Extracto
epigenética silenciamiento génico mediado por aberrante promotor hipermetilación del ADN y modificaciones de las histonas represivas, es un sello distintivo de cáncer. Aunque hereditario, la naturaleza dinámica y la reversibilidad potencial a través de las intervenciones farmacológicas hacen tales aberraciones objetivos atractivos. Ya que los cánceres contienen múltiples anomalías epigenéticos, que combinan terapias que se dirigen a diferentes defectos potencialmente podrían mejorar sus eficacias individuales. 5-Aza-2'- desoxicitidina (5-Aza-CdR), medicamento aprobado por la FDA para el tratamiento del síndrome mielodisplásico, pueden inhibir las ADN metiltransferasas (DNMTs) tras la incorporación en el ADN de las células en división, lo que resulta en la desmetilación global. Más recientemente, la primera desmetilasa histona, lisina desmetilasa específico 1 (LSD1), que demethylates tanto de histonas y sustratos no histonas, se ha convertido en una nueva diana para la terapia epigenética. Usando, clorgilina, un inhibidor de LSD1 (LSD1i) para el tratamiento de líneas celulares de cáncer, se muestra que clorgilina emplea dos mecanismos de acción en función del tipo de células: se puede o bien inducir la desmetilación del ADN global o inhibir la LSD1 impulsada H3K4me2 y H3K4me1 desmetilación para establecer una configuración de la cromatina activa. También investigamos la eficacia terapéutica de la combinación de 5-Aza-CdR con clorgilina y determinar que este tratamiento combinatorio tiene efectos sinérgicos sobre la reactivación de genes silenciados por aberrante enriquecer H3K4me2 y H3K4me1. Muchos de los genes reactivados se clasifican como antígenos de testículo de cáncer o pertenecen a la vía de señalización de interferón, lo que sugiere potenciales implicaciones para la inmunoterapia. En conjunto, nuestros resultados demuestran que el tratamiento combinatorio que consiste en un inhibidor de DNMT (DNMTi) y un LSD1i han mejorado los valores terapéuticos y podría mejorar la eficacia de la terapia epigenética
Visto:. Han H, Yang X, K Pandiyan, Liang G (2013) sinérgica Re-activación de genes silenciados por epigenetically combinatoria La inhibición de LSD1 DNMTs y en las células cancerosas. PLoS ONE 8 (9): e75136. doi: 10.1371 /journal.pone.0075136
Editor: Wei-Guo Zhu, la Universidad de Pekín Centro de Ciencias de la Salud, China
Recibido: May 7, 2013; Aceptado: August 10, 2013; Publicado: 6 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Han et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Institutos Nacionales de Salud (NIH) [RO1CA124518 y CA138794] a GL. XY y KP son compatibles con generosidad por el Contra el Cáncer [2000901485]. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el silenciamiento génico mediado por hipermetilación del promotor del ADN y las histonas modificaciones aberrantes es una de las características del cáncer. Aunque tales modificaciones son heredables, su naturaleza dinámica y reversibilidad a través de intervenciones farmacológicas ellos hacen dianas terapéuticas atractivas [1]. Durante las últimas décadas, diversos fármacos que se dirigen a diferentes tipos de alteraciones epigenéticas se han desarrollado con el objetivo de reactivar los genes silenciados de manera aberrante, incluyendo DNMTi y los inhibidores de histona desacetilasas (HDACi) [2], [3]. Muchos de ellos han mostrado prometedor valor terapéutico en el tratamiento de diversos tumores malignos, como fármacos solos y en combinación con otras terapias y varios de ellos han sido aprobados por la FDA.
