Extracto
Antecedentes
Los microARN ( función de miRNAs) como reguladores endógenos de comportamiento biológico de los cánceres humanos. Varios ARNs no codificantes naturales son reportados para inhibir miRNAs mediante interacciones de apareamiento de bases. Estos fenómenos plantean preguntas acerca de la capacidad del dispositivo artificial para regular miRNAs. El propósito de este estudio es crear dispositivos sintéticos que se dirigen a un solo miARN o un grupo miARN y determinar sus efectos terapéuticos sobre los fenotipos de células de cáncer de vejiga.
Metodología /Principales conclusiones
Tandem sitios de unión abombada miARN se insertaron en la región no traducida 3 '(UTR) del gen de la luciferasa de Renilla promotor impulsado SV-40 para la construcción de dos "miARN de céspedes" para la supresión de miR-183-96-182 clúster o miR-210. Un tercer dispositivo con secuencias repetidas en tándem no complementarias a cualquier miARN conocido se generó como un control no directo. En los análisis funcionales, T24 del cáncer de vejiga y células UM-UC-3 se transfectaron con cada uno de los tres dispositivos, seguido de ensayos para la detección de sus impactos. Los ensayos de luciferasa indicaron que las actividades de los reporteros de luciferasa en los miARN de céspedes se redujeron en un 30-50% del control no directo. El uso de PCR cuantitativa en tiempo real, los niveles de expresión de los miRNAs objetivo, se mostró a reducirse 2-3 veces por el correspondiente miARN-cortadora. El crecimiento celular, la apoptosis y la migración se ensayaron mediante el ensayo de MTT, citometría de flujo ensayo, y en el ensayo cero vitro, respectivamente. inhibición del crecimiento celular, aumento de la apoptosis, y la disminución de la motilidad se observaron en las células de cáncer de vejiga miARN de céspedes-transfectadas.
Conclusiones /Importancia
No sólo un único objetivo miARN sino también a todo los miembros de una clúster de destino miARN puede ser bloqueado el uso de esta estrategia de diseño modular. Los efectos anticancerígenos son inducidos por los miARN de céspedes sintéticos en las líneas celulares de cáncer de vejiga. el miR-183/96/182 clúster y miR-210 se muestran a jugar un papel oncogénico en el cáncer de vejiga. Una plataforma de biología sintética potencialmente útil para miARN pérdida de la función de estudio y el tratamiento del cáncer se ha establecido en este trabajo
Visto:. Liu Y, Y Han, Zhang H, Nie L, Jiang Z, Fa P, et al. (2012) sintético miARN de céspedes Orientación Cluster miR-183-96-182 o miR-210 inhibe el crecimiento y la migración e inducir la apoptosis en células de cáncer de vejiga. PLoS ONE 7 (12): e52280. doi: 10.1371 /journal.pone.0052280
Editor: William C. S. Cho, Hospital Queen Elizabeth, Hong Kong
Recibido: 31 Agosto, 2012; Aceptado: 12 Noviembre 2012; Publicado: 17 de diciembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por el Ph.D. Fundación de los programas del Ministerio de Educación de China (20100001110100 al ZC); el programa de promoción de Shenzhen clave de laboratorio, Shenzhen, República Popular de China (CXB201005250016A a ZC). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma de células transicionales de la vejiga es el cáncer del tracto urinario más común en los países del Este y del Oeste [1]. La mayoría de los cánceres de vejiga son tumores de bajo grado no invasivos que puede avanzar hasta el fenotipo invasivo. En contraste con los cánceres de vejiga no invasivos, tumores del músculo invasivo tienden a hacer metástasis a otros órganos y tienen un muy mal pronóstico [2] - [3]. Los tratamientos más comunes para el cáncer de vejiga son la cirugía, la quimioterapia, la inmunoterapia y la terapia de radiación. Sin embargo, están lejos de ser satisfactorios debido a varios factores, entre ellos la falta de eficacia, la falta de especificidad, y lleno de efectos secundarios desagradables [4] - [5]. Así que hay una necesidad cada vez mayor para el desarrollo de nuevas formas de tratar el cáncer. Varias nuevas terapias antineoplásicas están actualmente bajo investigación experimental y clínica, pero no hay grandes avances se han logrado con estas estrategias terapéuticas [6].
