Extracto
Proporcionamos datos funcionales novedosas que el silenciamiento postranscripcional de genes
RPL19
utilizando RNAi no sólo abroga el fenotipo maligno de las células de cáncer de próstata PC-3M, pero es selectivo con respecto a la transcripción y traducción de otros genes. La reducción de
RPL19
transcripción modula un subconjunto de genes, se evidencia por análisis de genes gama de expresión y transferencia Western, pero no compromete la proliferación celular o la apoptosis
in-vitro
. Sin embargo, el crecimiento de los tumores xenoinjertados que contienen el derribado
RPL19 in-vivo
se reduce significativamente. El análisis de los genes modulados revela la inducción del fenotipo no maligno principalmente para involucrar a la perturbación de las redes de factores de transcripción y genes de adhesión celular. Los datos proporcionan evidencia de que las funciones de regulación extra-ribosomal de
RPL19
, más allá de la síntesis de proteínas, son reguladores críticos de fenotipo celular. Dirigirse a los miembros clave de las redes afectadas identificadas mediante análisis de expresión génica plantea la posibilidad de estabilizar terapéuticamente un fenotipo benigno generados por la modulación de la expresión de un gen individual y, posteriormente, limitando un fenotipo maligno, dejando los tejidos no malignos no afectado.
Visto : Una abeja, Brewer D, C Beesley, Dodson A, S Forootan, Dickinson T, et al. (2011) siRNA desmontables de la proteína del gen ribosomal
RPL19
abroga el fenotipo agresivo de cáncer de próstata humano. PLoS ONE 6 (7): e22672. doi: 10.1371 /journal.pone.0022672
Editor: Steven R. Ellis, de la Universidad de Louisville, Estados Unidos de América
Recibido: 18 Enero, 2011; Aceptado: 4 Julio 2011; Publicado: July 22, 2011
Derechos de Autor © 2011 Bee et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por el Fondo Noroeste de Investigación del cáncer (Reino Unido), el Cancer Research del Reino Unido, el Instituto Nacional de Investigación del cáncer (MRC-Reino Unido), un programa especializado de Investigación de Excelencia (SPORE) subvención del Instituto Nacional del cáncer (EE.UU.), Gran La caridad de los masones, rosales Confianza, El Bob Champion Cancer Trust, el atractivo de la orquídea y la Fundación David Koch. los organismos de financiación no ha participado en el diseño y realización del estudio, en la gestión de la recogida, análisis e interpretación de los datos, o en la preparación, revisión y aprobación del documento de
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia.
Introducción
proteínas ribosomales (RPS) comprenden un complejo super-familia de proteínas [1] altamente conservado durante la evolución, lo que indica su importancia funcional para los organismos vivos [2]. Esta afirmación está respaldada por el número de pseudogenes RP y duplicaciones de genes compartidos junto con las regiones de identidad entre proteínas homólogas en procariotas y eucariotas [3]. ribosomas eucariotas contienen aproximadamente 80 RPs junto con cuatro ARN ribosomal (rRNA) y requieren unos 150 factores no ribosomal de organizarse en sus constituyentes pequeñas (40S) y grandes (60S) subunidades [4]. considerados inicialmente para participar sólo en la síntesis de proteínas, ciertos RPs son reconocidos como pleiotrópicos y para mediar en una variedad de funciones de regulación extra-ribosomal [5], [6]. Tales RPs, incluyen L5 [7], L11 [8], L13 [9] y S7 [10]. En el pez cebra (
Danio rerio
) un papel de gran alcance para RPs como supresores de tumores se ha demostrado mediante el cual la mutación o supresión de cualquiera de los diversos genes RP perjudica el control de p53, promoviendo así la malignidad [11], [12]. Recientemente, el concepto de "ribosomopathy" se ha convertido establecerse procedimientos, por la mutación de un RP particular es patógena para una enfermedad específica [13]. Aproximadamente el 25% de los casos de anemia de Diamond-Blackfan son causados por la mutación del gen de la proteína ribosomal
RPS19
mientras que en otro 20%, se producen mutaciones en otros genes de la proteína ribosomal [14]. En la actualidad, aproximadamente el 77 individuo
rps19
mutaciones se han descrito [15]. Además, la haploinsuficiencia para las proteínas ribosomales se ha demostrado, en algunos casos, ser una causa subyacente de la anemia de Blackfan Diamond [16].