La N-terminales de las histonas se someten a una variedad de post- translacional modificaciones para generar conformaciones cromatina transcripcionalmente permisivas o refractarios en función del tipo y la ubicación de la modificación [4], [5]. Por ejemplo, los promotores transcripcionalmente activos están marcados por los enriquecimientos de dimethylation y trimethylation de H3K4 y acetilación de H3 [6]. Transcripcionalmente inactivos promotores están marcadas por los enriquecimientos de cualquiera de trimethylation H3K9 o trimethylation de H3K27 [5]. La actividad equilibrada de histonas modificación de enzimas que añaden o eliminan modificaciones específicas es crítica para la fisiología celular normal [2]. Las células cancerosas a menudo carecen de este equilibrio y muestran una reducción global de acetilación y la reducción del efecto promotor específico de di- y trimethylation de H3K4, lo que resulta en el silenciamiento de genes aberrantes [1], [7]. metilación de las histonas lisina fue considerado como una modificación relativamente permanente hasta el descubrimiento de la primera desmetilasa histona-lisina específica desmetilasa 1 (LSD1 /KDM1 /BHC10 /AOF2) [8], [9]. Después de eso, muchos esfuerzos se han invertido en el desarrollo de inhibidores de histona contra desmetilasas.
LSD1 demethylates mono y dimethylation de H3K4 a través de una flavina adenina dinucleótido (FAD) dependiente mecanismo [9], y por lo tanto, tiene el potencial de reprimir la expresión de genes [10]. Antes del descubrimiento de la capacidad de desmetilación, LSD1 era conocido asociar con un número de complejos de co-represor, incluyendo CoREST [11], CtBP [12] y un subconjunto de los complejos de HDAC [13]. Durante el proceso de desmetilación, se forma una imina intermedia que se hidroliza adicionalmente para generar una lisina no metilada y formaldehído como subproducto [9], [14], [15]. LSD1 también puede demethylate una serie de sustratos no histonas, como DNMT1, que al parecer hace que sea más estable [16], [17], lo que podría contribuir a un aumento de la metilación del ADN global. Tomados en conjunto, LSD1 tiene dos mecanismos potenciales de acción para suprimir la expresión génica: se puede demethylate mono- y dimetilada H3K4, así como a estabilizar DNMT1
La sobreexpresión de LSD1 ha sido reportado en una serie de tumores malignos, incluyendo mieloide aguda. leucemia (AML) [18], neuroblastoma [19], cáncer de mama [20], carcinoma de vejiga, cáncer de pulmón de células pequeñas y carcinomas de colon [21], lo que sugiere que los inhibidores de LSD1 puede tener importantes beneficios terapéuticos en numerosos tumores. LSD1 ha sido identificado para bloquear la diferenciación en MLL [22] y regular las transiciones epiteliales-mesenquimal (EMT) para activar genes de la motilidad [23]. inhibidores de la LSD1 pueden promover la diferenciación de células de cáncer de próstata de alto grado [24], suprimir la proliferación de células de cáncer de vejiga [25], y reactivar genes silenciados aberrante [26]. Los dominios catalíticos de LSD1 y monoamina oxidasas comparten homología estructural y hacer uso del mismo mecanismo catalítico [9]. Por lo tanto, muchos inhibidores de la monoamina oxidasa son también LSDI. Uno de estos inhibidores de la monoaminooxidasa, clorgilina, también puede inhibir desmetilasas específicos de lisina [19], [20], [27], [28].
Debido a la presencia de múltiples alteraciones epigenéticas en las células cancerosas, se investigó el valor terapéutico combinado de 5-Aza-CdR y clorgilina para inhibir DNMTs y LSD1, en el cáncer de vejiga (T24), leucemia (HL60) y las líneas celulares de cáncer colorrectal (HCT116). Observamos que clorgilina emplea dos mecanismos de acción diferentes en las tres líneas celulares estudiadas. En las células T24 y HL60, clorgilina solo produce efectos mínimos sobre la reactivación de genes silenciados aberrante en comparación con el control no tratado. Sin embargo, el tratamiento combinatorio induce efectos sinérgicos sobre la reactivación de genes silenciados epigenetically. Además, sólo los resultados de los tratamientos combinatorios en los enriquecimientos de H3K4me2, H3K4me1 y H3K9 /14 acetilación en los promotores de genes regulados. Por otra parte, en células HCT116, clorgilina solo induce desmetilación del ADN global y la reactivación del gen. Sin embargo, el tratamiento combinatorio no provocó efectos sinérgicos sobre la reactivación del gen. A pesar de mostrar diferentes mecanismos de acción en las líneas celulares, en conjunto, nuestro estudio demuestra que el tratamiento combinatorio ha mejorado los valores terapéuticos, e introduce un nuevo enfoque en el tratamiento del cáncer.
