (figura 1B). El primer ejemplo de un elemento regulador ARS que puede obligar a la expresión ubicua proteína pur-α se describe en la 5'UTR del gen AR ratón sobre 400 pb aguas abajo de la secuencia humana correspondiente [40]. Como ambas cajas GC y los sitios del ARS tienen un alto contenido de GC, la posibilidad de otros ejemplos de estos dos elementos reguladores superposición fue investigado más a fondo. Aunque la unión de PUR-α es secuencia específica con una preferencia por repeticiones de (GGN), no hay ninguna secuencia de reconocimiento de consenso claro, por lo tanto, se utilizó la región de la ARS ratón protegido de la DNasa I digestión para buscar otros sitios posibles en el 5'UTR humano. Una región de la 5'UTR humano, distal a la secuencia ARS, poseyendo% de identidad 85 se detectó (Fig 1C), que es mayor que el 70% de identidad visto con la misma sonda y la ARS humanos establecidos (S1A FIG). El uso de la secuencia ARS ratón definido [41] produjo un hallazgo similar con la identidad 75%, lo que, de nuevo, era mayor que el valor de 67% para los humanos (ARS S1B y S1C Fig), respectivamente. El potencial región novela supresor de solapado el elemento regulador Sp1-3 que se sabe que albergan dos cajas GC activas [29]. Esto planteó la intrigante posibilidad de que estas dos regiones pueden actuar para estimular o reducir la expresión de AR.
(A) Representación esquemática de la 5'UTR del gen AR humana y el promotor proximal inmediata que muestra los principales elementos reguladores y las regiones en estudio. flecha doblada indica el sitio de inicio de la transcripción (+1) y ATG con la flecha de trazo continuo muestran el inicio de la traducción. (B) Potencial cuadro de GC (verde cuadro de líneas discontinuas) dentro del elemento confirmados ARS humanos reguladora (subrayado de color azul). (C) La alineación de la 5'UTR AR humana y el AR 5'UTR elemento supresor de ratón protegido de la digestión DNasa I [40] (subrayado de color azul) con las cajas GC humanos confirmados (caja verde fijo). Las secuencias homólogas están indicadas por líneas verticales.
Los alineamientos múltiples de las regiones equivalentes de la 5'UTR del gen AR humana en otras 11 especies que utilizan secuencias de ADN públicamente disponibles (Figura 2) demostró que ambas secuencias son poco conservado. La región del ARS está presente sólo en los primates y la secuencia de chimpancé, que se separaron de los humanos hace 6,6 millones de años [42], tiene homología con perfecta humano. Por otra parte, y en el lapso de 42,2 millones de años a partir de la divergencia de los seres humanos y tití, el primate más divergentes examinó, la mayoría de las secuencias muestran sólo una pocas sustituciones de nucleótidos. La región está representada Sp1-3 incluso menos homología con sólo el chimpancé comparten ambas cajas GC con los seres humanos. Para ambas regiones de interés, las especies no primates poseían niveles muy bajos de homología con humano, y no hay secuencias equivalentes se encontraron en especies de aves o piscine (datos no mostrados). Además, el ratón ARS región es muy poco conservada y ninguna secuencia de unión pur-α se ha encontrado en la región genómica equivalente de otros animales, incluyendo los roedores estrechamente relacionados; la rata (Fig S2).
Las regiones de la 5'UTR del gen hAR bajo investigación se compararon con los de las especies indicadas placentarios. (A) la ARS (caja azul), y (B) el elemento regulador Sp1-3 (caja verde). Las diferencias con la secuencia humana se indican con negrita, subrayado fuente.
El cuadro de GC es el sitio de unión Sp1 en el promotor principal de AR humana
Los experimentos iniciales examinaron el efecto de la Sp1 antagonista, mitramicina a, en el gen AR endógeno en las células LNCaP. A mitramicina Se observó una reducción dependiente de la dosis en los niveles de proteína de AR (Fig 3A) con una concentración de 50 nM mitramicina A se utiliza en experimentos posteriores. estudios de RT-PCR confirmó que la disminución de los niveles de proteína de AR correlacionada con la reducción de la transcripción (Fig 3B).
