Extracto
telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT) es la enzima clave responsable de la síntesis y el mantenimiento de los telómeros en los extremos de los cromosomas, y es esencial para la proliferación celular. Esto ha hecho hTERT en un foco de la investigación oncológica y un objetivo atractivo para el desarrollo de fármacos contra el cáncer. En este estudio, hemos diseñado un ARN interferente pequeño (siRNA) centradas en la subunidad catalítica de hTERT y probado sus efectos sobre el crecimiento de células de carcinoma de colon SW480 humano positivas de telomerasa in vitro, así como en la tumorigenicidad de estas células en ratones desnudos . La transfección transitoria y estable de hTERT siRNA en células SW480 de cáncer de colon suprimió la expresión de hTERT, la actividad de la telomerasa reducida y inhibe el crecimiento celular y la proliferación. El derribo de la expresión de hTERT en los tumores SW480 xenotransplantes en ratones desnudos desacelerado significativamente el crecimiento del tumor y promovido la apoptosis de las células tumorales. Nuestros resultados sugieren que hTERT está implicado en la carcinogénesis del carcinoma de colon humano, y destacan el potencial terapéutico de un enfoque knock-down hTERT
Visto:. Liu AQ, Ge LY, Lu XL, Luo XL, YL Cai Vosotros XQ, et al. (2014) silenciamiento del gen hTERT por shRNA inhibe el cáncer de colon SW480 Crecimiento Celular
in vitro
y
En Vivo
. PLoS ONE 9 (9): e107019. doi: 10.1371 /journal.pone.0107019
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: 10 Octubre, 2013; Aceptado: 14 de abril de 2014; Publicado: 10 Septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de Guangxi (subvención 2010GXNSF013238, http://www.gxst.gov.cn/zwgk/kjxmgl/xmxdgg/600619_7.shtml) y los Programas Académicos de Changjiang y equipos de investigación innovadoras en la Universidad (No. IRT1119). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma colorrectal es el tercer cáncer más común en todo el mundo y la cuarta causa más común de muerte [1] - [2]. Sólo en 2008, aproximadamente 1,23 millones de nuevos casos de cáncer colorrectal fueron diagnosticados en todo el mundo, y 608.000 personas murieron de la enfermedad [3]. El tratamiento estándar para este tipo de cáncer es quirúrgico, pero los resultados están lejos de ser satisfactoria, con hasta un 50% de los pacientes que sufren la recurrencia o muerte dentro de los 5 años de la cirugía [4].
Orientación de la telomerasa en el carcinoma de colon puede proporcionar una alternativa eficaz o complemento al tratamiento quirúrgico. La telomerasa, un complejo de ribonucleoproteína que contiene una plantilla de ARN interno (hTR) y una proteína catalítica con actividad de transcriptasa inversa-telómero específico (hTERT), se extiende telómeros al final de los cromosomas eucarióticos, evitando así la senescencia celular y la muerte. La telomerasa parece desempeñar un papel clave en el crecimiento del tumor y la proliferación: expresión y la actividad de la enzima se encuentra elevado anormalmente en la mayoría de tipos de cáncer [5] - [6], y abajo de la regulación de la enzima inhibe el crecimiento y la proliferación [7]. Mientras hTR es constitutivamente presente en las células normales y tumorales, hTERT es el componente limitante de la velocidad del complejo de la telomerasa, y su expresión se correlaciona con la actividad de la telomerasa [8]. En los tejidos somáticas normales, la actividad de hTERT se reprime, pero tanto la expresión de hTERT y de la actividad telomerasa se encuentra elevado en la mayoría de los tumores humanos [9] - [10]. Varios estudios indican que la telomerasa puede ser clave para inmortalizar las células como un paso necesario en la oncogénesis [11] - [12]., Haciendo hTERT un biomarcador potencialmente útil clínica [13] y un objetivo de la investigación contra el cáncer [14]
en el cáncer colorrectal, de hasta 85% de las células contiene telomerasa activa, mientras que sólo alrededor del 5% de las células colorrectales normales contienen enzima activa. Por lo tanto la orientación de la expresión o actividad de la telomerasa puede proporcionar una nueva terapia para el cáncer colorrectal. Dado que no hay inhibidores de la telomerasa altamente selectivos están disponibles para el tratamiento de cualquier tipo de cáncer, nos centramos en los enfoques de terapia génica. Se espera que la terapia génica para jugar un papel clave en la terapia del cáncer de próxima generación en combinación con los tratamientos convencionales, tales como cirugía, quimioterapia, radioterapia y [15]. Una terapia génica es la interferencia de ARN (RNAi), que puede regular a la baja ( "knock-down") de la expresión de genes específicos, lo que permite las funciones de los genes a analizar o bloqueados con fines terapéuticos [16] - [18].