Materiales y Métodos
El tratamiento farmacológico y condiciones de cultivo
p>
5 células /100 mm placa, 3 × 10
5 células /100 mm placa y 5 × 10
5/25 cm
2 frasco, respectivamente. Se trataron al día siguiente con 1 M, 0,3 M o 0,1 M de 5-Aza-CdR (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), respectivamente durante 24 horas. Después de la eliminación de 5-Aza-CdR, las células se trataron con 10 clorgilina mu M (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) todos los días durante 21 días. Las dosis múltiples de clorgilina se probaron: 1 mM, 10 mM y 100 mM. Clorgilina retraso del crecimiento celular de una manera dependiente de la dosis y la dosis óptima para clorgilina (10 mM) se determinó mediante el control de la curva de respuesta a la dosis.
Formación de Colonias
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos a 1.000 células por pocillo con o con el tratamiento indicado. El medio de cultivo se cambió cada 3 días. Después de 10 días de incubación a 37 ° C, las células se lavaron con PBS, se fijaron con metanol y se tiñeron con 0,5% de cristal violeta. Las colonias que contienen más de 50 células fueron contadas con un microscopio.
Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) Ensayo
Se llevaron a cabo ensayos de chip como se ha descrito anteriormente utilizando 4 × 10
6 células por IP [6 ]. Se utilizaron diez mg de los siguientes anticuerpos: H3 y H3K4me2antibodies se adquirieron de Abcam (Cambridge, MA). Acetilado H3, y los anticuerpos de IgG se adquirieron de Millipore (Billerica, MA). anticuerpos H3K4Me3 y H3K4me1 se adquirieron de Active Motif (Carlsbad, CA). Los cebadores de PCR están disponibles bajo petición.
Real-time RT-PCR
El ARN total fue aislado de las células con el reactivo Trizol (Invitrogen) en los puntos de tiempo indicados. Una g de ARN se sometió a transcripción inversa utilizando M-MLV (Invitrogen) y hexámeros aleatorios (Invitrogen). Las reacciones de PCR se realizaron utilizando SYBR KAPA RÁPIDO universal 2X qPCR Master Mix y el Bio-Rad CFX
96 © PCR en tiempo real systerm de detección. Las secuencias de los cebadores específicos de genes están disponibles bajo petición. Con cada conjunto de cebadores de PCR, las titulaciones de cantidades conocidas de ADN se incluyeron como un estándar para la cuantificación.
Infinium
El ensayo de metilación del ADN Infinium se realizó en el Centro de USC Epigenoma acuerdo con el fabricante de especificaciones (Illumina, San Diego, CA). El ensayo de metilación del ADN Illumina Infinium (Infinium HumanMethylation450 BeadChip) examina el estado de metilación del ADN de & gt; 485.000 sitios CpG, que cubren el 99% de los genes RefSeq y regiones intergénicas seleccionados por expertos de metilación. cálculos de procesamiento y valor beta aguas abajo se realizaron como se describe anteriormente [29].
microarrays de expresión
El análisis de expresión se realizó en Sanford-Burnham Medical Institution (La Jolla, CA) usando el genome- Illumina BeadChip amplia expresión (HumanHT-12_V4_0_R1) (iluminación). La expresión génica datos fueron procesados mediante el paquete lumi en R. Los datos fueron log2 transformado y normalizado utilizando robusta Spline Normalización (RSN) tal como se aplica en el paquete lumi. Las comparaciones entre el control y las muestras tratadas por las tres líneas celulares se realizaron con el paquete limma R. Genes (transcripciones) con un valor de p por debajo de 0,01 y un factor de cambio mayor que 2 con respecto al control se consideró significativo. Oncomine ™ (Compendio Bioscience, Ann Arbor, MI) se utilizó para el análisis y visualización de datos de expresión génica a disposición del público. análisis de redes y la ontología aguas abajo se realizó a través de MetaCore GeneGo Inc.
