Extracto
Antecedentes
Los receptores tipo Toll (TLRs) son factores clave en el sistema inmune innato y iniciar la respuesta inflamatoria frente a patógenos extranjeros tales como bacterias, hongos y virus. En el microambiente de la tumorigénesis, TLRs puede promover la inflamación y la supervivencia celular. Toll-like receptor 2/6 (TLR2 /6) de señalización en las células tumorales es considerado como uno de los mecanismos de la inflamación crónica, pero también puede mediar en las células tumorales de escape inmune y la progresión tumoral. Sin embargo, la expresión de TLR2 y su función biológica en el desarrollo y progresión de hepatocarcinoma no han sido investigados. Este estudio tuvo como objetivo determinar la expresión de TLRs 1-10 en la línea celular de carcinoma hepatocelular humano establecido BLE-7402, para investigar el efecto biológico de TLR2 en el crecimiento celular y la supervivencia.
Métodos
expresión de TLR en las células BLE-7402 fue ensayada por RT-PCR, PCR en tiempo real y citometría de flujo (FCM). Para investigar más la función de TLR2 en el crecimiento hepatocarcinoma, las células BLE-7402 fueron transfectadas con plásmidos recombinantes que expresan una de las tres formas de TLR2 siRNA (sh-TLR2 RNAi (A, B y C)). TLR2 desmontables se confirmó mediante RT-PCR, PCR en tiempo real y la microscopia de fluorescencia. la proliferación celular tumoral se controló mediante ensayo de MTT y las citocinas en el sobrenadante de las células transfectadas secretado se midieron por FCM basado en perlas, la función de TLR2 siRNA También se investigó in vivo.
Resultados
The línea celular BLE-7402 expresó TLR 2 a 10, tanto en los niveles de proteína y ARNm. TLR2 era el TLR más altamente expresado. Mientras que todos los tres siRNAs inhibieron TLR2 ARNm y la expresión de la proteína, sh-TLR2 RNAi (B) tuvo el efecto más fuerte caída. TLR2 caída con sh-TLR2 RNAi (B) redujo la proliferación celular. Además, también se redujo la secreción de IL-6 y IL-8. El resultado mostró una reducción drástica en el volumen tumoral en ratones tratados con sh-TLR2 RNAi (B).
Discusión
Estos resultados sugieren que la proliferación TLR2 inhibición de derribo de las células cultivadas de hepatocarcinoma y disminuir la secreción de citoquinas. Se sugiere que TLR2 silenciamiento pueden investigaciones adicionales por un valor para la terapia génica basada siRNA en el tratamiento de hepatocarcinoma
Visto: Huang. Y, B Cai, Xu M, Qiu Z, Y Tao, Zhang Y, et al. (2012) el silenciamiento de genes de Toll-Like Receptor 2 inhibe la proliferación de células de cáncer de hígado humano y la secreción de citoquinas inflamatorias. PLoS ONE 7 (7): e38890. doi: 10.1371 /journal.pone.0038890
Editor: Pan-Chyr Yang, el Hospital de la Universidad Nacional de Taiwán, Taiwán
Recibido: 4 Enero, 2012; Aceptado: 14 de mayo de 2012; Publicado: July 16, 2012
Derechos de Autor © 2012 Huang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de la Fundación de Jiangsu Provincial de Ciencias Naturales (BK2011175). YZH es apoyado por Jiangsu Provincial Fundación de Ciencias Naturales (BK2011164), Programa de Investigación de la Salud de la provincia de Jiangsu (X200736, X201110). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma hepatocelular o cáncer de hígado se considera que es un cáncer primario que se origina a partir de células del hígado; es una de las formas de cáncer más devastador, especialmente en China. Actualmente, carente de plomo tratamiento eficaz para la búsqueda novedosa estrategia de tratamiento, tales como terapias génicas. ARN corto de interferencia, siRNA puede ser ofrecido como una terapia novedosa vez que se encuentra un buen objetivo. Se ha sugerido recientemente TLR se expresan en muchos tumores humanos [1], España
Los receptores tipo Toll (TLRs) son una familia altamente conservada de transmembrana de tipo I receptores que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos específicos (PAMPs), p.ej lipopolisacárido, ácido lipotecoico y otros componentes de la pared bacteriana [1], [2], y puede también mediar de células tumorales de escape inmune y la progresión tumoral. TLRs humanos tienen un dominio citoplásmico que es homólogo con el dominio citoplasmático de la interleucina humana (IL) -1 receptor [3]. Hasta la fecha, se han identificado 11 TLR de mamíferos y caracterizado.