células LNCaP fueron incubadas con mitramicina A durante 24 h y luego se sometieron a ensayo. (A) análisis de transferencia de Western con los valores relativos de AR /GAPDH se muestran a continuación. (B) RT-PCR de AR y ARNm GAPDH. células LNCaP fueron transfectadas con phAR1.6Luc (WT) o phAR1.6Luc-ΔCG y se trataron con DMSO o 50 nM mitramicina A durante 24 horas y se midió la actividad de luciferasa. Los datos representan las medias ± SD de al menos tres experimentos independientes y la significación estadística de las comparaciones indicadas son: * p & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01 y *** p & lt;. 0.001
Aunque desde hace tiempo se ha considerado que el factor de transcripción Sp1 es el principal impulsor de la expresión del gen AR humana carece de caja TATA, la importancia relativa de la caja GC (SP1-1; -45 a -40 pb) en el núcleo promotor sigue siendo poco clara con supresión estudios sugieren que o bien es esencial [27] o no juega un papel importante [43]. La mutación del cuadro de GC en el plásmido informador de luciferasa phAR1.6Luc [34] que contiene una sección de 1,6 kpb del promotor hAR y 5'UTR entre las posiciones -741 pb a 842 pb dio lugar a una reducción del 80% en la expresión de luciferasa en transfectadas células de andrógenos LNCaP sensibles (figura 3C). Del mismo modo, se observó una reducción del 46% con la línea celular de CaP que no responde de andrógenos DU145 (datos no mostrados). Juntos, estos ensayos demostraron que la caja GC núcleo promotor, y Sp1 vinculante, jugar un papel prominente en la expresión de AR ARNm y proteínas. Es importante destacar que, el plásmido reportero mutado se mantuvo susceptible a la inhibición por mitramicina A (figura 3C), lo que confirma que la regulación al alza mediada por Sp1 del gen AR se produce en sitios distintos de la caja GC.
El 5'UTR superposición reguladora los elementos se pueden regular a la baja la altura o la actividad promotora
con el fin de dilucidar la actividad funcional de otros elementos reguladores potenciales en estudio, además se introdujeron mutaciones en el plásmido informador de luciferasa phAR1.6Luc. Los experimentos de transfección se realizaron utilizando tanto andrógeno sensible, LNCaP y no responde, las líneas celulares DU145 CaP, que se cultivaron en medio completo para garantizar que toda célula vías de señalización que son dependientes de componentes de medios (factores de crecimiento y hormonas), eran funcionales.
con el fin de establecer el papel de Sp1 de unión a la caja GC potencial en la ARS (322 a 345 en la 5'UTR), se introdujeron sustituciones de bases para crear reportero phAR1.6Luc-UTRm1 que dio lugar a reducciones de expresión de 29% y 13% en las células DU145 y LNCaP respectivamente (Fig 4A y 4B) que confirman el papel activo de esta novedosa caja de GC en la regulación positiva de la expresión del RA. Por el contrario, esta región de la 5'UTR se ha demostrado que actúa como un elemento regulador negativo a través de la unión del factor de transcripción pur-α que se ha informado que ser interrumpido en condiciones EMSA por la inclusión de un par de sustituciones de dos bases [35] y éstos se utilizaron para preparar reportero phAR1.6Luc-UTRm2. Sin embargo, utilizando la actividad transcripcional este reportero se redujo en un 36% y 20% en DU145 y LNCaP respectivamente en lugar de aumentar (Fig 4B) como podría predecirse después de la liberación de un inhibidor. La inspección de los cambios de secuencia producidas por la mutación revela que la guanina y cyctosine en el centro de la caja GC putativo fueron reemplazados por adenina de una manera análoga a la mutación-Sp1 específico en phAR1.6Luc-UTRm1. Por lo tanto, la pérdida de Sp1 vinculante en este elemento regulador es el resultado dominante, proporcionando una prueba más de que la caja GC putativo puede regular al alza la expresión de AR activa. En la probabilidad de que la mutación de sustitución de la región ARS fue insuficiente para impedir pur-α y hnRNP-K de unión en condiciones fisiológicas, todo el elemento regulador se ha eliminado para crear phAR1.6Luc-UTRΔm1. En este caso, la actividad del promotor se upregulated por 1,27 y 1,67 veces en DU145 y LNCaP, respectivamente (Fig 4B) con la diferencia entre las dos líneas celulares siendo significativa (p & lt; 0,01).