Desde hace tiempo se ha propuesto que las células cancerosas se pueden volver a programarse mediante el ensamblaje de ADN diferente o partes de ARN en los dispositivos novedosos para dar lugar a un comportamiento biológico benigno [7] - [8]. La biología sintética terapia con múltiples dispositivos dirigidos a vías genéticas específicas del cáncer prometedor abre nuevas vías para mejorar el tratamiento del cáncer [9]. Sobre la base de un conocimiento detallado de los perfiles genéticos de los cánceres, los biólogos sintéticos tratan de producir dispositivos biológicos predecibles y estables con nuevas funcionalidades de tratamiento que no existen en la naturaleza. Aunque este campo es relativamente nuevo y se encuentra todavía en la fase de pruebas de laboratorio, algunos de los trabajos relacionados ya han mostrado un gran potencial en los tratamientos de diversos tipos de cáncer [10] - [11].
Los microARN (miRNA ), una clase de ARN endógenos cortos, regular la expresión génica mediante la unión a secuencias parcialmente complementarias en el 3'UTR de ARNm [12]. Numerosos estudios han informado de que miRNAs están involucrados en el desarrollo y la progresión de los cánceres humanos, incluyendo el crecimiento, la apoptosis, invasión y metástasis [13] - [14]. En nuestro trabajo anterior determinamos los perfiles de miARN en todo el genoma en el cáncer de vejiga humana mediante secuenciación profunda. miR-183-96-182 clúster y miR-210 se encontró que eran hasta reguladas en el cáncer de vejiga humana, lo que sugiere que pueden desempeñar un papel importante como oncogenes en este tipo de cáncer [15].
Uno de los principales objetivos de nuestra investigación en biología sintética es para conectar dispositivos genéticos sintéticos para el control de un fenotipo de célula tumoral. En este trabajo, presentamos dos dispositivos -la genéticos útiles miR-183-96-182-cluster-cortacésped (MIRM-183/96/182) y el miR-210-cortacésped (MIRM-210), es decir miRNAs con el objetivo secuencias parcialmente complementarias. También hemos investigado sus efectos terapéuticos sobre los fenotipos de células de cáncer de vejiga. Este enfoque proporciona una plataforma de biología sintética potencialmente útil para el estudio y tratamiento del cáncer de miARN pérdida de función.
Resultados
Diseño y construcción de los miARN de céspedes
Inspirado por las observaciones que algunas moléculas de ARN expresadas a partir de
Herpesvirus Saimiri
o los pseudogenes humanos regulan los miRNAs endógenos mediante interacciones de apareamiento de bases en células de mamífero [16] - sitios [18], hemos creado miARN de céspedes que contiene de unión parcialmente complementarios de los miRNAs diana para estudios miRNA pérdida de función en células de cáncer de vejiga humano (Fig. 1). Para formar una interacción más estable con el miARN, hemos diseñado múltiples sitios de unión de miARN de interés con una protuberancia central en las posiciones de escisión de Argonaute 2 [19]. Esta afirmación se basa también en el descubrimiento de que el emparejamiento parcial entre miRNAs y sus secuencias diana es más común en los animales que en las plantas [12]. Los sitios de unión estaban conectados por "enlazadores" (unos pocos nucleótidos) para los fines de mejorar la unión de los complejos miRNA-proteína (miRNPs) a cada sitio de unión posible, y el aumento de la eficiencia miRNA knockdown [20]
.
Hemos construido miARN de céspedes mediante la inserción de múltiples sitios de unión miARN en el 3 'UTR de un gen de luciferasa de Renilla. Cada construcción bajo el control de un promotor de SV-40 terminó con una señal de poliadenilación de SV40. Un promotor impulsado gen que codifica la luciferasa de luciérnaga conocimientos tradicionales no regulada se utilizó como control. Los cuadrados negros representan los engarces entre los sitios de unión.
Hemos hecho 6 copias en tándem vestida de sitios de unión para el clúster de miR-183-96-182 (2 copias para cada miARN del clúster) . El MIRM-183/96/182 a continuación, se construyó mediante la inserción de estos sitios de unión en el 3 'UTR de un promotor impulsado gen indicador de luciferasa SV-40 en el vector siCHECKTM-2 (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Para demostrar la modularidad de los dispositivos, insertamos otros 6 copias en tándem de sitios de unión dispuestos para miR-210 en el 3 'UTR del gen reportero para generar MIRM-210 utilizando el mismo vector. A modo de control no directo, también hemos creado un dispositivo con secuencias repetidas en tándem 6 no complementarias a cualquier miRNAs conocidos. Las secuencias utilizadas en este estudio estaban disponibles en el cuadro S1 y S2 tabla.