En la actualidad, los mecanismos relacionados con mutaciones en los genes del PO al cáncer siguen siendo desconocidos [17]. Para el largo brazo de la región proximal del cromosoma 17, donde se describe la presencia de
RPL19
gen se localiza (17q), los principales cambios específicos del cáncer. Estos incluyen amplificaciones y copiar los cambios de numeración, en particular los de la región, que incluyen oncogén
ErbB2
, formación de Isocromosoma 17q, duplicaciones, deleciones, mutaciones y otros reordenamientos genómicos. Anteriormente [18], hemos identificado una mayor expresión de
RPL19
mRNA en la próstata líneas celulares y tejidos que se correlaciona con un fenotipo maligno agresivo. Desde elevada
RPL19
ARNm se produjo como uno de un número relativamente pequeño de secuencias sobreexpresado en el cáncer de próstata, la hipótesis de que su efecto es probable que sea más selectiva que parte de una elevación inespecífica global en la expresión génica . proteína ribosomal L19e (RPL19) pertenece a la L19E super-familia de proteínas y, en eucariotas, es un componente de la subunidad ribosomal 60S grandes. El gen se expresa en gran parte de la evolución, particularmente en eucariotas y arqueas, pero está ausente de las bacterias [19], [20] aunque hay homología entre las secuencias de rata y en L19
E. coli
proteínas ribosomales L18, L30 y S2 [21] Sorprendentemente, para un gen aparentemente tan importante,
RPL19
ha recibido hasta ahora poca atención. En los seres humanos,
RPL19
mapas en el cromosoma 17q11.2-17 en q12 donde se codifica 9 variantes de corte y empalme potenciales. En una serie de biopsias de cáncer de mama humano,
RPL19
ha informado que se expresa y co-amplificado junto con
ErbB2
y los genes
PNMT
,
PSMB3
y
NR1D1
[22]. Esta región compleja que contiene varios genes ha sido sugerido como un posible amplicón [23], [24] que se extiende por algunos ~547 kb de
RPL19
través de
STRAD3
y
ErbB2
a
GRB7 Hoteles en la región 17q11.2-q12. Actualmente, no hay datos han fundamentado esta especulación. En el cáncer de próstata, es poco frecuente, se informa de amplificación de erbB2 en sólo el 0,04% [25] a 2% [26] de los casos, y por lo tanto no es un mecanismo común de RPL19 sobre-expresión. Desde nuestra identificación inicial de RPL19 en cáncer de próstata [18], su expresión se ha demostrado para definir el cáncer colorrectal mal pronóstico [27] y como un antígeno tumoral novela en adenocarcinoma de pulmón [28].
Los cambios globales en modulación de los genes en el cáncer de próstata humano han sido previamente perfilado mediante el análisis conjunto de expresión de ADN [29] que se han detectado cambios en la expresión génica siguientes selectiva sobre regulación de los genes diana individuales [30], [31] o después de gen-desmontables utilizando antisentido [32 ] o RNAi [33] tecnología con la posterior transformación del fenotipo maligno. Los genes expresados diferencialmente y sus redes asociadas han sido evaluados como biomarcadores de separación de distintos fenotipos de cáncer de próstata de acuerdo con el comportamiento y la respuesta al tratamiento [34]. Sin embargo, una alteración del nivel de la expresión génica no es así,
ipso facto
, confirman un papel primordial en el proceso maligno. La inestabilidad genómica es el sello de la transformación maligna [35] y los efectos de la ganancia o pérdida de un solo gen son susceptibles de ser transmitidas a lo largo del genoma con la consecuencia de que la expresión de otros genes se convierte en segundo lugar modulada [36]. Tales cambios pueden tener ya sea una relación inmediata y activa con el fenotipo celular resultante o su expresión alterada es pasiva y sin consecuencias. Para evaluar la relevancia funcional de un gen en particular, la supresión de su transcripción permite el análisis de sus efectos inmediatos sobre la expresión de todo el genoma. células prostáticas malignas Anteriormente, hemos transfectadas epiteliales PC-3M con un 436 pb de largo oligonucleótido antisentido para knock-down expresión de
FABP5 Windows que mejoró el fenotipo tumor maligno tanto
in vitro y
in vivo
[37]. en el presente documento, hemos empleado la técnica quirúrgica de más RNA de interferencia (RNAi) con potencialmente mayor especificidad y eficiencia, dependiendo del gen particular que se esté dirigida [38].