en el presente estudio, hemos diseñado un novedoso hTERT pequeños ARN de interferencia (siRNA) y expresó la correspondiente ARN corto horquilla (shRNA) en células colorrectales humanos in vitro y en ratones desnudos. Encontramos que la anulación de la expresión de hTERT inhibe el crecimiento de células de carcinoma de colon humano, aumentando la posibilidad de enfoques de terapia génica que se dirigen hTERT.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
de colon humano líneas celulares de carcinoma SW480, DLD-1, y HT29 (Academia Sinica Banco de células, Shanghai, china) se cultivaron en baja en la glucosa del medio de Dulbecco modificado de Eagle (SW480) o RPMI-1640 (DLD-1 y HT29) (GibcoBRL, Gran Island, NY, EE.UU.) suplementado con 10% (v /v) de suero bovino fetal, 100 UI /ml de penicilina, y 10 mg /ml de estreptomicina. Los cultivos se incubaron en 5% de CO
2 a 37 ° C.
Declaración de Ética y Animales
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Laboratorio los animales de los Institutos nacionales de Salud, y el protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentación animal de la Universidad médica de Guangxi. Todas las cirugías se realizan bajo anestesia con pentobarbital sódico, y el sufrimiento que se reducen al mínimo tanto como sea posible. ratones desnudos atímicos (BALB /cA nu /nu) de 4-5 semanas de edad (Guangxi Instituto de Materia Médica, de Nanning, China) fueron alojados en jaulas estériles bajo campanas de flujo laminar en un ambiente libre de patógenos específicos con un 12 h: 12 h horario de luz-oscuridad. Los animales fueron alimentados Chow autoclave y agua ad libitum.
RT-PCR para medir la expresión de hTERT mRNA en diferentes líneas celulares
ARN total fue extraído de SW480, DLD-1 y las células HT29 utilizando Trizol ( Bio básica Inc., Canadá) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. la síntesis de ADNc de primera cadena se realizó con 2 g de ARN de cada línea celular y el virus de la leucemia murina de Moloney RT (MMLV-RT; MBI Fermentas, Amherst, NY, EE.UU.), y luego amplificada en una mezcla de reacción de 50 l que contiene 50 mM de cada uno de los cuatro dNTPs, 3 U de Taq ADN polimerasa (Promega), y 0,5 mM de los cebadores (Sangon Co., Shanghai, china). Los cebadores 5 'GCTGCTCAGGTCTTTCTTTTATG-3' y 5'-CGACGTAGTCCATGTTCACAA-3 'se utilizaron para amplificar una región 252 pb dentro del gen hTERT. Como control interno, la expresión de gliceraldehído fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se ensayó usando los cebadores 5'-CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA-3 'y 5'-ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA-3' para amplificar una región de 450 pb. Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo durante 30 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 56 ° C durante 45 s y 72 ° C durante 45 s. Los productos de PCR se separaron en un gel de agarosa al 2,0%, que fue teñido con colorante de ácidos nucleicos I (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), fotografiado y analizado semi-cuantitativamente usando GeneTools software de análisis (Syngene, Cambridge, Reino Unido). La línea celular que muestra el mayor nivel de ARNm de hTERT fue elegido para el estudio adicional.
Diseño de siRNAs dirigidos hTERT
Tres secuencias de siRNA hTERT fueron diseñados como se describe [19]. Las secuencias fueron los siguientes, con posiciones de inicio de nucleótidos en base a la entrada del NCBI para hTERT (adhesión NM_198253): hTERT-966, 5'-CGGUGUACGCCGAGACCAATT-3 ';
hTERT-2862, 5'-3-GAGCCAGUCUCACCUUCAATT '; y hTERT-2985, 5'-CGGUGUGCACCAACAUCUATT-3 '. Paralelamente, se diseñó una secuencia no relacionada como control negativo para siRNA especificidad: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 '. Las cuatro secuencias se presentaron a una búsqueda BLAST contra genoma humano para excluir la posibilidad de una homología significativa con otros genes. Las secuencias fueron sintetizados químicamente (GenePharma Co., Shanghai, China) y transfectadas transitoriamente en cultivos SW480 que habían sido cultivadas durante la noche a 40-60% de confluencia en medio completo sin antibióticos. Las transfecciones se realizaron usando reactivo Lipofectamine (GenePharma Co., Shanghai, China) según las instrucciones del fabricante. Después de 48 h de transfección, la transcriptasa inversa (RT) -PCR se utilizó para medir la expresión de hTERT mRNA. Se encontró que la secuencia de hTERT-2985 para reducir el nivel de ARNm de hTERT en la mayor medida y, por tanto, se seleccionó para su posterior estudio.