Disminución de las actividades de los reporteros de luciferasa en miARN de céspedes pueden contribuir a los sitios de unión miARN
Para probar la eficacia de la miRNA- cortadoras, se sometieron a ensayo la actividad de luciferasa de Renilla en relación con la actividad de la luciferasa de luciérnaga en T24 o células UM-UC-3 48 h después de la transfección con cada dispositivo. Los ensayos de reportero de luciferasa mostraron que las actividades de los reporteros que contienen los sitios de unión de genes miARN abombadas se redujeron en células de cáncer de vejiga, en comparación con el control no directo (P & lt; 0,01 para cada grupo). Las inhibiciones (%) de las expresiones de luciferasa se muestran en la Tabla 1.
Los miARN de céspedes como la supresión efectiva de los niveles de miARN objetivo en líneas celulares de cáncer de vejiga
Para investigar más a fondo la funcionalidad de miARN de céspedes, se examinaron los niveles relativos de expresión de los miRNAs objetivo en el cáncer de vejiga T24 humano dispositivos transfectadas y las células UM-UC-3. Los resultados qPCR demostraron que la expresión de los correspondientes genes miARN-segadora indujo una disminución dramática en los niveles de expresión de los miRNAs objetivo en las dos líneas celulares de cáncer de vejiga (P & lt; 0,05 para cada grupo). Las inhibiciones (%) de expresiones de genes miARN se muestran en la Tabla 2. Los niveles de expresión de miR-96, miR-182 y miR-183 no podían ser suprimidas por MIRM-210. Al mismo tiempo, el nivel de expresión de miR-210 también no podía ser cambiado por MIRM-183/96/182. Los resultados del experimento qPCR se muestran en la Tabla S3.
La inhibición del crecimiento celular inducida por los genes miARN de céspedes en líneas celulares de cáncer de vejiga
líneas celulares de cáncer de vejiga humano T24 y um- UC-3 se transfectaron transitoriamente con los dispositivos en placas de 96 pocillos. En ambas líneas celulares de vejiga, MIRM-183/96/182 o la MIRM-210 disminuyeron MTT reactividad (Fig. 2). Tal observación podría o bien indicar una detención del crecimiento celular o muerte celular.
T24 y las células UM-UC-3 se transfectaron con los dispositivos en placas de 96 pocillos. El crecimiento celular se midió mediante el ensayo de MTT en diferentes intervalos de tiempo. ANOVA se utilizó para la comparación de las curvas de crecimiento de las células. (A)-183 MIRM /96/182 inhibe el crecimiento celular en células T24 (P & lt; 0,05). (B)-183 MIRM /96/182 inhibe el crecimiento celular en UM-UC-3 células (P & lt; 0,05). (C) MIRM-210 inhibe el crecimiento celular en células T24 (P & lt; 0,01). MIRM-210 de crecimiento (D) inhibió la célula en UM-UC-3 células (P & lt; 0,01). Los datos fueron el promedio de tres experimentos independientes; bares, Dakota del Sur.
El inicio de la apoptosis celular inducida por los genes miARN de céspedes en líneas celulares de cáncer de vejiga
Para probar la muerte celular, se realizaron experimentos de apoptosis. Tanto de las dos líneas celulares fueron sembradas en placas de seis pocillos y se transfectaron con los dispositivos. Hemos llevado a cabo ensayos de apoptosis utilizando un kit de detección de apoptosis con anexina V-PE para determinar si los dos tipos de nuestros genes miARN de céspedes sintéticos inducen la apoptosis celular en células de cáncer de vejiga. Los resultados mostrados en la Fig. 3 demostraron que las células apoptóticas (%) de T24 y UM-UC-3 líneas de células transfectadas con el MIRM-183/96/182 o la MIRM-210 fueron mayores que las transfectadas con el control no directo.