Análisis estadístico
Todas las pruebas estadísticas se realizaron utilizando el software R (R versión 2.15.2, R Core Equipo de Desarrollo, 2012). paquete 'Lumi' se utilizó para normalizar y datos de expresión génica proceso. Anotación y visualización de sondas de metilación del ADN se realizaron utilizando paquetes disponibles a través Bioconductor ( "TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene", "rtracklayer", "Gviz" y "IlluminaHumanMethylation450kprobe"). Los siguientes paquetes CRAN se utilizaron para generar parcelas: "gplots" "ggplot2" y "diagrama de venn". Ontología de genes análisis se realizaron utilizando la herramienta de anotación funcional DAVID (Huang da et al. 2009). chip datos se analizaron mediante pruebas t de Student en la versión GraphPad Prism 5 (GraphPad Software).
GEO Número de Acceso
Todos los datos de todo el genoma utilizados en el estudio se han depositado en el GEO en virtud de la adhesión número GSE41754.
resultados
tratamiento combinatorio de un DNMTi y un LSDI resultados en más de inhibición del crecimiento celular y la formación de colonias que cualquiera de los agentes individuales
en el análisis del gen expresión de datos disponibles a través de Oncomine ™ (Compendio Bioscience, Ann Arbor, MI), se observó que la LSD1 está sobreexpresado en el cáncer de vejiga, leucemia y adenocarcinomas de colon en comparación con sus homólogos normales (Figura 1A), lo que sugiere que la sobreexpresión de LSD1 puede jugar un papel en la tumorigénesis. Además, se ha establecido que la metilación del ADN aberrante está implicado en la iniciación, así como la progresión de diversos tumores malignos, incluyendo en los tres tipos de cáncer mencionados anteriormente [30]. Por lo tanto, una línea de cáncer de vejiga de células, T-24, una línea celular de leucemia, HL60 y una línea celular de cáncer de colon, HCT116 fueron elegidos para investigar los efectos de la inhibición de LSD1, así como para evaluar la eficacia terapéutica de un tratamiento combinatorio que consiste en una LSD1i y un DNMTi.
a. Los niveles de expresión de LSD1 en los cánceres de vejiga, de células T de leucemia linfoblástica aguda, adenoma de colon y sus homólogos normales se obtuvieron de Oncomine. Los números entre paréntesis indican los número de muestras utilizadas para generar diagramas de caja. B-D. Población veces para el control (negro), tratada clorgilina (amarillo), 5-Aza-CdR tratado (rojo) y tratamiento combinatorio tratada (verde) se ha duplicado T24, HL60 y células HCT116. Los números correspondientes de hora se enumeran en la tabla debajo de cada gráfico. E. Cuantificación de número de colonias producidas mediante ensayos de formación de colonias en T24 y células HCT116 después indicó tratamientos
Todas las líneas celulares se trataron como sigue:. Clorgilina solo, 5-Aza-CdR solo, y combinatoria tratamiento de clorgilina y 5-Aza-CdR. Las células fueron tratadas con 5-Aza-CdR durante 24 horas antes de cambiar los medios de comunicación. En contraste, las células recibieron una dosis fresca de clorgilina todos los días durante 21 días. En los tres tipos de células examinadas, tanto 5-Aza-CdR y el tratamiento clorgilina sola extensión de población celular el tiempo de duplicación entre 3 y 10 horas, con el tratamiento combinatorio aumentando aún más el tiempo de duplicación, hasta 16 horas (Figura 1 B, C, D).
Para evaluar la eficacia terapéutica de clorgilina, 5-Aza-CdR y el tratamiento combinatorio en la supervivencia y proliferación de las células, se realizaron ensayos de formación de colonias en las dos líneas celulares adherentes, T-24 y las células HCT116. Clorgilina mostró un efecto moderado en la supresión de la capacidad de las células T24 y HCT116 para formar colonias. 5-Aza-CdR formación de colonias sustancialmente suprimido y el tratamiento combinatorio reducen aún más el número de colonias (figuras S1 y 1E). Nuestros datos demuestran que tanto clorgilina y 5-Aza-CdR inhiben el crecimiento celular y suprimen la formación de colonias. Además, el tratamiento combinatorio más ralentiza el tiempo de duplicación de la población y reduce la capacidad de las células para proliferar.