Construcción de un hTERT-shRNA plásmido de expresión eucariota
Los oligonucleótidos de ARN 5'-CGGUGUGCACCAACAUCUATT-3 '(sentido) y 5'-UAGAUGUUGGUGCACACCGTC-3' (antisentido) se sintetizaron químicamente (GenePharma Co., Shanghai, china) y recocido para formar un dúplex con una proyección simétrica de dos deoxythymidines en el 3 ' final (hTERT-siRNA). Un dúplex de siRNA que contiene la secuencia no relacionada 5'-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3 '(NC-siRNA) también fue sintetizado como un control negativo para siRNA especificidad. Para construir un plásmido que expresa NC- o hTERT-siRNA para la transfección estable, los oligonucleótidos hibridados 5'-caccgTTCTCCGAACGTGTCACGTcaagagattACGTGACACGTTCGGAGAAtttttt-3 'y 5'-caccgCGGTGTGCACCAACATCTAttcaagagaTAGATGTTGGTGCACACCGttttttg-3' (secuencias diana en mayúsculas) se subclonaron en el PGPU6 /GFP /Neo vectorial (GenePharma). Este vector expresa la proteína verde fluorescente coral (CGFP) bajo el control del promotor de CMV para permitir la monitorización de la eficacia de transfección. Los plásmidos que expresan hTERT-NC- y siRNA fueron designados, respectivamente, PGPU6 /GFP /Neo-NC-shRNA (en lo sucesivo: NC-shRNA) y PGPU6 /GFP /Neo-hTERT-shRNA. (En lo sucesivo: hTERT-shRNA)
la transfección transitoria de las células SW480
Los cultivos de 2 × 10
5 células por pocillo, se cultivaron en placas de 6 pocillos a 90% de confluencia y se transfectaron con 100 nM NC-shRNA o hTERT-shRNA usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. En paralelo, las células fueron transfectadas con la misma cantidad de Lipofectamine 2000 sin ningún plásmido shRNA como control. Los cultivos se recogieron por triplicado después de la transfección de 24, 48 y 72 h.
RT-PCR para medir la expresión de hTERT mRNA después de la transfección
En cada momento se ha indicado anteriormente, el ARN total fue extraído de transfectadas SW480 células usando Trizol y se sometieron a RT-PCR como se describe anteriormente.
inmunocitoquímica para medir la expresión de proteínas hTERT
SW480 células se sembraron en cubreobjetos de 2,5 cm a una densidad de 5 × 10
5 células /pocillo en placas de 6 pocillos. Después de la transfección durante 24, 48 ó 72 h, los cubreobjetos se retiraron y inmunoti~neron con el anticuerpo anti-hTERT policlonal de conejo (1:300, Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.) y el kit de Maxvision (Maixin, Fuzhou, China). En cada cubreobjetos, cinco vistas fueron seleccionados al azar y capturados utilizando software de análisis de imágenes (Leica, Alemania). En cada punto de vista, la intensidad en escala de grises se midió en 10 puntos seleccionados al azar y se promedia. La intensidad en escala de grises promedio era inversamente proporcional al nivel de proteína.
ensayo TRAP de la actividad telomerasa
Actividad de la telomerasa se ensayó usando un kit comercial de la telomerasa PCR ELISA (Roche Diagnostics Scandinavia AB, Estocolmo, Suecia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este ensayo se basa en el protocolo de amplificación de repetición telomérica [20]. Después de SW480 células habían sido transfectadas durante 48 h con Lipofectamine 2000 sola, NC-shRNA o hTERT-shRNA, o hacia la izquierda no transfectadas en medio de cultivo como un control en blanco, las proteínas celulares totales se extrajeron usando tampón CHAPS lisis, y una alícuota de 0,5-g fue el ensayo. El ensayo consistió en una reacción de elongación de la telomerasa-cebador, seguido por 26 ciclos de PCR. productos de la PCR se detectaron usando una reacción de color basado en ELISA [20].