Recientemente, una nueva investigación ha revelado que los TLR se expresan por muchos tumores humanos [2], [3], [4], [5], [6 ], incluyendo el cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de mama y carcinoma hepatocelular. Aunque los TLRs tienen diferentes funciones en diferentes células tumorales, algunos resultados han indicado que la señalización de TLR puede desempeñar un papel en el crecimiento y progresión tumoral. Por ejemplo, la señalización de TLR2 puede promover el crecimiento de células de cáncer de pulmón y la resistencia a la apoptosis [7], [8]; TLR3 señalización dependiente puede conducir directamente a la apoptosis en el cáncer de mama humano [6]; a través de sus acciones sobre las metaloproteasas y las integrinas, TLR2 y TLR9 pueden conducir a una mayor capacidad de invasión y metástasis [8], [9]; TLR4 puede mediar la metástasis que avanza activamente invasión de células tumorales, la proliferación y supervivencia de células de cáncer de próstata [10].
Toll-like receptor 2/6 (TLR2 /6) de señalización en las células tumorales es de particular interés ya se considera como uno de los mecanismos de la inflamación crónica, pero también puede mediar en las células tumorales de escape inmune y la progresión tumoral. Además, TLR2 actuar como un mecanismo antiviral potencial en las líneas celulares de hepatocitos hepatitis B infectados [11].
TLRs se expresan en una amplia variedad de células tumorales y se sospecha que juegan un papel importante en la iniciación y progresión de la cáncer, sin embargo, la expresión de los TLR en células de hepatocarcinoma no se ha examinado de manera sistemática y se sabe poco acerca de la interacción de TLR con la progresión de la enfermedad. En este estudio, que tuvo como objetivo determinar la expresión de TLRs 1-10 en la línea celular de carcinoma hepatocelular humano establecido BLE-7402. Estamos, además, tuvo como objetivo investigar el efecto biológico de TLR2 en el crecimiento celular y la supervivencia, y para evaluar su potencial en el campo de la terapia del cáncer.
Materiales y Métodos
Todos los experimentos cumplieron con las leyes actuales de china.
línea celular
la línea celular de carcinoma hepatocelular humano BEL-7402 se adquirió en el banco de células de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china). BEL-7402 se hizo crecer sin antibióticos en 5% de CO
2 a 37 ° C en medio RPMI-1640 (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA) que contiene 10% de FBS.
Construcción de los plásmidos que expresan ARNsi
Tres oligonucleótidos pequeños de interferencia (a: 5'-aactatccactggtgaaacaa-3 ', B: 5'-aaacttgtcagtggccagaaa-3', C: 5'-aaagtcttgattgattggcca-3 ') fueron diseñados basándose en las secuencias de TLR 1 humana -10 (Tabla 1) y sintetizada. vectores plasmídicos RNAi (Figura S1) que expresan siRNAs para TLR2 bajo el control de un promotor de CMV humano, se generaron mediante la inserción de pares de los oligonucleótidos de ADN hibridados específicos para TLR2 en los sitios HindIII y BamHI secuencialmente en el plásmido pGenesil-1 (shTLR2, Mesa 2). Un vector revueltos-pGenesil-1 se utilizó como control.
cualitativa se utilizó RT-PCR
TRIzol reactivo (Invitrogen) para aislar el ARN total de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una parte alícuota de 4 g de ARN total se mezcló con un cebador oligo-dT y mieloblastosis virus (MLV) de la transcriptasa inversa (Promega, Madison, WI). cebadores de PCR para TLR 1-10, junto con GAPDH como control, se han diseñado como se muestra en la Tabla 1. Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 95 ° C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de 95 ° C durante 1 min, 55 ° C durante 1 min, y 72 ° C durante 1 min. La extensión final fue a 72 ° C durante 10 min. Los productos de PCR se analizaron en 1,5% (vol peso /) geles de agarosa que contienen 0. 5 g /ml de bromuro de etidio y se visualizaron bajo luz UV. Se analizó la densidad de la banda y se cuantificó usando el software ImageQuant (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
-PCR en tiempo real
La mezcla de reacción contenía 45 l DEPC-H
2O, 1,0 l cDNA a una dilución 1:100, 2,0 l (10 mM) de cada cebador y polvo liofilizado según las instrucciones del manfacturer de la premezcla AccuPower Greenstar® qPCR. El procedimiento para la PCR fue el siguiente: 95 ° C durante 5 min, seguido de 40 ciclos de 94 ° C durante 30 segundos, 55 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 30 seg. Se midió la fluorescencia después de cada etapa de extensión de 72 ° C durante 30 seg (Eppendorf, Alemania). Al final de la reacción, se analizó la curva de fusión de cada muestra. El software de análisis bioneer Exicycler ™ (Bioneer Corp., Daejeon, Corea) se utilizó para obtener el
valores t C. expresión relativa de los genes diana se determinó por el
2 -ΔΔ método de TC [12].