Nuestros datos anteriores [18] indicó que la expresión de
RPL19
podría ser funcionalmente importante en la promoción de tumores malignos de próstata. Ahora hemos puesto a prueba esta hipótesis mediante la reducción selectiva de
RPL19
expresión utilizando RNAi. Las células PC-3M resultantes exhiben un fenotipo maligno abrogada tanto
in vitro
y
in vivo
cuando se somete a evaluación fenotípica y análisis de la expresión génica. Los datos apoyan la posibilidad de un papel funcional para
RPL19
, actuando dentro de un espectro de la expresión génica alterada, en el mantenimiento del fenotipo maligno de las células de cáncer de próstata humano. La confirmación de un escenario de este tipo permitiría el enfoque terapéutico selectiva de RPL19, ya sea inmunológicamente [28] o el uso de moléculas pequeñas, para modular subconjuntos discretos de proteínas celulares que son los promotores principales del fenotipo maligno.
Resultados
siRNA desmontables de RPL19 en células PC-3M parentales
transfección transitoria.
qPCR análisis de las células PC-3M parentales utilizando los cebadores definidos en la Tabla 1 reveló una fuerte
RPL19
expresión de ARNm, confirmado por la secuenciación de nucleótidos.
a partir de entonces, la transfección transitoria de las secuencias de siRNA a
RPL19
exón 1 (Tabla 2) reveló Target#1 para ser la secuencia más eficaz para el silenciamiento de ARN, lo que reduce su expresión con sólo el 7% de su nivel inicial (Figura 1A). Mientras que las otras secuencias son eficaces, sólo la combinación de las tres simultáneamente era mejor que Target#1, solo. A partir de entonces, el Objetivo nº 1 se utilizó para todos los experimentos posteriores.
A. qPCR análisis de
RPL19
niveles de expresión transitoria tras el silenciamiento de diferentes objetivos en el PC-3M
células parentales. Objetivo#1 (T1) fue la más eficiente con el nivel residual sólo el 7% detectado. Esta reducción sólo se superó por la combinación simultánea de T1 + T2 + T3. B. Análisis de qPCR de
RPL19
niveles de expresión después de silenciamiento estable de Objetivo 1 #. Estos datos se compilan a partir de experimentos realizados por triplicado. Las mediciones son en relación con la expresión de RPL19 en si-PC-3M
células revueltos. También se muestran los niveles comparativos en las células PNT2 benignas. C. morfológica apariciones de (i) PC-3M
células parentales y diversos de las colonias (II-IV) siguientes caída estable de
RPL19
. Algunas colonias (II) estaban mal adherente con la mayoría de las células que crecen en suspensión. Otros (iii) contenían formas predominantemente multinucleadas. Las células compuestas mayoría (iv) que eran más pequeños que el de los padres. Clone ST-3 células utilizadas en todos los experimentos posteriores se muestran en este panel. (Aumento x 200)
La transfección estable.
Los niveles de
RPL19
ARNm se midieron en PNT2, PC-3M
padres, PC -3M
scramble y si-
RPL19-
PC-3M
destino#1 en las células transfectantes transitorios (Figura 1B). De acuerdo con el estudio anterior [33], la expresión en PC-3M
células scramble se fijó en la unidad y expresiones relativas en las otras líneas celulares se compararon como plegado diferencias.
RPL19
expresión en PC-3M fue 4,9 veces mayor que la de las células PNT2 y consistente con nuestros estudios anteriores confirmados por análisis de transferencia Northern [18]. En el si-
RPL19-
PC-3M
clon ST-3 células transfectantes, expresión de
RPL19
se redujo a sólo 1,3 veces mayores que las células PNT2. PC-3M
células scramble reveló una reducción 2,3 veces en
RPL19
cuando se compara con PC-3M
parental, aunque este valor no fue estadísticamente significativa. clonación de células individuales [33] seguido por qPCR y Western Blot confirmó si-
RPL19-
PC-3M
clon ST-3 expresaron los niveles más bajos de
RPL19
ARNm y proteínas. Este clon de células se utilizó posteriormente para su análisis detallado fenotípica.