células T24 y UM-UC-3 se transfectaron con los dispositivos en placas de 6 pocillos. apoptosis celular se midió por la citometría de flujo a las 48 h después de la transfección. (UN). Imágenes representativas de análisis de citometría de flujo en células T24. (SEGUNDO). Imágenes representativas de análisis de citometría de flujo en UM-UC-3 células. (DO). Se observó inducción de la apoptosis celular en las células MIRM-183/96/182-T24 transfectadas cáncer de vejiga y UM-UC-3 utilizando el análisis de citometría de flujo. (RE). Se observó inducción de la apoptosis celular en el cáncer de vejiga T24 transfectadas-MIRM-210 y UM-UC-3 células por medio de citometría de flujo. Se realizó cada experimento por lo menos tres veces. Las barras de error, Dakota del Sur. ** P & lt; 0,01, comparado con el control no directo
La inhibición de la migración celular inducida por los genes miARN de céspedes en líneas celulares de cáncer de vejiga
Las células fueron sembradas en 12 pocillos. placas y transfectadas con los dispositivos. A continuación, hemos examinado el papel de cada dispositivo en la migración de células tumorales mediante la realización de ensayos de cero. Como se muestra en la Fig. 4, las distancias de migración de las células en los grupos transfectadas con los genes miARN de céspedes eran significativamente más bajos que los de los grupos transfectadas con el control no directo.
T24 y UM-UC-3 células fueron transfectadas con los dispositivos en placas de 12 pocillos. La migración celular se midió por el ensayo de cero. (A) MIRM-183/96/182 y MIRM-210 inhibió la migración celular en células T24 de forma independiente. (B) MIRM-183/96/182 y MIRM-210 inhibe la migración celular en UM-UC-3 células de forma independiente. Cada experimento se realizó al menos tres veces y una imagen representativa se muestra. Los resultados se muestran en la media ± desviación estándar. ** P & lt;. 0,01, en comparación con el control no directo
Discusión
Está ampliamente reconocido que los miRNAs inducen la degradación del mRNA a través de interacciones específicas de secuencia. Sin embargo, el trabajo reciente ha propuesto que la función principal de algunas interacciones miRNA-ARNm es bloquear el miARN, en lugar de suprimir la expresión de los genes diana [12]. Varios resultados experimentales apoyan esta nueva concepción de la regulación de los genes miARN. En células de mamíferos, el
PTENP1
pseudogen con miARN sitios de unión conservadas en su 3'UTR fue mostrado para regular
PTEN
expresión a través de la interacción de apareamiento de bases con los miRNAs. Un fenómeno similar se descubrió en
KRAS
y su pseudogen
KRAS1P
[16] - [17]. La secuencia específica de la degradación miARN se observó recientemente en células T transformadas con tití
Herpesvirus Saimiri gratis (HVS). El virus codifica un pequeño ARN no codificador-llamada-HSUR1 que contiene sitios con amplia complementariedad de miR-27a. apareamiento de bases entre miR-27a y HSUR1 puede regular a la baja los niveles de expresión de miR-27a [18]. Sobre la base de estos hallazgos, se especula que una molécula natural pequeños ARN puede estar actuando como una cortadora de miRNAs que se unen a los sitios de reconocimiento específicos en su secuencia de nucleótidos. Por lo tanto, parece razonable que los dispositivos de regulación miARN artificiales con secuencias parcialmente complementarias de miARN de interés también tienen la capacidad de inhibir la actividad de los genes miARN endógeno correspondiente y /o expresión.
Para probar esta hipótesis, se construyó dispositivos sintéticos que contienen múltiples abombada miARN sitios de unión y de ellos, llamado "miARN de céspedes". Es evidente que la razón para elegir este nombre para el dispositivo sintética es que puede "acribillar" miARN expresión como una cortadora de césped. Los dispositivos fueron diseñados para ser modular, donde los sitios de unión en tándem podría ser cambiado por los otros. Su expresión fue impulsado a alto nivel por el promotor viral SV-40 fuertes en las células del cáncer de vejiga humana. El uso de dos experimentos de validación, se demostró que los miARN de céspedes construidos por nosotros eran funcionales. En primer lugar, ensayos de luciferasa confirmaron que las actividades de los reporteros de luciferasa en los miARN de céspedes fueron suprimidos en las dos células de cáncer de vejiga. En segundo lugar, en tiempo real qPCR se realizó para detectar los niveles de expresión de miRNAs diana en las células del cáncer de vejiga transfectadas con los dispositivos, y hemos demostrado que las cantidades de estos miRNAs se redujeron por el correspondiente miARN-cortadora. De acuerdo con estos dos resultados, se concluye que los miARN de céspedes pueden inhibir funcionalmente a un único objetivo miARN o bloquear todo un conjunto de miRNAs relacionados.