citometría de flujo Detección de TLR expresión de la proteína
Una suspensión de 2 × 10
6 células BEL-7402 cultivadas se preparó y se permeabilizaron para detectar la expresión de proteínas TLR. se recogieron y se lavaron dos veces con 1 x PBS las células, se tiñeron a continuación con 5 l purificadas de anticuerpos anti-TLR2 humano (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) a 4 ° C durante 1 h protegida de la luz. Después de lavar dos veces con 1 x PBS, las células se recogieron por centrifugación a baja velocidad (1500 g, 10 min) y se incubaron con 2 cabra l conjugado con PE anti-conejo IgG mAb (Santa Cruz Biotechnology) a 4 ° C durante 30 min en la oscuridad, seguido por dos lavados con 1 x PBS. Por último, se suspendieron las células teñidas en 500 l de 1 × PBS, y se analizaron mediante citometría de flujo (citómetro; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) usando el software CellQuest BD. El control negativo se procesó de la misma manera pero sin el anticuerpo anti-TLR2.
RNA interferencia en el ensayo
Las células fueron transfectadas con el plásmido que expresa GFP pGsil-1 (Genesil, Wuhan, China ) con adición de siRNA dirigidos contra TLR2, como se muestra en la Tabla 2. se sembraron las células transfectadas a 2 × 10
5 células /pocillo en placas de 6 pocillos y se cultivaron durante la noche hasta que alcanzaron 70% de confluencia. Las transfecciones se realizaron utilizando Lipofectamine ™ 2000 reactivo (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Cuatro g de ADN plásmido (sh-TLR2 RNAi (A), sh-TLR2 RNAi (B), sh-TLR2 RNAi (C), vector pGenesil-1 y revueltos siRNA) se utilizaron para la transfección en células respectivamente (SunShineclean ™ sin- endotoxina plásmido Mini Kit de Extracción, SunShineBio, china). Se incubaron las células transfectadas durante 72 h, se observó entonces de fluorescencia utilizando un microscopio de fluorescencia. En este momento, también se recogieron las células para el ensayo FCM e inmunofluorescencia.
Análisis de inmunofluorescencia
células BEL-7402 fueron transfectadas con plásmidos diferentes siRNA y cultivadas durante la noche, luego se fija con alcohol de 30 min y bloqueado en 1 × PBS (pH 7,4) solución con 3% de BSA. Se añadió el anticuerpo anti-TLR2 (sc-166 900, Santa Cruz Biotechnology) a una dilución 1:200 y se incubó durante la noche a 4 ° C en una caja humidificada. Después del lavado, se añadió el anticuerpo fluorescente secundario (sc-22766, Santa Cruz Biotechnology) a una dilución 1:100 y se incubó durante 2 h. Las células se lavaron a continuación tres veces con 1 x PBS, y el contador se tiñeron con DAPI-. La microscopía confocal de fluorescencia se realizó y se analizó utilizando un microscopio de fluorescencia (Leica DMI4000B, Buffalo Grove, IL).