Características de crecimiento de Si-RPL19cells
in vitro
Los clones transfectados de si-
RPL19
células -PC-3M cultivadas bajo condiciones estándar mostraron diferencias en la morfología (Figura 1C). En comparación con los PC-3M
células parentales, si-
RPL19
células -PC-3M en general eran menos adherente al sustrato. Sin embargo, estas células mantuvieron una capacidad de proliferar y podría ser exitosamente sub-cultivadas, aunque una gran proporción de las células se mantuvo en suspensión. Otros si-
RPL19
células -PC-3M mostraron un aumento en las formas multinucleadas, lo que sugiere alteración de la finalización de la mitosis. Los ensayos de proliferación (Figura 2A) revelaron que durante la fase logarítmica de crecimiento, la tasa de división celular por la si-
RPL19-
PC-3M
clon células transfectantes ST-3 no se vio afectada significativamente (
p
≥0.05) cuando se compara con PC-3M
de los padres y si-PC-3M
scramble. La capacidad de Si-
RPL19-
PC-3M
clon ST-3 células para invadir una matriz de colágeno extracelular (ECM) se comparó con la de la PNT2, PC-3M
parental y PC -3m
scramble líneas celulares (Figura 2B). El número de células que invadieron a través de la ECM fueron: (PNT2) 0,6 ± 0,6, (PC-3M
parental) 279 ± 33.7 y (PC-3M
scramble) 317 ± 28,3 (
p
& lt; 0,001). La si-
RPL19
células -PC-3M exhibieron un potencial invasivo comparativamente pobres en sólo 60 ± 10,7 células transmigración (
p Hotel & lt; 0,001). Por lo tanto, silenciando
RPL19
reduce el potencial invasivo de las células PC-3M aproximadamente 5 veces. Endógenos (basales) niveles de apoptosis en el PC-3M
padres y PC-3M
scramble células (Tabla 3 y Figura 2C) fueron similares a los obtenidos en estudios comparables de la
PRKCZ
gen [33]. Los niveles basales de la apoptosis en las cuatro líneas celulares no fueron estadísticamente diferentes (
p
& gt; 0,05). Aunque las sensibilidades de la PC-3M
de los padres y si-
RPL19-
PC-3M
no se alteraron clon ST-3 células a camptotecina, este agente de aumento de la apoptosis en PNT2 y PC-3M
células scramble (
p Hotel & lt; 0,0001)
A.. el crecimiento relativo de líneas celulares en cultivo en monocapa revelar ninguna diferencia estadística en la tasa de proliferación entre las células desmontables (si-
RPL19
-PC-3M
clon ST-3) y la de PC-3M
células parentales. B. La invasión de ensayo
in vitro
comparando las mismas poblaciones de células como las mostradas en (A) y que revela una disminución del 83% en la capacidad invasiva de las células del
RPL19
caída relativos a la PC -3M
células revueltos. C. Los niveles de reposo de los índices de apoptosis no fueron significativamente diferentes en el benigna (PNT2), padres (PC-3M) o desmontables células. Después de la exposición de la camptotecina, ningún cambio se identificó en el PC-3M
RPL19
-PC-3M
clon ST-3 células de los padres o si-. Mientras que un aumento de la apoptosis se encontró en las células benignas y en las células scramble transfectadas, estos no fueron significativas. D. El crecimiento de las células tumorales
in vivo
por volumen estimado reveló una muy significativa (
p
& lt; 0,005) la supresión del crecimiento por dos de los clones transfectantes estables, en comparación con los PC -3M
padres y PC-3M
células revueltos. Crecimiento de las células PNT2 no está incluido como ya hemos demostrado [33] el crecimiento de tumores a ser poco frecuentes, en particular en el tiempo útil de estos experimentos. E. Análisis de los pesos de los tumores