Cada vez más estudios han demostrado que los miRNAs son frecuentemente desregulados en muchos tipos de cánceres humanos. Como los papeles críticos de miRNAs en los cánceres se exploran gradualmente, sus aplicaciones como potenciales dianas terapéuticas han generado un gran interés en el desarrollo de nueva estrategia para el tratamiento del cáncer [21] - [22]. Ya sea individualmente o como grupo, los niveles de expresión de miR-96, miR-182 y miR-183 se han demostrado ser hasta reguladas en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón, el meduloblastoma, el cáncer de vejiga y etc. [23] - [27]. Lin et al. encontró que miR-96 induce la proliferación y el crecimiento independiente del anclaje de líneas celulares de cáncer de mama [28]. Segura et al. encontró que miR-182 sobre-expresión promovió la migración de las células de melanoma humano in vitro y sus metástasis in vivo [29]. Sarver et al. encontró que miR-183 funcionó como un oncogén mediante el aumento de la migración de las células del cáncer [30]. miR-210 ha surgido como un nuevo biomarcador tumor regulado por la hipoxia. La región única semilla de miR-210 lo distingue de todos los demás miRNAs. La expresión de miR-210 se relaciona con el crecimiento tumoral, la invasión y la mala supervivencia de los pacientes [31]. Yang et al. descubrió que miR-210 downregulation inhibió el crecimiento celular y la apoptosis celular inducida en células de hepatoma humano [32]. Fasanaro et al. descubrió que el anti-miR-210 transfección disminuyó la migración celular, inhibe el crecimiento celular y la apoptosis inducida por [33]. Estos estudios proporcionan evidencias de las importantes funciones de los cuatro miRNAs selectivos en la patogénesis de los cánceres humanos. Sin embargo, sus efectos sobre los fenotipos de las células del cáncer de vejiga siguen siendo en gran parte desconocido.
En este estudio, hemos demostrado que el miR-183-96-182 clúster o la supresión de miR-210 por el correspondiente miARN-segadora no sólo inhibe el crecimiento y la migración, pero también apoptosis inducida en células de cáncer de vejiga humana. La inhibición del crecimiento celular se debe a la inducción de la apoptosis de las células. Estos resultados sugieren que el miR-183/96/182 clúster y miR-210 desempeñan un papel importante en la regulación del comportamiento biológico de las células del cáncer de vejiga.
Todos los cambios observados en el fenotipo deben estar mediados por genes regulados-miARN . Se ha demostrado en el trabajo anterior que desmontables de la agrupación de miR-183/96/182 dio como resultado el enriquecimiento de las vías de la apoptosis y la desregulación de la vía PI3K /AKT /mTOR [26]. se informó de componentes de la vía PI3K /AKT /mTOR ser crítico para la tumorigénesis, incluyendo la proliferación celular, el crecimiento, la supervivencia y la movilidad [34]. También hubo informe que demuestra que este cúmulo inhibe la absorción de zinc a través de la supresión de los transportadores de zinc [23]. El zinc es un inhibidor de HIF-1α en los cánceres humanos que reprime importantes genes implicados en la progresión del tumor, tales como VEGF, MDR1 y Bcl2 [35]. miR-210 se ha conocido para regular la hipoxia, que es importante para la supervivencia de células de cáncer y la invasión. Varios miR-210 objetivos que influyen en el crecimiento celular, la apoptosis y la migración ya han sido identificados, tales como factor de transcripción E2F 3 (E2F3) [36], factor de crecimiento fibroblástico receptor como 1 (FGFRL1) [37], homeobox A1 (HOXA1) [38], enorme proteína FLICE-asociado (FLASH) /asociado a la caspasa-8 proteína-2 (Casp8ap2) [39] y Efrina-A3 (EFNA3) [33]. Se necesitan más análisis para investigar su regulación genética en las células de cáncer de vejiga.