Ensayo de proliferación celular
El ensayo de MTT (Sigma, St. Louis, MO) fue utilizado para evaluar la proliferación celular después de la transfección. Las células se cultivaron en placas de células de 96 pocillos (1 x 10
4 /pocillo, 5 pocillos por condición) durante la noche, y transfecciones celulares se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 48 h, una muestra de las células transfectadas se recogió como la muestra 0 h, mientras que las otras células continuaron en cultivo durante 24 h, 48 h, y 72 h. Al final de cada período de tratamiento, se añadió MTT al medio de cultivo en cada pocillo a una concentración de 5 mg /ml (Sigma Chemical Co., St Louis, MO), y después se incubaron durante 4 horas a 37 ° C. Después se retiró el sobrenadante y las células se mezclaron con 100 l de sulfóxido /pocillo de dimetilo. La absorción se midió utilizando un espectrofotómetro de microplacas automático (340st; Anthos Zenyth, Salzburgo, Austria) a 490 nm
inflamatoria de citoquinas humana Ensayo
El sobrenadante se recogió de las células transfectadas.. IL-6 y IL-8 niveles se detectaron usando el kit de citoquina inflamatoria humana (BD ™ citométricos de bolas Array) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Experimento de modelo de ratón in vivo
macho atímicos desnudos ratones (Balb /c -nu /nu; 5-7 semanas de edad) se dividieron en cinco grupos de tratamiento con diez ratones por grupo de tratamiento. Manejo de animales y los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Experimentación Animal de la Universidad de Medicina de Nanjing. Una suspensión de células BEL-7402 (1 × 10
7) en 500 l de PBS se inyectó en subcutánea de abodomen. Esta concentración de células fue necesario para lograr un crecimiento constante del tumor local dentro de los 10 días de la implantación. En los días 10 y 15 después de la implantación, los tumores se inyectaron respectivamente con ADN de plásmido (sh-TLR2 RNAi (A), sh-TLR2 RNAi (B), sh-TLR2 RNAi (C), vector pGenesil-1 y revueltos siRNA) , con 150 g cada vez. La escala del tumor se determinó mediante inspección visual y medido por pie de rey 15 d después de la segunda inyección.
Análisis estadístico
Los datos mostrados son de por lo menos tres experimentos separados y se representan como las medias ± desviación estándar (SD). Estudiante de
t-test y ANOVA
fueron utilizados para determinar la significación, y las diferencias se consideraron significativas a un
valor de P Red de menos de 0,05.
Resultados
la expresión de los TLR en la línea celular BEL-7402
análisis RT-PCR semi-cuantitativa reveló que el ARNm de los TLR (TLR 2-10) se expresa en las células BEL-7402 (Figura 1 a), mientras que TLR1, 7 expresión mRNA fue apenas detectable. Un análisis más detallado por PCR en tiempo real mostró que TLR7 se expresa en el nivel más bajo. Por lo tanto, se optó por referirse todos los demás niveles de mRNA TLR en relación con el nivel de ARNm de TLR7. TLR2 y TLR4 mostraron los más altos niveles de expresión, lo que puede indicar que tienen alguna función en BEL-7402 el crecimiento celular y la progresión (Figura 1B).
semicuantitativa resultado de RT-PCR de TLRs en BEL-7402. GAPDH mRNA se utilizó como control (A). Real-time RT-PCR de TLRs en BEL-7402. La expresión de TLR7 se normalizó a 1,0 como su nivel era más bajo entre todos los TLR (B). TLR niveles de expresión de proteínas en BEL-7402 por citometría de flujo (C). Todos los resultados son representativos de tres experimentos separados.
proteínas TLR niveles de expresión se determinaron por citometría de flujo (FCM). TLR2 se expresó en niveles más altos de TLR1-10, los otros TLRs fueron expresados en niveles moderados o débilmente expresadas (Figura 1C). En conjunto, nuestros resultados demuestran que las células BEL-7402 en cultivo expresan TLR2-TLR10, con TLR2 siendo el más altamente expresado. Este resultado nos animó a investigar más a fondo la función de TLR2 en el crecimiento y la progresión de las células BEL-7402.