in vivo
confirmaron los clones ST-1 y ST-3 para generar tumores significativamente (
p Hotel & lt; 0,005) menor que el PC-3M
parental o la si-PC-3M
células revueltos. F. Análisis inmunohistoquímico de los tumores en crecimiento como xenoinjertos
in vivo
apoyaron los niveles de ARNm de datos (Figura 1B) que, mientras que el original PC-3M
parental (i), y si-PC-3M
scramble (ii) las células expresó la proteína RPL19 a alto nivel. La si-
RPL19
-PC-3M
clon ST-3 células (iii) expresó RPL19 heterogénea y en niveles muy bajos. (Aumento x 350)
tumorigenicidad y RPL19 expresión de la proteína
in vivo
En todos los grupos de animales, los tumores se hicieron evidentes en el día 2 siguiente la inoculación (Tabla 4). Sin embargo, PC-3M
scramble (4/8) grupos más aparecido antes en el PC-3M
parental (3/8) y. En los dos grupos de clones transfectantes, tumores tomaron más tiempo en aparecer (2/8 tumores en los animales portadores del si-
RPL19-
PC-3M
clon ST-3 células y 1/8 tumores en animales de llevar la si-
RPL19-
PC-3M
clon#2 células). Inicialmente, todos los tumores fueron similares en tamaño. Después de 7 días, el PC-3M
padres y PC-3M
grupos scramble desarrollado tumores de más de dos grupos transfectantes (Figura 2D). En la autopsia, 15 días después de la inoculación, una diferencia significativa (
p Hotel & lt; 0,001) fue evidente en los pesos medios del control y
RPL19-
tumores desmontables (Figura 2E). PC-3M
parental exhibió una amplia gama del peso del tumor, un animal que produce un tumor de 810 mg en 15 días, el máximo permitido por la licencia del proyecto. Por el contrario, otro animal desarrolló un tumor de sólo 10 mg. Un fenómeno similar se produjo en el PC-3M grupo
scramble con tumores que van de 10-140 mg. Los pesos finales de los PC-3M
tumores parentales no fueron significativamente diferentes de los de la PC-3M
grupo scramble (Mann-Whitney U Test,
p Hotel & gt; 0,05). Por lo tanto, si-RNA supresión de
RPL19
afectado el tamaño de los tumores generados
in vivo
(
p
& lt; 0,05), pero no en su latencia. No hay micrometástasis se identificaron en la autopsia o en el examen histopatológico posterior de los tejidos extirpados.
La inmunohistoquímica de xenoinjertos de tumores detectó una fuerte expresión de la proteína RPL19 tanto en el PC-3M
de los padres y si-PC- 3M
scramble células (Figura 2F). líneas celulares knockdown si-
RPL19-
PC-3M
clon ST-3 y si-
RPL19-
PC-3M
clon ST-1 mostró comparativamente poca tinción, lo que indica la supresión de la
RPL19
gen continuado en la mayoría de las células tumorales. La detección de pequeñas cantidades de proteína RPL19 en algunas células tumorales se considera que representa la variación clonal resultante de la expresión de bajo nivel continua del gen, en lugar de su inhibición total, según lo identificado por qPCR de las células
in-vitro
y los resultados de los estudios de transferencia Western. Mientras que la expresión del ARNm y la proteína correspondiente en el epitelio prostático, no siempre son concordantes [39], aparentes discrepancias entre
y
in vivo
estudios puede ser in vitro
debido a la
In -vivo
efectos de una matriz de estroma que rodea afectan la adhesión de células tumorales o de otras influencias que incluyen factores de crecimiento que modulan la expresión génica de bajo nivel individual [40] - [42].