Debe también tenerse en cuenta que los dos miARN de céspedes no son absolutamente eficiente, ya que sólo se han traducido en cambios fenotípicos marginales en las células de cáncer de vejiga . Hay varios factores que pueden afectar a la eficiencia de los dispositivos. La función de un miARN-cortadora depende no sólo del número de sitios de unión miARN, sino también de la cantidad de ARN del cortacésped relativos a la cantidad de los miRNAs endógenos. Para proporcionar un tratamiento más eficaz del cáncer, varios puntos pueden ser tomados en consideración. La adición de más miARN sitios de unión a los dispositivos pueden aumentar la concentración de las secuencias parcialmente complementarias y, por tanto, aumentarán los efectos inhibidores de los miARN de céspedes. Para expresar los dispositivos a un alto nivel, se puede seleccionar más fuertes posibles promotores para dirigir la transcripción y el uso de vectores virales para la entrega de los miARN de céspedes. Algunas otras posibilidades aún no se han mostrado.
En resumen, los efectos anti-crecimiento mediada por apoptosis y anti-migración efectos fueron tanto inducida por los genes miARN de céspedes sintéticos dirigidos clúster miR-183-96-182 o miR 210 en las células de cáncer de vejiga. Posteriores investigaciones aún son necesarias para demostrar la utilidad de nuestra plataforma de biología sintética en funciones miRNAs estudios y tratamientos contra el cáncer.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y cultivo celular
vejiga humana líneas celulares de carcinoma de células transicionales T24 y UM-UC-3 fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.). Ambos se mantuvieron en RPMI-1640 (1640) suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de antibióticos (100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina sulfatos). Las células fueron cultivadas en forma rutinaria a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO
2.
Creación de los miARN de céspedes
miARN sitios de unión abombada para el miR-96, miR 182, miR-183 y miR-210 y los engarces entre ellos fueron diseñados y sintetizados químicamente. O bien la pieza de combinación de ADN para el clúster de miR-183-96-182 que contiene 2 copias de sitios de unión para cada grupo miARN o la parte de ADN específica para el miR-210 que contiene 6 copias de los sitios de unión de miR-210 se clonó en siCHECKTM-2 vector de luciferasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.) digerido con
XhoI
y
NotI
. Como un control no directo, un dispositivo con 6 tándem repite sitios complementarios a no miRNAs conocidos de unión también se construyó mediante el uso de los mismos métodos como se describió anteriormente. descripciones exhaustivas de las secuencias relacionadas se presentan en la Tabla S1 y la Tabla S2.
transfección de células
Las células se sembraron veinte horas antes de la transfección para alcanzar el 70-80% de confluencia en el momento de la transfección. 1 ug de cada dispositivo se transfectó en las células usando el reactivo de transfección Hiperfect (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) de acuerdo con los protocolos del fabricante.
reportero de luciferasa ensayo
Las células se sembraron en placas de seis pocillos (5 × 10
5 /pocillo) y se transfectaron con los miARN de céspedes o el control no directo. Se detectó actividad de luciferasa usando el sistema de ensayo de luciferasa dual (Promega, Madison, WI, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante a las 48 horas después de la transfección. La actividad de la luciferasa de Renilla se normalizó a la actividad de la luciferasa de luciérnaga. La inhibición (%) de la expresión de luciferasa se calculó mediante la siguiente fórmula: Inhibición (%) = (actividad relativa de la luciferasa en el control no directo - actividad de luciferasa relativa en el miARN-segadora) la actividad /luciferasa relativa en el control no directo × 100 %. Los experimentos se realizaron por duplicado y se repitieron al menos tres veces.