Derribo eficiente de TLR2 expresión en la línea celular BEL-7402 por tres siRNAs
Para investigar más a fondo la función potencial de TLR2 en hepatocarcinoma, utilizamos pequeños ARN de horquilla para derribar la expresión del gen endógeno TLR2 [Identificación de genes: 10333]. Los vectores plásmidos se construyeron para expresar tres diferentes siRNAs, SH-TLR2 RNAi (A), sh-TLR2 RNAi (B), sh-TLR2 RNAi (C). Los tres vectores de siRNA experimentales fueron transfectadas en células BEL-7402, respectivamente, con el vector de siRNA revueltos y el vector vacío como control. Después de 48 h, el promedio de eficiencia de transfección fue alrededor del 70% según las estimaciones de las células positivas de fluorescencia verde bajo el microscopio de fluorescencia. Los tres siRNAs experimentales reducen efectivamente la expresión de TLR2 ARNm en las células transfectadas (Figura 2I). los niveles de TLR2 mRNA fueron 29,85% ± 9.2%, 50,75 ± 6,7% y 31,34 ± 8,3% del control de vector vacío con sh-TLR2 RNAi (A), sh-TLR2 RNAi (B) y SH-TLR2 RNAi (C), respectivamente, una disminución estadísticamente significativa en la expresión en comparación con las células de control de vector vacío (
P
& lt; 0,05) (Figura 2II). No estadísticamente significativa disminución en la expresión se observó en las células transfectadas con el ARNsi revueltos (
P & gt; 0,05
). expresión de la proteína TLR2 se redujo en los tres siRNAs con niveles de 33,0% ± 3,0% (sh-TLR2 RNAi (A)), 57,9% ± 4,7% (sh-TLR2 RNAi (B)) y 43,7% ± 4,5% (SH- TLR2 RNAi (C)) del control de vector vacío (Figura 2iii). No hay diferencia significativa en la expresión de la proteína TLR2 se observó en el control de siRNA revueltos (
P & gt; 0,05
). Estos datos indican que sh-TLR2 RNAi (B) es el plásmido recombinante más eficiente en el silenciamiento de TLR2. Por lo tanto, hemos seleccionado para usar sólo sh-TLR2 RNAi (B) en la experimentación adicional.
I, RT-PCR a partir de TLR2 pGenesil-1 vector, ScrambledsiRNA, sh-TLR2 RNAi (A, B, C) transfectadas BEL-7402. II, la expresión de TLR2 a nivel de mRNA en pGenesil-1 vector, ScrambledsiRNA, y sh-TLR2 RNAi (A, B, C) transfectadas BEL-7402 con PCR en tiempo real. III, citometría de flujo análisis de la expresión de TLR2, estudiante de
t-test
y ANOVA se utilizó para determinar la significación.
TLR2 expresión de la proteína en las células BEL-7402 se ensayó adicionalmente mediante inmunotinción con un anticuerpo anti-TLR2 y se visualizaron bajo un microscopio de fluorescencia. La tinción positiva se redujo drásticamente por sh-TLR2 RNAi (B) en comparación con el control de vector vacío (Fig. 3iV). No se observaron diferencias significativas en los niveles de tinción de control de siRNA revueltos en comparación con el control de vector vacío (Fig. 3iV).
I, MTT análisis de la tasa de proliferación de pGenesil-1 vector, ScrambledsiRNA y SH-TLR2 RNAi (B) células transfectadas. II y III, IL-6 y IL-8 presencia en el sobrenadante secretada por pGenesil-1 vector, revueltos siRNA y sh-TLR2 RNAi (B) células transfectadas. se recogió el sobrenadante celular y se analizó usando citometría de flujo. Todos los resultados son representativos de tres experimentos separados, estudiante de
t-test
y ANOVA se utilizó para determinar la significación. IV, el análisis de inmunofluorescencia de siRNA específico del gen de expresión de la proteína TLR2 en pGenesil-1 vector (i), revueltos siRNA (ii) y sh-TLR2 RNAi (B) (iii) las células transfectadas. tinción nuclear realizó utilizando DAPI (azul) (200 ×). TLR2 silenciamiento suprime el crecimiento tumoral en un modelo de ratón. se demostró Comparación del volumen de los tumores de cada grupo de tratamiento. El tratamiento con BEL-7402 celular (VI_i), sh-TLR2 RNAi (B) ADN constructiva se inyectó en el grupo del tumor (VI_ii), diferencias significativas de los grupos de control (V.▪, VI_iii) fueron representados por asteriscos (
P
. & lt; 0,05) guía empresas
por lo tanto, hemos demostrado caída siRNA-dirigida del gen TLR2 en la línea celular de carcinoma hepatocelular humano BEL-7402, y han demostrado que sh-TLR2 RNAi (B ) fue el plásmido recombinante más eficiente en el silenciamiento de TLR2.
la proliferación de la línea celular transfectada BEL-7402 Siguiendo TLR2 genes knock abajo
se utilizó el ensayo MTT para determinar los efectos de sh-TLR2 RNAi (B) mediada por TLR2 silenciamiento sobre la proliferación celular. Las células se cultivaron durante 0 h, 24 h, 48 h, y 72 h después de 48 h de la transfección. El porcentaje de células viables se redujo en presencia de TLR2 siRNA por ~ 50% de media en comparación con las células sin ningún tratamiento. La capacidad proliferativa de las células BEL-7402 se redujo por RNAi (B) Transfección-TLR2 sh (Figura 3I). No se observó ninguna diferencia significativa en las células transfectadas con el control de siRNA (
P & gt; 0,05
).