Actividad de la telomerasa se expresó como una absorbancia ajustado, dada por la absorbancia en unidades arbitrarias a 450 nm menos la absorbancia a la longitud de onda de referencia de 690 nm . De acuerdo con las instrucciones del fabricante, la absorbancia máxima prefijada para el control negativo debe ser de 0,25, mientras que la absorbancia ajustado para la reacción de control positivo incluido en el kit debe ser & gt; 1,5 después de 20 minutos de reacción. Las muestras se definieron como la telomerasa-positivo si la absorbancia ajustado fue de & gt;. 0.2
citometría de flujo para medir el crecimiento y la proliferación celular
SW480 células transfectadas durante 48 h con Lipofectamine 2000 sola, NC-shRNA o hTERT-shRNA, o izquierda no transfectadas en medio de cultivo como un control en blanco, se recogieron, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijaron durante la noche con 66% de etanol. Las células se centrifugaron y se lavaron con PBS, después se incubaron con 50 mg /ml de yoduro de propidio y 2,5 mg /ml de RNasa en PBS durante 30 min a temperatura ambiente. contenido de ADN se analizó por citometría de flujo a una longitud de onda de emisión de 488 nm usando el software multiciclo (BD Biosciences, EE.UU.) [21]. El índice de proliferación (PI) se calculó según la fórmula:
PI = [S + (G2 /M)] /{(G0 /G1) + [S + (G2 /M)]} x 100 %.
citometría de flujo para medir la apoptosis
La apoptosis se midió por las células de doble tinción para anexina V y el ADN (yoduro de propidio) y analizarlas por citometría de flujo. células SW480 transfectadas durante 48 h con Lipofectamine 2000 sola, NC-shRNA o hTERT-shRNA se cultivaron en presencia de las concentraciones indicadas de pristimerina, se recogieron, se lavaron con PBS, y se incubaron en Anexina V tampón de unión (BD Pharmingen) que contiene 0,3% FITC conjugado con Anexina V durante 15 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron y se resuspendieron en tampón de unión Anexina V. Se añadió yoduro de propidio poco antes de la citometría de flujo [21] - [22]. Los datos fueron analizados mediante el software FACSDiva (BD Biosciences).
ensayo de TUNEL para medir la apoptosis
El fin colorimétrico TUNEL System Muerto (Kaiji, Nanjing, China) se utilizó para medir la apoptosis en cultivos SW480 transfectadas con Lipofectamine 2000 sola, NC-shRNA o hTERT-shRNA, así como en ratones desnudos inyectados con solución salina, NC-shRNA o plásmidos hTERT-shRNA (ver abajo). Para los experimentos in vitro, se sembraron las células SW480 en cubreobjetos de 2,5 cm y se transfectaron durante 48 h, después de lo cual cubreobjetos fueron removidos y fijados para el ensayo de TUNEL de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para experimentos in vivo, cortes de tejido tumoral (5 m de espesor) se prepararon. Las láminas fueron fijadas en formol al 10% tamponado con PBS (Kaiji, Nanjing, China) y permeabiliza con proteinasa K (Kaiji). A continuación se procesaron las diapositivas como se describe por el fabricante
.
Los portaobjetos se ensayó en cuanto a células apoptóticas siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, se utilizó recombinante desoxinucleotidil transferasa terminal para añadir nucleótidos biotinilados al ADN, cloruro de sodio y citrato de sodio se añadieron para detener la reacción y, a continuación los portaobjetos se incubaron con rábano picante estreptavidina marcada con peroxidasa. Por último, los portaobjetos se incubaron con una mezcla de peróxido de hidrógeno, cromógeno diaminobencidina, y sustrato de peroxidasa con el fin de teñir los núcleos de color marrón oscuro. Los cortes teñidos se analizaron entonces mediante microscopía de luz utilizando un sistema de captura de imágenes (Leica, Alemania). Al menos 3 campos de gran aumento se examinaron en cada diapositiva (& gt; 500 células en total)., Y el índice apoptótico (AI) se calculó como el porcentaje de células observa una tinción de TUNEL-positivas
microscopía
electrónica de transmisión ( TEM) para evaluar la morfología apoptótica
se transfectaron
células SW480 de 48 h con Lipofectamine 2000 sola, NC-shRNA o hTERT-shRNA y después se recogieron. Las células se sedimentaron, inmediatamente fijado en 3% (v /v) de glutaraldehido, se fijaron posteriormente en 1% (v /v) de tetróxido de osmio y se tiñeron con acetato de uranilo 4,8%. Después de la deshidratación a través de una serie graduada de soluciones de alcohol, las muestras se enjuagaron en óxido de propileno y se impregna con resina epoxi. Las secciones ultrafinas fueron tratados con acetato de uranilo y citrato de plomo para proporcionar contraste para TEM, que se realizó utilizando un microscopio JEM-1230 (JEOL, Japón).