extracción de RNA y en tiempo real qPCR
Total de ARN fueron aisladas de las células T24 y UM UC-3-células usando el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. cDNAs fueron sintetizados utilizando la M-MLV transcriptasa inversa (Promega, Madison, WI, EE.UU.). PCR en tiempo real se llevó a cabo utilizando el todo-en-uno
QRT-PCR Kit ™ miARN detección (GeneCopoiea Inc, Rockville, MD, EE.UU.). U6 pequeños ARN nucleares (snRNA) fue seleccionado como el control endógeno. Los miARN qPCR Los cebadores fueron encargados a GeneCopoeia, Inc. Los números de catálogo de All-in-One ™ miARN qPCR primers fueron los siguientes: hsa-miR-96~HmiRQP0852; hsa-miR-182~HmiRQP0239; hsa-miR-183~HmiRQP0244; tiene-miR-210~HmiRQP0317; ARNsn U6 ~ HmiRQP9001 (La empresa no proporcionó información sobre la secuencia de estos cebadores). Las mezclas de PCR se prepararon de acuerdo con los protocolos del fabricante, con las condiciones de PCR de 40 ciclos de 15 segundos a 95 ° C, 20 seg a 55 ° C, y 30 seg a 70 ° C en un ABI PRISM 7000 cuantitativa fluorescente PCR System (Applied Biosystems , Foster City, CA, EE.UU.). La expresión relativa de cada uno de los genes miARN se calculó utilizando métodos 2
-ΔΔCt. La inhibición (%) de los genes miARN expresión se calculó mediante la siguiente fórmula: Inhibición (%) = (relativo nivel de expresión de los genes miARN en las células transfectadas con el no directo control - nivel de expresión de los genes miARN relativa en las células transfectadas con el miARN-cortadora) /miARN relativa nivel de expresión en las células transfectadas con el control no directo × 100%.
el crecimiento celular ensayo
los efectos de los dispositivos diseñados sobre la proliferación celular se examinaron mediante un ensayo MTT de acuerdo con los métodos reportados [40 ]. Se añadieron 24, 48 o 72 horas después de la transfección, 20 l de MTT (5 mg /ml) a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y las células se cultivaron durante 5 horas. A continuación, las mezclas de medio MTT se desecharon y se añadieron 100 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO) a cada pocillo. Se midió la absorbancia a una longitud de onda de 490 nm (con 630 nm como longitud de onda de referencia) utilizando un lector de microplacas ELISA (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). Los ensayos se repitieron al menos tres veces.
se detectó la apoptosis de la célula de ensayo
apoptosis de la célula usando un isotiocianato de fluoresceína V-anexina (FITC) /yoduro de propidio (PI) kit de detección de apoptosis (BD, San Jose, CA, EE.UU.), de acuerdo con los protocolos del proveedor. 48 horas después de la transfección, se recogieron las células, se centrifugaron, y se resuspendieron en 500 l de tampón de unión 1 ×. a continuación, se añadieron Anexina V-FITC (5 l) y PI 10 l a cada tubo. Los tubos se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 min. ensayo de apoptosis de las células se realizó inmediatamente en una citometría de flujo (EPICS, XL-4, Beckman, CA, EE.UU.). Cada experimento se realizó al menos tres veces.
La migración de células de ensayo
motilidad celular se examinó por el ensayo de cero de acuerdo con los métodos descritos anteriormente [41]. Las células se sembraron en placas de 12 pocillos a una densidad de 1,0 x 10
5 células por pocillo. Células transfectadas con los dispositivos y se incubaron los platos a 37 ° C hasta que las células alcanzaron 100% de confluencia. a continuación, un espacio artificial fue generada por el rascado con una punta de pipeta. Las imágenes fotográficas se tomaron de cada pocillo inmediatamente y de nuevo después de 20 h utilizando un sistema de cámara digital. Se utilizó el programa de software HMIAS-2000 para calcular la distancia de migración celular (micras). Cada experimento se repitió al menos tres veces.
Los análisis estadísticos
Los datos de todos los experimentos se expresaron como media ± desviación estándar (SD). La significación estadística se determinó mediante la prueba t o ANOVA y P & lt del estudiante; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Todas las pruebas estadísticas se realizaron utilizando el programa SPSS versión 17.0 (SPSS, Chicago, IL, EE.UU.).
Apoyo a la Información sobre Table S1.
MiRNA secuencias en el Estudio
doi: 10.1371. /journal.pone.0052280.s001 gratis (DOC) sobre Table S2.
miARN de césped sintético de secuencias en el vector
doi: 10.1371. /journal.pone.0052280.s002 gratis (DOC) sobre Table S3. Los valores de Ct-Delt
de Real-Time PCR cuantitativa en ambas líneas celulares de cáncer de vejiga transfectadas con los dispositivos sintéticos
doi: 10.1371. /journal.pone.0052280.s003 gratis (DOC)
Agradecimientos
los autores están en deuda con los donantes, cuyos nombres no fueron incluidos en la lista de autores, sino que participaron en este programa.