El descenso de regulación de TLR2 por siRNA Bloques su señalización corriente abajo en células BEL-7402
Los cambios biológicos causados por la baja regulación de TLR2 pueden deberse a la alteración de la señalización mediada por TLR2 aguas abajo que conduce a cambios en las funciones siguientes.
TLR2 puede desempeñar un papel en la señalización de TLR2 /MyD88 y funciones aguas abajo posteriores [17], y suponemos que la secreción de citocinas es un resultado de la señalización de TLR2. Por lo tanto, hemos diseñado un protocolo para examinar el nivel de citoquinas inflamatorias en células BEL-7402 TLR2 siguientes genes desmontables. células BEL-7402 fueron transfectadas con TLR2 sh-RNAi (B). Después de 72 h sobrenadante se retiró y los niveles de IL-6 y IL-8 determinados por ensayo de citometría de bolas. IL-8 niveles de IL-6 y se encontró que ser notablemente deprimido. IL-6 se redujo en un 50,2 ± 2,6% y la IL-8 por 49,7 ± 3,5% en comparación con los controles de vector vacío (
P Hotel & lt; 0,05); No se observaron diferencias significativas en los controles siRNA-transfectadas (Figura 3II y la Figura 3iii).
TLR2 genes de siRNA inhibe la tumorigénesis en ratones desnudos
Por haber establecido los efectos significativos de TLR2 desmontables de RNAi en BEL-7402 células
in vitro
, nos preguntamos si TLR2 ARNi también suprimir la tumorigenicidad de tumores BEL-7402 en ratones desnudos. En los días 7 y 14 después de la implantación, los tumores fueron inyectados con el plásmido de ADN que expresa TLR2 siRNA. La morfología macroscópica de los tumores primarios fueron examinados. Los tumores se midieron y se observó una reducción drástica en el volumen tumoral en ratones tratados con sh-TLR2 RNAi (B) (Figura 3 V-VI ii).
Discusión
Los receptores tipo Toll (TLR ) son una familia conservada de los receptores que detectan la presencia de agentes patógenos por PAMP que reconocen [13], [14]. Además, también están involucrados en la regulación de la inflamación [15], un papel que ha sido sugerido para ser al menos parcialmente dependiente de la capacidad de TLRs reconocer varios ligandos endógenos TLR conocidos como patrones moleculares asociados a daños (apaga). Recientemente, se ha informado de muchos estudios sobre TLRs y su papel potencial en la investigación y la terapia del cáncer. Yang et al [16] investigó la posible función de TLR2 señalización sobre la metástasis tumoral en un modelo de ratón de inyectado por vía intravenosa células de melanoma B16. El resultado demuestra que TLR2 es un objetivo atractivo contra la metástasis, el anticuerpo anti-TLR2 podría utilizarse para Combate la vida en peligro metastasis.Thompson et al [11] mostró que las líneas celulares de hepatoma expresan receptores TLR2 funcionales, que, cuando se estimula, inician una cascada de señalización que inhibe el virus de la hepatitis B. Xu et al [17] detectaron células mononucleares de sangre periférica de pacientes infectados por VHB mostraron disminución de los niveles de expresión de TLR7 y TLR9 mRNA, pero un aumento en la expresión de TLR9 a nivel de proteínas.
A partir de estos estudios, sabemos que TLR2 , TLR7 y TLR9 desempeñan un papel clave en las enfermedades hepáticas y TLR2 tiene una función potencial en la regulación de la tolerancia del tumor, la progresión del cáncer y la metástasis [13]. Orihara et al [18] han puesto de manifiesto que TLR2 y /o TLR4 en los monocitos circulantes son significativamente hasta reguladas en la infección bacteriana. TLR2 niveles de expresión en monocitos se ha demostrado que proporcionar información crítica en la planificación de tratamiento contra las enfermedades infecciosas bacterianas [18] y las enfermedades filarias [19], cáncer de ovario [20], las enfermedades del hígado [21], y la enfermedad infecciosa bacteriana [22], [ ,,,0],23], [24], [25]. Sin embargo, el crecimiento, la proliferación y la metástasis de carcinoma hepatocelular son procesos complicados y dinámicos. Cada proceso es probable que esté asociado con las acciones (y la interacción) de varios TLRs [26]. A la luz de esto, decidimos explorar la expresión de otros TLRs en el carcinoma hepatocelular e investigar si estos podrían afectar el crecimiento, la progresión y la supervivencia del cáncer de hígado. Nuestros experimentos demuestran que TLR 2-10 se expresan en células BEL-7402, tanto a nivel de mRNA y proteína. Hemos demostrado, por análisis de PCR en tiempo real y citometría de flujo, que TLR2 es la más alta expresión de los TLRs.