gen comparativo de perfiles de expresión de los si- RPL19-PC-3M
clon ST-3 células
perfiles de expresión de genoma completo obtenidos a partir de microarrays de oligonucleótidos de ADN (no modificada Agilent Human Genome 44K) fueron empleados para identificar genes modulados siguientes
RPL19
noquear. Comparación de los genes expresados por PC-3M
padres y PC-3M
scramble líneas celulares no reveló diferencias estadísticamente significativas (
p
≥0.05), lo que indica que la técnica de transfección no era responsable de apreciable fuera de objetivo efectos que el sesgo de la fuerza de los datos experimentales. Un total de 916 secuencias de ADN, lo que representa 768 genes, fueron identificados como diferencialmente expresado (
p
≤0.05, Benjamini y Hochberg múltiples pruebas de corrección aplicado). De éstos, 404 se mejoraron y 364 regulada hacia abajo. Dentro de este conjunto de datos, 184 genes diferentes se modulan al menos cuatro veces, siendo 62 hasta reguladas y 122 el regulado. Las 50 mejores genes expresados diferencialmente en estas dos categorías se resumen en la información de apoyo Tablas S1 y S2 y gráficamente (Figura 3). Expresión de datos derivados de los arreglos fueron validados por qPCR proporcionando evidencia cuantificable independiente de la magnitud y dirección del cambio de genes individuales. La observación de que sólo 768 genes fueron modulados siguiente
RPL19
caída, con los niveles de ARNm para una amplia gama de proteínas, ya sea mantenido o elevada, sugiere que RPL19 proteína ribosomal participa diferencialmente en la síntesis de proteínas en lugar de afectar todas celular la síntesis de proteínas de manera no específica.
mapa de calor de los 50 genes regulados y los genes regulados hacia abajo top50 siguiente expresión-perfiles de ARNm expresado por si-
RPL19
-PC- 3M
clon ST-3 células cuando se compara con PC-3M
células parentales utilizando PC-3M
células revueltos como denominador común. se muestra la agrupación jerárquica. El color verde indica exceso de genes expresados en una muestra en comparación con las células transfectadas con luchar para. El color rojo indica los genes regulados hacia abajo en la muestra en comparación con las células transfectadas con luchar para. Los correspondientes datos numéricos se presentan en la información de apoyo cuadros S1 & amp; S2
enriquecimiento de análisis funcional para identificar algunos ontología 20 genes (GO) términos de procesos biológicos y tres términos de función molecular (Apoyo a la Información S3) que se asoció significativamente (
p
. & Lt; 0,001) con los desmontables (
p Hotel & lt; 0,001). Adicionalmente 13 KEGG vías tenían una representación excesiva significativamente de los genes expresados diferencialmente entre los
RPL19-
PC-3M
clon ST-3 y PC-3M
scramble (Apoyo a la Información S4). Se utilizó el análisis vía ingenio para identificar las redes biológicas significativas y las vías en las que los genes expresados diferencialmente como consecuencia de
PRKC-ζ
caída estuvieron involucrados. Los cinco principales vías clasificaba a interrelacionadas (Apoyo a la Información S5) y la ontología de tres genes (GO) términos de función molecular (Apoyo a la Información S6) son altamente significativas (
p
≤10
-27) con respecto a los genes expresados diferencialmente después de
RPL19
caída.
proteína ribosomal genes.
La hipótesis de que siRNA inducida por la baja regulación de
RPL19
podría compensarse por la modulación de otras proteínas ribosomales se abordó por evaluación de la expresión relativa de las secuencias de gran gen de la proteína ribosomal mitocondrial (n = 71) y las secuencias grande de genes de proteína ribosomal citoplasmáticos (n = 136) para descubrir si la regulación de un gen ya expresa o se había producido neoexpression de un gen proteína ribosomal previamente en silencio. De esta última cohorte, 44 genes codifican RPS conocidos, 7 eran RP-like y 5 eran pseudogenes RP. El número de secuencias que representan cada gen varió de uno (19 genes) a 14 (
RPL21
). RPL19 fue identificado por una única secuencia. De acuerdo con la SCOP (Clasificación Estructural de Proteínas, última versión 9
de noviembre de 2010, http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop) RPL19 es un miembro de la superfamilia de proteínas de las proteínas que contienen la traducción dominio estructural barril SH3-como dentro de la clase que comprende todas las proteínas beta. La familia también contiene proteínas ribosomales RPL14e, RPL21e y RPL24p y el dominio C-terminal de RPL2 (http://supfam.org/SUPERFAMILY/cgi-bin/scop.cgi?sunid=50104). Alternativamente, la proteína RPL19 podría ser sustituido por RPL29 o RPL39e, siendo los miembros de estructura similar del grupo α-helicoidal de RPs globulares con colas extendidas capaces de unirse ARNm [43]. A pesar de las fluctuaciones se produjeron en los niveles de expresión de las secuencias de genes individuales RPL siguiente
RPL19
desmontables, estos no fueron significativos, incluyendo la de la proteína ribosomal genes
RPL23A
también situado en el cromosoma 17q11.2. Sólo la expresión de mitocondrial
MRPL42
fue significativamente las reguladas (
p Hotel & lt; 0,05). No se detectó expresión mejorada de cualquier gen RP. Por lo tanto, la inhibición de
RPL19
con pérdida de proteínas RPL19 no fue compensada por un gen RP diferente. Por el contrario, los efectos de la reducción de
RPL19
podrían estar mediados por la función de codificación independiente del gen o de sus ARNm pseudogene [44].