Medición de potencial de membrana mitocondrial (MMP) para evaluar apoptosis
MMP se midió utilizando rodamina 123 tinte fluorescente como indicador (CAS 83702; Sigma, Shanghai, china) como se describe anteriormente [23]. Este colorante tiene un máximo de excitación a 488 nm y un máximo de emisión a 526 nm. En este enfoque, MMP se supone que varían inversamente con rodamina 123 de fluorescencia. células SW480 fueron transfectadas durante 48 h con Lipofectamine 2000 sola, NC-shRNA o hTERT-shRNA, a continuación, se lavaron dos veces con PBS para eliminar las células muertas y se incubaron con rodamina 123 (0,1 mg /ml) a 37 ° C durante 30 min. Rodamina 123 intensidad de fluorescencia se midió utilizando microscopía confocal de barrido (NIKON-AE, Japón). Para cada condición experimental, se determinó la intensidad de fluorescencia media por 500 células.
hTERT ronda en un modelo de tumor de ratón desnudo
células SW480 se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones desnudos a una dosis de 5 × 10
7 células por ratón en 200 l de DMEM diluyó 1:02 en PBS [24]. Cuando los nódulos tumorales habían crecido hasta 7 mm, los ratones se dividieron aleatoriamente en tres grupos de 8 animales, con cada grupo que recibió un total de 6 inyecciones intratumorales de solución salina normal, 20 g NC-shRNA o 20 mg hTERT-shRNA cada 2 días . Los animales se observaron durante 6 días después de la última inyección shRNA [25]. longitud del tumor (L), anchura (W) y el diámetro se midieron dos veces a la semana; el volumen del tumor (cm
3) se calculó utilizando la fórmula W
2 × (L /2) [26]. Los ratones fueron sacrificados y las muestras tumorales fijados en formalina neutra se tiñeron con hematoxilina-eosina y se examinaron por microscopía de luz.
Se determinaron los niveles de hTERT mRNA y proteínas en los tres grupos de ratones desnudos, respectivamente, por RT- PCR e inmunohistoquímica como se describe anteriormente. Actividad de la telomerasa y la extensión de la apoptosis mediante el ensayo de TUNEL también se midieron como se ha descrito anteriormente.
El análisis estadístico
Los resultados se expresaron como media ± desviación estándar. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS 16.0 (IBM, EE.UU.). Las diferencias entre las condiciones de tratamiento fueron evaluados para la significación estadística mediante ANOVA de una vía, seguido por el LSD o el método de prueba de la t de Dunnett. El umbral de significación se definió como
P
. & Lt; 0,05
Resultados
hTERT expresión endógena en líneas celulares de cáncer de colon
En primer lugar hemos examinado el SW480 , DLD-1, y las líneas HT29 para identificar que tenía la expresión de ARNm de hTERT suficientemente alta para facilitar la interferencia de ARN y análisis de los efectos sobre el crecimiento celular. RT-PCR mostró que los niveles de hTERT mRNA fueron apenas detectables en DLD-1 en las células y significativamente mayor en las células SW480 que en las células HT29 (0,827 ± 0,037
VS
0,705 ± 0,051,
P & lt;.
0.05; Fig. 1A). Por lo tanto, las células SW480 fueron elegidos para el estudio adicional.
(A) la expresión endógena de hTERT mRNA en SW480, DLD-1 y células HT29 líneas. No hubo diferencias significativas entre SW480, HT29 y las células DLD-1 (
#
P Hotel & lt; 0,01), y entre SW480 y células HT29 (*
P Hotel & lt; 0,05). (B) La potencia de hTERT siRNAs en células SW480. Los niveles de hTERT mRNA fueron significativamente más bajos en las células transfectadas con siRNAs de hTERT que en las células transfectadas con el control negativo (NC) o Lipofectamine shRNA solo (Lipo). *
P Hotel & lt; 0,05,
#
P Hotel & lt; 0,01, en comparación con los grupos NC-shRNA y Lipo. Los resultados son la media ± SD de tres experimentos independientes.