Hay pruebas de que muchos tipos diferentes de células en el hígado expresan TLR2 [27]. tales como las células de Kupffer, hepatocitos y células epiteliales biliares. señales mediadas por TLR como resultado de la hepatitis B, la hepatitis C, enfermedad alcohólica del hígado, enfermedades hepáticas no alcohólicas, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, la fibrosis hepática, lesión por isquemia y reperfusión del hígado y el rechazo del aloinjerto [27]. Huang et al. mostró que
Listeria monocytogenes
activan las proteínas quinasas activadas por mitógenos y factor nuclear-kB en las células tumorales a través de la señalización de TLR2, que resulta en el aumento de la producción de óxido nítrico y la interleucina-6 y aumento de la proliferación de las células tumorales [7]. Kim et al. mostró que el carcinoma de pulmón de Lewis (LLC) fue el más potente activador de macrófagos que conduce a la producción de la interleucina-6 y tumor necrosis factor α a través de la activación del receptor Toll-like (TLR) miembros de la familia TLR2 y TLR6 [9] y sus resultados explicaron cómo las células de cáncer avanzado cambian el sistema inmunitario innato de acogida y de este modo generar un microambiente inflamatorio. Huang et al. mostró que el microambiente de los tumores grandes favorece la supervivencia bacteriana, que a su vez acelera directamente el crecimiento del tumor mediante la activación de las células tumorales Toll-like receptor 2 [7].
factores proinflamatorias, tales como el óxido nítrico, la IL-6 y IL- 12 mostraron ser liberado de las células tumorales en estudios anteriores [10]. Tanto la IL-6 y IL-12 son conocidos por ayudar a las células tumorales se resisten a los linfocitos T citotóxicos y las células asesinas naturales, lo que lleva a la evasión de la vigilancia inmune [10]. En nuestro estudio, TLR2 fue seleccionado para explorar la función de TLRs en el crecimiento de las células BEL-7402. Nuestro estudio confirma la importancia de la proliferación tumoral TLR2 mediada, el análisis de citoquinas inflamatorias demostró la producción deprimida de la expresión de TLR2 después de TLR2 caída, y demostró que la capacidad de las células BEL-7402 para resistir el ataque de células inmunes y facilitar la evasión de la vigilancia inmune podría ser disminuido . Esto sugiere que todos los cambios fenotípicos observados en estas células fueron mediados por la supresión de la acción de TLR2.
El modo de ratón de cáncer también se investigó, y se demostró que el volumen de tumor del tratamiento siRNA. Por haber establecido los efectos significativos de TLR2 desmontables de RNAi en las células BEL-7402 in vitro, nos preguntamos si TLR2 ARNi también suprimir la tumorigenicidad de tumores BEL-7402 en ratones desnudos. En los días 10 y 15 después de la implantación, los tumores fueron inyectados con ADN plásmido que expresa sh-TLR2 RNAi. La morfología macroscópica de los tumores primarios fueron examinados. Se observó una reducción drástica en el volumen tumoral en ratones tratados con sh-TLR2 RNAi (B).
Los resultados presentados en este trabajo proporcionan evidencia de que TLR2 caída no sólo in vitro, pero in vivo podría inhibir el crecimiento de hígado tumores. TLR2 mediada por el crecimiento del cáncer parece ser un factor importante en la progresión del tumor. El uso de siRNA sistémicamente entregado TLR2 puede así ofrecer un tratamiento novedoso para la prevención de la progresión del cáncer que conduce a mejores perspectivas de supervivencia.
Apoyo a la Información
Figura S1.
RNAi vectores plasmídicos (pGenesil-1 plásmido).
doi: 10.1371 /journal.pone.0038890.s001 gratis (JPG)
Reconocimientos
Agradecemos al Dr. Liu Dongxu (Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Hubei, Hubei, República Popular de china) para proporcionar apoyo técnico.