(A) Diagrama esquemático de la luciferasa phAR1.6Luc reportero constructo impulsado por 1,6 kpb del promotor hAR y 5'UTR con un potencial factor de transcripción de unión a las regiones de interés. Sp1-3 contiene dos sitios de unión SP1. (B y C) Las líneas celulares de CaP indicados, se cultivaron en medio completo, fueron transfectadas con cualquiera phAR1.6Luc que contiene la secuencia WT (barras negras) o la versión mutada (barras grises) se muestra encima de cada gráfico. datos de la luciferasa representan la media ± SEM de al menos tres experimentos independientes y la significación estadística de las comparaciones indicadas son: * p & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01 y *** p & lt;. 0.001
mutaciones análogas también se introdujeron en la tercera secuencia reguladora de interés (423-446). En primer lugar, las dos cajas GC en Sp1-3 se mutaron de forma individual (phAR1.6Luc-UTRm3 y phAR1.6Luc-UTRm4) o en conjunto (phAR1.6Luc-UTRm5). La actividad de luciferasa reveló que la interrupción de las cajas GC resultó en una disminución significativa en la estimulación del promotor. Las dos mutaciones simples disminución de la actividad transcripcional de 42% y 29% en las células DU145 y por 29% y 17% en las células LNCaP, y la mutación se muestra la reducción de dobles de 34% y 16% en las dos líneas celulares, respectivamente (Fig 4C). Una vez más, los descensos en la actividad promotora fueron mayores en DU145 de LNCaP. Los efectos de las mutaciones no fueron acumulativos como podría esperarse a partir de dos sitios de unión se solapan. De una manera similar a la observada con la región de 322 a 345, mutación de sustitución de base del elemento de regulación negativa de solapamiento potencial en phAR1.6Luc-UTRm6 produce pérdidas de actividad transcripcional de 9% y 4% en DU145 y LNCaP respectivamente (Fig 4C). Estos valores fueron menos los observados con la región de 322 a 345 descritas anteriormente, sin embargo, eran consistentes con la secuencia de cambios que tiene solamente un impacto menor en los sitios de unión SP1. La deleción de todo el elemento regulador negativo potencial en phAR1.6Luc-UTRΔm2 condujo a 1,18 y 1,50 upregulation veces de la actividad transcripcional en DU145 y LNCaP, respectivamente (Fig 4C). Al igual que con la mutación de deleción phAR1.6Luc-UTRΔm1, el aumento de la actividad del promotor fue significativamente mayor en LNCaP que DU145.
Las características de unión de la 5'UTR superposición de elementos reguladores
La posibilidad de que se liga SP1 para las tres regiones bajo estudio se examinó mediante ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA). En los experimentos iniciales, se purificó la proteína Sp1 humano recombinante se incubó con las sondas de oligonucleótidos marcadas que contiene o bien el cuadro principal GC (SP1-1), el nuevo sitio de unión Sp1 potencial en la región ARS o Sp1-3. resolución electroforética de los productos resultantes con las tres sondas marcadas mostró un único ADN de alto peso molecular:. complejo de la proteína cerca de la parte superior del gel (Fig 5A, carriles 2-4) consistente con Sp1 que tiene un peso molecular de 95 kDa
proteína purificada Sp1 (panel a) o extracto nuclear de células DU145 (paneles (B) a (D)) se incubaron con las sondas de oligonucleótidos marcadas indicados debajo de cada gel y los productos se resolvieron mediante análisis de cambio de movilidad electroforética. Las adiciones se muestran por encima de los geles y se fueron: Ab, anticuerpo; PI, suero pre-inmune; Mith, mitramicina; contras SP1, el consenso Sp1 de oligonucleótidos. Se añadieron oligonucleótidos no marcados que compiten (100 exceso molar de plegado) o sueros inmunes antes de la adición de la sonda. EMSA son representativos de al menos 3 experimentos independientes. (A) Las sondas marcadas indicadas se incubaron con la proteína Sp1 purificada excepto en el carril 1 que no tenía adición. Negro flecha indica compleja Sp1-ADN. Se añadió anticuerpo (B) Anti-Sp1 como se indica, y el complejo ausente después de la incubación con el anticuerpo se indica por la flecha. Se añadió (C) Mithramycin (120 nM) a los carriles indicados y el complejo agotado después de la incubación con el fármaco está indicado por la flecha sólida. (D) se añadió sin marcar sitio de unión Sp1 consenso oligonucleótido que codifica compitiendo como se muestra.