La detección de los más potentes de hTERT siRNA en cultivos SW480
Tres hTERT-siRNAs (hTERT-966, hTERT-2862, hTERT- 2985) y un siRNA no relacionado como un control negativo (NC-siRNA) se transfectaron transitoriamente en células SW480 para identificar el siRNA que más potentemente reprimida nivel hTERT mRNA, así como para confirmar la especificidad hTERT de nuestro enfoque siRNA. Control de las células transfectadas con el reactivo Lipofectamine sola ( "Lipo") o con NC-siRNA mostraron niveles similares de ARNm de hTERT (0,823 ± 0,025 y 0,815 ± 0,043, respectivamente;
P Hotel & gt; 0,05). La transfección con cualquiera de los tres hTERT-siRNAs condujo a niveles significativamente más bajos de ARNm de hTERT que la transfección con NC-siRNA o Lipo solo (Fig 1B.): HTERT-966, 0,395 ± 0,075; hTERT-2862, 0,650 ± 0,064; hTERT-2985, 0,270 ± 0,056 (todo el
P Hotel & lt; 0,05). De las tres secuencias de hTERT siRNA ensayados, hTERT-2985 fue identificado como el más potente y por lo tanto se utilizó para construir un plásmido de expresión eucariota hTERT-shRNA para su posterior in vitro e in vivo.
Expresión de hTERT-shRNA en las células SW480 regula a la baja la expresión de ARNm y proteínas
transfectaron células SW480 con hTERT-shRNA o NC-shRNA durante 24, 48 y 72 h, después se midió la expresión de hTERT mRNA y proteína. A las 48 h de la transfección, los cultivos de control mostraron niveles de mRNA similares: medio de cultivo solo (espacio en blanco), 0,530 ± 0,032; Lipofectamine solo (Lipo), 0,483 ± 0,075; NC-shRNA, 0,447 ± 0,058. Los niveles de mRNA fueron significativamente menores después de 48 h de la transfección con hTERT-shRNA (0,322 ± 0,030;
P
& lt; 0,05 o
P
& lt; 0.01; Fig. 2A). De hecho, la reducción de hTERT mRNA era ya observable después de 24 h de la transfección. Sin embargo, no se encontraron diferencias en la expresión de ARNm de hTERT entre los grupos después de 72 h de transfección (Fig. 2A).
(A) Análisis de RT-PCR de la expresión de ARNm de hTERT en cultivos SW480 después de la maqueta de la transfección con la cultura medio solo (espacio en blanco), Lipofectamine solo (Lipo), ARNsi de control negativo (NC-shRNA), o hTERT-shRNA. Los niveles de los niveles de mRNA fueron significativamente más bajos después de 48 h de la transfección con hTERT-shRNA que después de transfecciones de control.
▴
P Hotel & lt; 0,05,
#
P Hotel & lt; 0,01, comparado con el espacio en blanco; *
P Hotel & lt; 0,05, comparado con Lipo y NC-shRNA. (B) La inmunocitoquímica de expresión de la proteína hTERT. (A) Las celdas en blanco, (b) células Lipo, (c) células NC-shRNA, y (d) de las células hTERT-shRNA. Todos los puntos de vista, × 400. valor de escala de grises más alto indica el nivel de proteína inferior. Los niveles de proteína fueron significativamente más bajos después de 48 h de la transfección con hTERT-shRNA que después de transfecciones de control.
#
P Hotel & lt; 0,01, en comparación con los otros grupos; *
P
& lt; 0,05, en comparación con el blanco. (C) hTERT baja regulación inhibe la actividad de la telomerasa. Actividad de la telomerasa [absorbancia ajustado (450 nm-630 nm)] fue significativamente menor en las células transfectadas con hTERT-shRNA que en las células de control. *
P
& lt; 0,05, en comparación con la Lipo y controles en blanco. Los resultados son la media ± SD de tres experimentos independientes.
Se obtuvieron resultados similares cuando se analizó la expresión de proteínas hTERT. Mientras que las tres transfecciones de control dieron lugar a una fuerte tinción de membrana nuclear amarillo con partículas marrones abundantes en los núcleos, la transfección con hTERT-shRNA llevado a tinción mucho más débil (Fig. 2B, a-d). La cuantificación de las intensidades en escala de grises, que variaban inversamente con el nivel de proteína hTERT, mostró que 48-h de la transfección con hTERT-shRNA condujo a niveles mucho más bajos de proteínas (209.600 ± 17.101) que la transfección con medio de cultivo solo (146.500 ± 22.325), Lipofectamine solo (151.800 ± 24.478) o NC-shRNA (167.350 ± 37.754) (
P Hotel & lt; 0,01; Fig. 2B). Después de 72 h de transfección, aunque persistía una diferencia significativa entre hTERT-shRNA y el control en blanco (239.500 ± 9.546 frente a 223.950 ± 10.259,
P Hotel & lt; 0,05; Fig. 2B), no hubo diferencia significativa entre hTERT-shRNA y NC-shRNA. Estos resultados probablemente reflejan el hecho de que nuestro vector de expresión está destinado para estudios de expresión a corto plazo, ya que no se integra en el genoma del huésped. Por lo tanto se realizó todo adicionalmente en experimentos in vitro a 48 h.