tratamiento combinatorio de un DNMTi y un LSDI regula por incremento significativamente más genes que cualquiera de los agentes individuales en células T24 y HL60
Para investigar el cambio global en el perfil de expresión génica después de clorgilina, 5-Aza-CdR y el tratamiento combinatorio, se llevaron a cabo estudios de expresión de todo el genoma en el día 18 post-tratamiento (D18), utilizando el Illumina HumanHT-12 V4 BeadChip en células T24 y HL60. Ha sido bien documentado que el 5-Aza-CdR induce desmetilación inmediata y el gen de la posterior reactivación [31], [32]. También se ha establecido que rebotes de metilación y los genes se convierten en re-silenciada tras la retirada de drogas [33], ya que los niveles DNMT consiguen repuestos. Por lo tanto, hemos elegido un punto de tiempo relativamente tarde para evaluar si el tratamiento combinatorio puede inducir la reactivación sostenida de genes. cambios de expresión génica de todas las transcripciones después de los tratamientos indicados se muestran como gráficos de volcán (Figura 2A). En el día 18, en las células T24, clorgilina solo no produjo significativamente hasta de regular las transcripciones, mientras que el tratamiento 5-aza-CDR aumentó la expresión de 30 transcripciones. Sorprendentemente, el tratamiento combinatorio inducida sustancialmente más transcripciones (108 transcripciones) que fueron significativamente hasta reguladas (Figura 2A). Para el estudio de la superposición entre las transcripciones-up regulado a los diferentes tratamientos que generó un diagrama de Venn, lo que demuestra que todas las transcripciones inducidos por 5-Aza-CdR también fueron inducidos por el tratamiento combinatorio (Figura 2B). A continuación, para comparar la diferencia de inducción de la expresión génica global entre 5-Aza-CdR y el tratamiento combinatorio, que trazan la observada log2 veces el cambio de todas las transcripciones interrogados en la plataforma. La mayoría de estas transcripciones son sinérgicamente hasta reguladas por tratamiento combinatorio (Figura S2), mostrando que clorgilina complementa la capacidad de 5-Aza-CdR para reactivar los genes en las células T24. Además de complementar 5-Aza-CdR, el tratamiento combinatorio también puede reactivar los genes que no pudieron ser de hasta reguladas por la 5-Aza-CdR solo. Setenta y ocho genes fueron sólo hasta regulados por tratamiento combinatorio (Figura 2B), lo que sugiere que el tratamiento combinatorio puede emplear un mecanismo de acción diferente que el tratamiento de la 5-Aza-CdR solo. Curiosamente, los genes que son sinérgicamente hasta reguladas por tratamiento combinatorio se enriquecen para funciones específicas, tales como respuesta inmune, citoesqueleto remodelación y la regulación del ciclo celular (Figura 2C, la figura S3). Un análisis detallado se realizó en genes que son parte de la IFN alfa y beta vía de señalización de IFN. El análisis reveló que el tratamiento combinatorio estimula la expresión de varios genes que son esenciales para la respuesta inmune efectiva a las infecciones virales (Figura 2C).
. A. génica diferencia expresión log2 se traza en el eje x, y la -log10 (p-valor) se traza en el eje y. Las sondas que son identificados como significativamente diferente entre los dos grupos son de color rojo. B. Venn intersecta del número de genes que son regulados por el tratamiento indicado. C. diagrama de enriquecimiento de red que contiene los genes que son sinérgicamente hasta reguladas por tratamiento combinatorio. genes regulados positivamente sinérgica están marcadas por barras de color rojo. Los otros símbolos utilizados son como se ven en la página web MetaCore.
También llevaron a cabo estudios de expresión de todo el genoma de las células HL60. los cambios de expresión génica de todas las transcripciones después del tratamiento indicado se muestran como parcelas volcán. El uso de puntos de corte establecidos previamente, se identificaron las transcripciones expresados diferencialmente, que se destacan en rojo (Figura 3A). Se encontró que mientras que los tres tratamientos inducen gen regulación el tratamiento combinatorio induce la expresión de más transcripciones, que presenta un perfil de expresión similar al de las células T24. Clorgilina, 5-Aza-CdR y el tratamiento combinatorio regulados hasta 43, 200 y 346 transcripciones, respectivamente (Figura 3B). Aunque hubo una considerable superposición entre el 5-Aza-CdR y el tratamiento combinatorio, el tratamiento combinatorio fue más eficaz en la inducción de genes en el que hasta reguladas 180 transcripciones que no fueron reguladas por la 5-Aza-CdR (Figura 3B) .