La incubación de extracto nuclear preparado a partir de la línea celular de cáncer de próstata DU145, ya sea con SP1-1, ARS o oligonucleótidos Sp1-3 producido varias bandas con movilidades electroforéticas prácticamente idénticos (figura 5B, carriles 1, 4 y 6 respectivamente). La unión de Sp1 se confirmó en todos los casos por la adición de anticuerpo anti-Sp1 que produjo un supershift con el oligonucleótido SP1-1 y disminuido en gran medida el montaje de un ADN de alto peso molecular: complejo de proteína con ambos ARS y Sp1-3 (Fig 5B , carriles 2, 5 y 7 respectivamente), mientras que el suero preinmune no tuvo ningún efecto (figura 5B, carril 3). Diferentes resultados de la incubación con anticuerpo anti-factor de transcripción pueden ocurrir en EMSA analiza, por ejemplo, CREB-1 a los sitios de CRE en los de insulina y somatostatina promotores humanos [44], debido a varios factores, incluyendo: la fuerza de la unión al ADN; la organización /conformacional espacial de la proteína en elementos reguladores, la orientación del ADN adyacente al consenso y la presencia de cofactores consolidados.
La adición de mitramicina A, que interfiere con la unión de Sp1 a su elemento regulador [45 ], reducido en gran medida la formación de los complejos de alto peso molecular con los tres oligonucleótidos (Fig 5C, comparar los carriles 1 y 2, 3 y 4, y 5 y 6). Del mismo modo, la preincubación con un exceso de oligonucleótido no marcado que contiene la secuencia de unión consenso Sp1 elimina virtualmente todo el ADN: proteína de la formación del complejo (Fig 5D, comparar los carriles 1 y 2, 3 y 4, y 5 y 6). En conjunto, estos resultados confirman la unión de Sp1 a todas las secuencias que contiene la caja de tres GC, apoyando las conclusiones de los experimentos de genes reportero (Fig 4). Además, la diferencia en los resultados observados con los oligonucleótidos para el sitio SP1-1 en el promotor de núcleo en comparación con la ARS y sitios Sp1-3, que muestra menor afinidad aparente para Sp1 natural, diferentes resultados tras la incubación con anticuerpo anti-Sp1 y menor reducción mutación inducida en ensayos de luciferasa (figura 4), sugirió que la unión de Sp1 a la caja de promotor GC núcleo era más fuerte que a la 5'UTR.
el factor de transcripción pur-α se une preferentemente a guanina rica ADN de cadena sencilla o de las secuencias equivalentes en el ADN de doble cadena. La incubación de extracto nuclear, ya sea con el doble cadena o el G-ricos sola hebra inversa de la ARS y sondas Sp1-3 arrojó resultados muy disímiles. Tanto de las sondas de cadena simple produce un complejo ADN: proteína (indicado por la flecha abierta) que migran ligeramente por delante de Sp1: DNA y otros complejos de alto peso molecular típicamente vistos con la sonda de doble hebra (Fig 6A). De acuerdo con la capacidad de PUR-α de obligar también dsDNA, tanto las ARS y los oligonucleótidos de doble cadena Sp1-3 produce un ADN débil: complejo de proteína que migró en una posición muy similar a la del producto visto con las sondas de cadena simple. Es importante destacar que, el complejo ADN: proteína formada con el G-rico hebra de Sp1-3 se comportó de una manera idéntica a la del oligonucleótido ARS equivalente que se sabe que se une pur-α [36]. Curiosamente, pur-α se une al ADN como dímeros y multímeros [46] que sobrevivir a las condiciones no desnaturalizantes de EMSA resultantes en la aparente características de migración de alto peso molecular de los complejos ADN: proteína. El anticuerpo anti-pur-α comercial no para provocar un efecto y la proteína purificada no está disponible. Sin embargo, los citosina ricos en hebras hacia adelante complementarias de las ARS y oligonucleótidos Sp1-3 fallaron completamente para producir el complejo ADN: proteína que confirma la especificidad de unión a la hebra G-rico (Fig 6B; comparar los carriles 1 y 7, y 4 y 8).
extracto nuclear de las células DU145 se incubaron con las sondas de oligonucleótidos marcadas indicados debajo de cada gel y los productos se resolvieron mediante análisis de cambio de movilidad electroforética. Las adiciones se muestran por encima de los geles y se fueron: Ab, anticuerpo; PI, suero pre-inmune. EMSA son representativos de al menos 3 experimentos independientes.