hTERT baja regulación inhibe la actividad de la telomerasa en las células SW480
Se observaron niveles similares de actividad de la telomerasa en las células SW480 transfectadas de 48-h con medio de cultivo solo (2,756 ± 0,089), Lipofectamine solo (2.693 ± 0.225) o NC-shRNA (2,691 ± 0,119). En contraste, 48-h de la transfección con hTERT-shRNA llevó a la actividad telomerasa significativamente menor (2.242 ± 0.284;
P & lt; 0,05
; Fig. 2C).
hTERT baja regulación reduce el crecimiento y proliferación de células SW480
La proporción de células en fase G0 /G1 fue significativamente mayor después de 48 h de la transfección con hTERT-shRNA (49,37 ± 1,63%) que después de la transfección con medio de cultivo solo (42,27 ± 2,76%) , Lipofectamine solo (42,43 ± 4,67%) o NC-shRNA (37,07 ± 1,53%, P & lt; 0,05). Al mismo tiempo, el índice de proliferación fue mucho menor después de la transfección con hTERT-shRNA (50,6 ± 1,57%) que después de la transfección con NC-shRNA (59,03 ± 5,86%, P & lt; 0,05); el índice fue similar para los tres grupos de control (Fig. 3A).
(A) hTERT-shRNA reduce el crecimiento y la proliferación de las células SW480. La proporción de células en fase /G1 G0 fue significativamente mayor y el índice de proliferación fue mucho menor después de la transfección con hTERT-shRNA que después de transfecciones de control. *
P
& lt; 0,05, en comparación con los otros tres grupos;
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P Hotel & lt; 0,05, en comparación con NC-shRNA. (B) hTERT-shRNA aumenta la apoptosis de las células SW480. Las células fueron transfectadas con (a) hTERT-shRNA o (b) NC-shRNA, se tiñeron con diaminobencidina (marrón) y contra el teñidas con hematoxilina (azul) para etiquetar los núcleos. Las imágenes son resultados representativos de tres experimentos independientes. Ampliación, × 400. El índice apoptótico (AI) fue significativamente mayor en las células transfectadas con hTERT-shRNA.
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& lt; 0,01, en comparación con los otros tres grupos. (C) La transmisión de Microscopía Electrónica de análisis de las células SW480 transfectadas con (a-c) hTERT-shRNA o (d) NC-shRNA. morfología apoptótica era visible en células transfectadas con hTERT-shRNA. Ampliación, × 3800. (D) de Rodamina 123 análisis de intensidad de fluorescencia de las células SW480 transfectadas con (a) medio de cultivo solo (blanco), (b) Lipofectamine solo (Lipo), (c) NC-shRNA o (d) hTERT-shRNA. Las células teñidas se analizaron por microscopía confocal de barrido; la intensidad de fluorescencia más alto indica el potencial de membrana mitocondrial inferior. Ampliación, × 400. Las células transfectadas con hTERT-shRNA mostraron significativamente mayor rodamina 123 de fluorescencia de células de control lo hizo. *
P Hotel & lt; 0,05, en comparación con NC-shRNA o Lipo;
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P Hotel & lt; 0,01, comparado con el espacio en blanco. Los resultados son la media ± SD de tres experimentos independientes.
hTERT baja regulación aumenta la apoptosis de las células SW480
En contraste con las células control transfectadas, células transfectadas con hTERT-shRNA fueron encogido en apariencia; mostraron tinción de profundidad de color marrón en la membrana celular, citoplasma o núcleo; y ocasionalmente contenían cuerpos apoptóticos (Fig. 3B, a-b). TUNEL tinción mostró que la proporción de células apoptóticas era mucho mayor después de la transfección con hTERT-shRNA [índice de apoptosis (AI) = 22,2 ± 4,25%] que después de la transfección con medio de cultivo solo (1,98 ± 1,05%), Lipofectamine solo (2,2 ± 1,20 %) o NC-shRNA (2,4 ± 1,25%; todos los
P Hotel & lt; 0,01; Fig. 3B). análisis TEM también reveló que una gran proporción de las células transfectadas con hTERT-shRNA tenía morfología apoptótica, incluyendo volumen reducido, reducción del número de salientes y microvellosidades, y la acumulación de la cromatina irregular debajo de la membrana nuclear (Fig. 3C, a). Algunos núcleos de las células estaban en forma de medialuna, circular o grueso, y muchas células contenían numerosas vacuolas (Fig. 3C, b-c). En contraste, las células de control transfectadas mostraron estructura interna normal (Fig. 3C, d).