A. Gen diferencia expresión log2 se traza en el eje x, y la -log10 (p-valor) se traza en el eje y. Las sondas que son identificados como significativamente diferente entre los dos grupos son de color rojo. B. Venn se cruza con el número de genes que están regulados suba sobre el tratamiento indicado. C. Expresión de estado obtiene a partir de Oncomine de 20 genes, cuya expresión se reactivó de forma sinérgica en las células HL60, en mononucleares de sangre periférica y la leucemia linfocítica crónica.
Para evaluar la importancia funcional de los genes sinérgicamente hasta reguladas por el tratamiento combinatorio inspeccionamos la base de datos Oncomine ™ (Compendio Bioscience, Ann Arbor, MI). En el estudio de la expresión génica de muestras de leucemia linfocítica crónica en comparación con muestras mononucleares de sangre periférica normales, nos dimos cuenta de que numerosos genes en estas categorías se redujeron reguladas en las leucemias en comparación con las células normales (Figura 3C), lo que sugiere que estos genes son potenciales supresores tumorales en la leucemia. En conjunto, nuestros datos muestran que los cambios en la expresión de genes se asocian con cambios en la inhibición del crecimiento celular y que el tratamiento combinatorio tiene más de un impacto más profundo en la inhibición de la tasa de crecimiento celular en comparación con el tratamiento con agentes individuales, los resultados que están en consonancia con nuestros estudios de expresión globales . Además, el tratamiento combinatorio provoca un efecto sinérgico en hasta la regulación de la expresión génica en células T24 y HL60. Además, muchos de estos genes tienen implicaciones potenciales para la inmunoterapia, como los genes de antígenos de testículo de cáncer, y los genes en la vía de interferón, lo que sugiere la posibilidad de combinar la terapia epigenética y la inmunoterapia en el tratamiento de tumores malignos. En particular, nuestros datos también indica que los cambios en la expresión génica son consistentes con la inhibición del crecimiento celular; los tratamientos combinatorios hasta regula sustancialmente más genes, que son potencialmente supresor de tumores, lo que resulta en el mayor impacto en la tasa de crecimiento celular entre todos los tratamientos.
Gene regulación inducida por el tratamiento combinatorio se debe a la histona alterado modificaciones no desmetilación en las células T24
para investigar si la desmetilación del ADN fue responsable de la regulación de los genes más por tratamiento combinatorio, llevamos a cabo estudios de metilación del ADN global utilizando la plataforma Illumina Infinium HumanMethylation450, que incluye más de 450.000 sitios CpG , cubriendo regiones promotoras, 5'UTR, 3'UTR, el cuerpo de genes y primeros exones. Dado que tanto T24 y HL60 demostraron gen sinérgico sobre regulación debido al tratamiento de combinación, se seleccionaron T24 como la línea celular representante para estudiar la causa de la inducción de genes. El nivel de metilación del ADN para cada sitio CpG interrogado se informa como un valor beta, que van desde 0 (no metilado) y 1 (totalmente metilado). Un gráfico de la densidad, que incluye todas las sondas en la matriz, se generó para mostrar los perfiles de metilación del ADN globales para cada tratamiento (Figura 4A). Las sondas se pueden separar más o menos en dos grupos en el control basado en la distribución bimodal de los valores beta: un grupo hypomethylated (valor beta & lt; 0,2) y un grupo hypermethylated (valor beta & gt; 0,8) (Figura 4A). Las células de control y clorgilina tratadas mostraron perfiles de metilación muy similares. Después, tratamiento con 5-Aza-CdR, el pico que representa sondas hypermethylated se desplazó hacia valores más bajos beta, lo que demuestra que el 5-Aza-CdR induce desmetilación global. células T24 expuestos a tratamiento con 5-Aza-CdR mostraron un perfil de metilación muy similar a las células expuestas al tratamiento combinatorio (Figura 4A). Aunque DNMT1 ha sido reportado como un sustrato potencial para la LSD1 [16], nuestros datos muestran que clorgilina no induce la desmetilación en células T24.