genes de glicosiltransferasa.
Transformación de células epiteliales de una benigna a un fenotipo maligno suele ir acompañada de cambios estructurales en los dominios de oligosacáridos de las glicoproteínas y glicolípidos celulares [45]. En particular, la expresión de sialilado y
β-1,6
ramificado se requieren oligosacáridos ligados a N para la invasión de células de cáncer y la metástasis [46]. La enzima clave en este proceso es manosilo (
α-1,6
-) - glicoproteína
β-1,6
-N-acetil-glucosaminyltransferase codificada por el gen
MGAT5
y regulada por la señalización RAS-RAF-MAPK. Junto con
PTEN
,
MGAT5
regula la dinámica de la membrana de PI3K /Akt señalización para promover el fenotipo maligno invasivo [47]. En el caso de que la malignidad se reduce después de la manipulación de fenotipo celular, cambios en las estructuras de oligosacáridos de la superficie celular se postulan que se produzca. Tales cambios, mediadas por glicosiltransferasas puede ser evidenciado por alteraciones en la expresión de los genes correspondientes. De los 768 genes expresados diferencialmente, sólo dos genes de glicosiltransferasa se vieron afectados significativamente después de
RPL19
desmontables (Apoyo a la Información S7). A diferencia del espectro de glicosiltransferasas moduladas siguiente si-ARN caída de Publicar en PC-3M células
PRKC-zeta [33], ningún cambio fue evidente en los genes silayl- o fucosiltransferasa-transferasa. Sin embargo, una reducción de 4 veces fue identificado en el nivel de
MGAT4A
(
p
& lt; 0,05) que codifica la manosil enzima (
α-1,3 -) -
glicoproteína
β-1,4-
N-acetilglucosaminiltransferasa y está implicado en la mediación de la glicosilación de las proteínas codificadas por
SLC43A3 gratis (proteoglicanos 2), SLC14A1 (transportador de urea) y
SLC8A1
(intercambiador de sodio /calcio), controlando de este modo su expresión de la superficie celular. De hecho, los tres últimos genes eran moduladas siguiente
RPL19
caída. A la inversa, un aumento 2~3 veces fue identificado en el nivel de
GalNAcT-2
(
p
& lt; 0,05) que codifica la enzima de condroitina sulfato de N-acetilgalactosaminiltransferasa 2 y transferencias N- acetilgalactosamina (GalNAc-) a partir de UDP-GalNAc [48] a la condroitina, sulfato de condroitina, preferentemente a oligosacfocharides complejos que contienen
β1 → 4
vínculos [49], tales como los generados por
MGAT4A
.
Ion canales y genes asociados
El fenotipo maligno de las células epiteliales prostáticas puede ser modulada por la expresión diferencial de los canales iónicos [50] - [52].. Los estudios realizados en este laboratorio [52] y en otras partes [53] han establecido una relación funcional entre los canales iónicos dependientes de voltaje y el fenotipo invasivo de las células de cáncer de próstata [50]. El interrogatorio de los arrays de expresión reveló varios canales de iones y algunos genes asociados a modular siguiente
RPL19
desmontables (Apoyo a la Información S3). Los canales de potasio mostraron una respuesta mixta. El K dependiente de voltaje
+ canal de subunidades alfa y beta (
KCNQ2
y
KCNAB2
) se redujeron regulado de 3,5 y 2,25 veces, respectivamente (
p
& lt; 0,05 para ambos). El rectificador hacia adentro K
+ canales (
KCNJ6
y
KCNJ12
) mostraron una respuesta mixta, siendo regulado hasta 5,5 veces y las reguladas 2,5 veces, respectivamente (
p
& lt; 0,01 para ambos). Dos de voltaje Na
+ genes de los canales (
SCN3A
y
SCN9A
) son a la vez hasta reguladas, 9 veces (
p Hotel & lt; 0,005) y 2,3 veces (
p
& lt; 0,05), respectivamente. Por último, cerrada voltaje de dos Cl
- canales /Cl
- H
+ antiporte transportadores (
CLCN4
y
CLCN5
) fueron ambos hasta reguladas, 2,1 y 1,8 veces, respectivamente (
p Hotel & lt; 0,05 para ambos).