Como medida adicional de la apoptosis, se utilizó rodamina 123 como un índice de MMP (Fig. 3D, a-d) ; En este ensayo, una mayor intensidad colorante indica menor MMP, que se asocia con la apoptosis. Las células transfectadas con hTERT-shRNA mostraron significativamente mayor rodamina 123 de fluorescencia (719.998 ± 17.083) que los de células transfectadas con medio de cultivo solo (545.833 ± 6.811,
P
& lt; 0,01), NC-shRNA (585.361 ± 51.781,
P
& lt; 0,05) o Lipofectamine solo (632.169 ± 65.635,
P
& lt;.. 0,05) (Fig 3D)
hTERT-shRNA inhibe el crecimiento de células tumorales
in vivo
Un modelo de tumor de xenoinjerto se estableció mediante la inyección de ratones desnudos con células SW480 y luego inyectar los tumores resultantes con NC-shRNA o hTERT-shRNA. La medición periódica del tamaño del tumor mostró que a 31 días, los tumores tratados con hTERT-shRNA (0.248 ± 0.102 cm
3) fueron significativamente más pequeños que los tumores tratados con solución salina (0,543 ± 0,230 cm
3,
P
& lt; 0,05) o NC-shRNA (0,580 ± 0,293 cm
3
P Hotel & lt; 0,01;. La Fig. 4A)
(A) hTERT-shRNA inhibe tumores crecimiento celular. El crecimiento del tumor a los 31 días fue significativamente más lento en los tumores tratados con hTERT-shRNA que en los tumores tratados con solución salina (*
P Hotel & lt; 0,05) o NC-shRNA (
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& lt; 0,01). (B) El examen histopatológico de tejido tumoral SW480 injertado en ratones desnudos y tratados con hTERT-shRNA. El tejido tumoral se realizó una biopsia a los 31 días y se tiñeron con hematoxilina-eosina. La flecha en (a) indica necrosis hoja; la flecha en (b) indica la inversión de la nucleoplasma a volumen citoplasma, junto con la patología mitótico. Ampliación, × 200. análisis (C) RT-PCR para medir la expresión de hTERT mRNA en el tejido tumoral tratados con solución salina (carriles 1-8), NC-shRNA (carriles 9-16), o hTERT-shRNA (carriles 17-24). M, escalera de ADN de 100 pb. La expresión relativa de ARNm de hTERT fue significativamente menor en los ratones hTERT-shRNA. *
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& lt; 0,05, en comparación con la solución salina y los grupos NC-shRNA. (D) La inmunocitoquímica de la proteína hTERT (manchado marrón) en el tejido tumoral tratado con (a) solución salina, (b) NC-shRNA, o (c) hTERT-shRNA. Ampliación, × 200. valores en escala de grises más altos indican los niveles de proteína más bajas. La expresión relativa de proteína hTERT fue significativamente menor en los ratones hTERT-shRNA.#P & lt; 0,01, en comparación con la solución salina y los grupos NC-shRNA. (E) Efecto de hTERT-shRNA sobre la actividad de la telomerasa in vivo. La absorbancia ajustado (450 nm - 630 nm) fue significativamente menor en los tumores tratados con hTERT-shRNA que en los tumores tratados con solución salina (*
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& lt; 0,05) o NC-shRNA (
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& lt; 0,01). (F) Efectos de hTERT-shRNA sobre la apoptosis. Los tumores se inyectan regularmente con (a) solución salina, (b) NC-shRNA o (c) hTERT-shRNA, a continuación, una biopsia y se tiñeron con diaminobenzidina (marrón); Los núcleos fueron contra el teñidas con hematoxilina (azul). Las imágenes son resultados representativos de tres experimentos independientes. Ampliación, × 200. El índice apoptótico (AI) fue significativamente mayor en los tumores tratados con hTERT-shRNA que en los tumores tratados con solución salina o NC-shRNA.
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. & Lt; 0,01, en comparación con los dos grupos de control
hTERT-shRNA inhibe la expresión de hTERT y la actividad de la telomerasa
in vivo
Después de 31 días de tratamiento con solución salina, NC-shRNA o hTERT-shRNA, la expresión relativa de mRNA hTERT fue significativamente menor en los ratones hTERT-shRNA (0,388 ± 0,093) que en la solución salina (0,809 ± 0,335) o