A. gráficos de densidad para cada tratamiento en todos los sitios CpG 450.000. El eje X representa los valores de beta que van desde 0 (no metilado) a 1 (muy metilado). B. Zona de juego de sondas CpG pertenecientes a los genes que son sinérgicamente hasta reguladas por tratamiento combinatorio. El nivel de metilación del ADN para cada sonda en cada muestra se representa mediante el uso de la escala de color se muestra en la leyenda. C. chip como resultado de modificaciones de las histonas después de la normalización de entrada. Las barras de error representan la desviación estándar de 3 experimentos independientes.
A continuación, se investigaron los niveles de metilación de los genes que fueron significativamente hasta reguladas por tratamiento combinatorio. Un mapa de calor se genera para ilustrar los niveles de metilación de las sondas, que se encuentran dentro de las regiones promotoras (sondas situadas dentro de 1500 pb del sitio de inicio de transcripción) de esos genes alterados significativamente después de cada tratamiento (Figura 4B). Las células tratadas clorgilina control y mostraron perfiles de metilación muy similares con pocas sondas que o bien aumentaron o disminuyeron después del tratamiento metilación clorgilina (valor beta delta & gt; 0,2). Sin embargo, el tratamiento combinatorio no indujo más desmetilación de esas sondas que fueron originalmente hypermethylated. La comparación de tratamiento con 5-Aza-CdR con el tratamiento combinatorio, 0 sondas tenían un valor delta beta mayor que 0,2, lo que confirma que no hubo ningún cambio sustancial en la metilación debido al tratamiento combinatorio (Figura 4B). De una manera imparcial se seleccionaron dos genes, IFI27 y PAGE2B, que fueron reactivadas sinérgicamente por tratamiento combinatorio, para estudiar los cambios en la metilación del ADN después de cada tratamiento (Figura S4 A y B). Ambos genes tienen varias sondas en la plataforma de Infinium. El promotor de IFI27 no está metilado; Por otra parte, el promotor de PAGE2B está metilado. Como los datos demuestran, estos dos genes mostraron niveles de metilación del ADN similares después de cualquiera de los tratamientos combinatoria o tratamiento 5-Aza-CdR. En conjunto, nuestros datos muestran que los genes que son significativamente regulados arriba por tratamiento combinatorio carecen de la cambio desmetilación correspondiente en comparación con las células tratadas con 5-Aza-CdR solo, lo que sugiere que activa los genes independientes de los cambios de metilación del ADN en células T24.
para explorar otro mecanismo potencial para una mayor reactivación de genes inducidos por el tratamiento combinatorio, decidimos investigar los cambios en marcas de histona que podrían estar asociados con los cambios de expresión observados. En primer lugar, seleccionaron al azar 8 genes, independientemente del estado de metilación en el control, (CT45A4, GTSF1, TKTL1, PAGE2B, IFI6, IFI27, IFIT1 y HIST1H2BK) del grupo de 92 genes, que fueron significativamente regulado en marcha tras el tratamiento combinatorio, y . validado nuestros resultados de la matriz de expresión por RT-PCR en los días indicados (Figura S5)
Tras la confirmación de los resultados de la matriz, se seleccionaron 6 de los 8 genes y se investigaron los cambios en las marcas de histona específicas: H3K4me1, H3K4me2 y H3K4me3 mediante la realización de ensayos de chip a los promotores de estos genes. Tanto H3K4me1 y H3K4me2 se han reportado como sustratos directos de LSD1 [9]. Entre los genes que hemos seleccionado, promotores de tres de estos genes, CT45A4, GTSF1 y PAGE2B, están metilados en células T-24 y el resto no están metilados. En comparación con el control, no se observaron enriquecimientos de H3K4me1 y H3K4me2, los objetivos de LSD1, en los promotores de los genes seleccionados por tratamiento clorgilina (Figura 4C). Tanto el tratamiento con 5-Aza-CdR y el tratamiento combinatorio inducida enriquecimientos de H3K4me1 y H3K4me2 a los promotores de los genes metilados (Figura 4C). Los niveles de enriquecimiento fueron sustancialmente mayores en el tratamiento combinatorio, lo que sugiere suplementos clorgilina 5-aza-CDR para establecer una estructura de cromatina activa a los genes metilados.