Otros genes y redes asociadas
Ninguno de los genes de control del ciclo celular, incluyendo el. 31 hemos mostrado anteriormente a estar asociado con una alta probabilidad de progresión del cáncer de próstata [54] fueron modulados en su expresión tras la precipitación o
RPL19
. Del mismo modo, ninguno de los genes reconocidos para mediar la apoptosis se modula en los transfectantes. De las 19 secuencias que cubren la familia de las caspasas de los genes de la apoptosis,
CASP1
se había reducido regulado ~ 7 veces (
p Hotel & lt; 0,005) después de
RPL19
caída. La expresión de otros miembros de la familia no se alteró. En apoyo de la matriz de datos, transferencia de Western confirmó que las caspasas -3 y -9 escindidos no fueron expresados en el PC-3M
parental o en el si-
RPL19-
PC-3M
clonar células transfectantes ST-3. Estos hallazgos apoyan la idea de que la alteración de la expresión de
RPL19
no afecta ni a la del ciclo celular o de las vías de apoptosis. Por el contrario, las principales vías afectadas siguiente
RPL19
desmontables implican las redes de genes que regulan la homeostasis y la interacción entre las células malignas y su entorno (Figura 4). A modo de ejemplo, la expresión del gen regulador de
AGR2
hemos identificado a estar elevada en los cánceres de próstata de fenotipo agresivo [55] se había reducido regulado ~ 11 veces (
p Hotel & lt; 0,02) después de
RPL19
caída. El producto de este gen se une al receptor ErbB3 y está regulado por la unión de ADN reguladores transcripcionales forkhead FoxA1 y FoxA2. Western Blot confirmó la abolición de esta proteína en las células desmontables (Figura 5), el apoyo a la matriz de datos (información de apoyo cuadros S1 & amp; S2). Por el contrario, HOXB13 que codifica un factor de transcripción que pertenece a la familia de genes homeobox que demostró ser un marcador biológico específico de tejido de epitelio benigno y maligno de próstata [56] fue elevado ~ 3 veces (
p
& lt; 0,001 ) después de
RPL19
caída.
Análisis de genes modulados siguiente
RPL19
desmontables identificado cinco vías interconectadas principalmente afectados (Apoyo a la Información S5). Cuatro de estos incluyen genes que codifican enzimas MMP (A); el complejo ICAM1-integrina (B); el NFkB complejo (C) y la regulación de PI3K (D). Este análisis confirmó varios genes modulados por la expresión regulada hacia abajo de
RPL19
a estar interconectados, haciendo hincapié en las numerosas vías para la diafonía entre los procesos biológicos aparentemente distintos.
En estos estudios, comparación se hizo con si-
PRKC-ζ
-PC-3M
T1-6 [33] y si-
FABP5
-PC-3M
clon 3 [62] células RNAi desmontables para confirmar que los cambios en los niveles de proteína eran específicos de
RPL19
desmontables y no parte de una respuesta general a la inhibición de genes usando ARN-SI. Después de la tinción con anticuerpos primarios, las membranas se volvieron a tiñeron para beta-actina. La intensidad de esta banda se utilizó para normalizar los niveles de proteína individuales. A. RPL19: Siguiendo
RPL19
caída, los niveles redujo a ~ 5% de los del PC-3M
células de los padres, mientras que los niveles se mantuvieron en si-
PRKC-ζ-
PC -3M
T1-6 y si-
FABP5
-PC-3M
3 clones de células. B. S11A4: Los niveles se mantuvieron en todas las líneas celulares, siendo afectado por
RPL19
caída.