A los promotores de los genes metilados, ni 5-aza-CDR ni clorgilina solos aumentado el enriquecimiento de las marcas de la cromatina activa; Sin embargo, el tratamiento combinatorio induce aún más los enriquecimientos de H3K4me2 y H3K4me1. También se examinó el nivel de H3K4me3, que no es un objetivo directo de la LSD1, sino que es una marca de histona activo, enriquecida en los promotores de los genes metilados. Clorgilina inducida enriquecimiento más dramático de H3K4me3 para IFI27 en comparación con el control. tratamiento con 5-Aza-CdR y el tratamiento combinatorio mostraron enriquecimientos comparables de H3K4me3 para todos los genes seleccionados, de refuerzo que la reactivación del gen fue inducida por enriquecimientos de H3K4me2 y H3K4me1, los dos blancos directos de LSD1. Además, se investigaron los enriquecimientos de H3K9 /14 acetilación porque fuertemente correlacionan con la expresión de genes [34]. Hemos observado que el tratamiento clorgilina no alteró el nivel de acetilación como se ve en el control, consistente con los niveles de expresión observados. 5-Aza-CdR indujo el enriquecimiento de acetilación y el tratamiento combinatorio aumentado aún más el nivel de enriquecimiento en los promotores de genes metilados, así como IFI27 (Figura 4C). En conjunto, nuestros resultados muestran que en las células T-24, el tratamiento combinatorio induce más reactivación gen no a través de la desmetilación del ADN. De interés, que enriquecimientos de H3K4me2 y H3K4me1 son los cambios de activación clave que dan lugar a la reactivación de genes.
clorgilina induce la desmetilación del ADN en las células HCT116
Hemos llevado a cabo el análisis de expresión de todo el genoma en el día 20 posterior tratamiento en las células HCT116 para investigar los cambios en la expresión génica global después de cada tratamiento. Curiosamente, los tres tratamientos: clorgilina, 5-Aza-CdR y el tratamiento combinatorio, gen sustancial inducida sobre regulación, así como la regulación negativa (Figura S6). Hay una superposición sustancial (348 transcripciones) entre los tres tratamientos (Figura 5A), lo que sugiere que todos los tratamientos pueden emplear mecanismos de acción similares en la reactivación de los genes silenciados. Esto también puede explicar la falta de respuesta sinérgica en las células HCT116.
A. Venn se cruza de los genes que son regulados hasta en el tratamiento indicado. B. parcelas de densidad para cada tratamiento en todos los sitios CpG 450.000. El eje X representa los valores de beta que van desde 0 (no metilado) a 1 (muy metilado). C. Venn de intersección de las sondas que se demethylated por el tratamiento indicado. La superposición de dos círculos representa las sondas comunes que se demethylated con ambos tratamientos.
Aunque clorgilina no induce la desmetilación del ADN en las células T24, se investigó si el gen importantes sobre regulación observada en los tres tratamientos en HCT116 se atribuyó a la desmetilación del ADN mediante la realización de análisis global de metilación del ADN en el día 20 post-tratamiento. El gráfico de densidad demuestra que tanto el tratamiento con 5-Aza-CdR y la desmetilación tratamiento combinatorio inducida sustancial, que exhiben perfiles de metilación globales similares (Figura 5B). En contraste con las células T24, clorgilina inducida desmetilación del ADN moderado en HCT116. Al día 20, 21,049 sondas se desmetilados mediante tratamiento clorgilina, mientras que 59,834 sondas permanecieron desmetilados después del tratamiento 5-Aza-CdR. Hay una considerable superposición entre las sondas desmetilado entre estos dos tratamientos (Figura 5C). Clorgilina demethylates principalmente las regiones insulares no CpG (Figura S7a). Dado que las células HCT116 tienen niveles más altos de metilación en las regiones insulares no CpG que en las células T24 (Figura S7B), esto puede proporcionar una explicación de su eficacia en HCT116. Se ha demostrado que DNMT1 es un sustrato para los inhibidores de la LSD1 y LSD1 tienen el potencial para desestabilizar DNMT1, resultando en desmetilación mundial [16]. Nuestro laboratorio ha demostrado previamente que DNMT1 es más prominente en el mantenimiento de no-CpG isla metilación [35], lo que refuerza la hipótesis de que clorgilina induce desmetilación mediante la desestabilización DNMT1.