Extracto
terapia de privación de andrógenos se ha convertido en el tratamiento puño línea del cáncer de próstata metastásico; Sin embargo, la progresión de la enfermedad para castrar resistencia se produce en la mayoría de los pacientes. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de mejoras en la terapia para el cáncer de próstata resistente a la castración. Los objetivos del presente estudio fueron determinar la eficacia octreotida análogo de la somatostatina (OCT) en combinación con una baja dosis de docetaxel (DTX) utilizando células de cáncer de próstata resistente a la castración y para investigar los mecanismos moleculares implicados en vitro. Los efectos potenciales anti-proliferativas y la sinergia se determinaron mediante el ensayo de MTT. La inducción de la apoptosis se analizó empleando la anexión de V y yoduro de propidio y citometría de flujo de tinción. VEGFA, expresión CASP9, CASP3 y el gen ABCB1 se evaluó mediante RT-PCR y análisis Q-RT-PCR. También se evaluó la TCO en combinación con tratamientos DTX en la migración de células DU145. La investigación reveló que la administración combinada de DTX y OCT tuvo significativa sinérgicamente mayor citotoxicidad, que DTX o el PTU tratamiento solo. La combinación de los dos fármacos causó un aumento más marcado en la apoptosis y dio lugar a una mayor supresión de potencial invasivo que cualquier agente individual. No era evidente aumento de la caspasa 3 en los solos y de dos grupos de tratamiento combinados de drogas, sin embargo, la expresión de VEGFA se suprimió marcadamente en ellos la OCT. Estos resultados apoyan la conclusión de que los análogos de somatostatina en combinación con docetaxel pueden mejorar las eficacias de quimioterapia a través de múltiples mecanismos en línea de células de CaP resistente a la castración. Este trabajo proporciona una base preclínico para las estrategias terapéuticas para mejorar el tratamiento de la enfermedad de la resistencia a la castración
Visto:. Zhu S, Oremo JA, Li S, M Zhen, Tang Y, Du Y. (2014) Actividades antitumorales sinérgicos de docetaxel y octreotida Asociado con apoptótica-regulación por incremento en cáncer de próstata resistente a la castración. PLoS ONE 9 (3): e91817. doi: 10.1371 /journal.pone.0091817
Editor: Allen Gao, UC Davis Comprehensive Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 31 de diciembre de 2013; Aceptado: 13 Febrero 2014; Publicado: 14 de marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Zhu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por una beca de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81041102) y la Fundación de Investigación Científica preferidos para la Devolución de ultramar estudiosos chinos, Ministerio de Educación del Estado. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es el cáncer más común que representa una gran amenaza para la salud de los hombres. la terapia de privación de andrógenos (ADT) que implica la castración quirúrgica o química es el tratamiento estándar para pacientes con CaP avanzado [1]. Sin embargo, la mayoría de los pacientes serán refractarios a la privación de andrógenos y en última instancia, el progreso de las enfermedades resistentes a la castración [2], generalmente dentro de 12-24 meses desde la iniciación de la terapia hormonal [3]. La aparición de clones resistentes a la castración agresivos durante ADT es justificación para la terapia basada en taxanos, que es la única clase de quimioterapia para mostrar un beneficio de supervivencia en el cáncer de próstata resistente a la castración metastático (CRPC) [4], [5].
el docetaxel (DTX) es la opción de quimioterapia de primera línea para los pacientes sintomáticos CRPC que son candidatos para la quimioterapia [6], lo que mejora la respuesta general, la remisión clínica de los pacientes con cáncer de próstata [7]. tratamiento DTX aumenta Bcl-2 fosforilación, regula a la baja los niveles de proteína Bcl-XL, induce p53 y por lo tanto los resultados en la apoptosis [8], [9]. Además, se informó de DTX para ejercer efectos antiangiogénicos [10]. Nos recuerda la evidencia temprana de que Taxotere podría inhibir la proliferación de proliferación de células endoteliales de la vena umbilical humana a través de la inhibición de la secreción de VEGF [11]. Por lo tanto, se investigó la secreción VEGFA antes y después del tratamiento con diversos agentes. Sin embargo, citotoxicidades neurotoxicidad especialmente periférica y los efectos secundarios hematopoyéticos son significativos y la progresión inevitable se produce después del tratamiento DTX [12], [13]. La resistencia se puede desarrollar a través de una variedad de mecanismos incluyen la inhibición de la apoptosis y la activación de las PI3 quinasa /Akt vías de supervivencia relacionadas con señal extracelular con el desarrollo de metástasis [14]. Debido a la resistencia, que a menudo no curar a los pacientes, por lo tanto, es importante identificar mejores alternativas o estrategias terapéuticas que revierten la resistencia a la quimioterapia y mejoran la sensibilidad a los medicamentos de quimioterapia basada en docetaxel.
La somatostatina (SST) se descubrió como un inhibidor de la hormona del crecimiento que se aisló primero a partir del hipotálamo de ovejas. Se distribuye en muchos órganos humanos y tumores con una variedad de funciones tales como la inhibición de la proliferación celular, la regulación de las actividades de fosfotirosina fosfatasa para inhibir la PI3 quinasa y MAP quinasa actividades [15]. Muchos análogos de somatostatina sintéticos (octreotida, lanreotida, vapreotida y depreotida) se desarrollaron y cinco subtipos diferentes de receptores de somatostatina se pueden unir por ellos [16]. los receptores de la somatostatina están presentes en las membranas celulares de líneas de células de CaP resistentes a la castración, sin embargo, su expresión dinámica puede variar dependiendo de la característica fenotípica de cada línea celular [17]. El análogo de la somatostatina octreótido sintético (OCT) ha sido ampliamente estudiado como uno de los análogos de SST y la acumulación de evidencia apoya su actividad antitumoral en la terapia del cáncer [18], [19]. La OCT ha sido aprobado por la FDA para ser utilizado como un estándar de atención médica para el tratamiento de varios tipos de cánceres. Tiene una estabilidad muy mejorada en comparación con la somatostatina natural, lo que permite el tratamiento a largo plazo [20].
Peinar diferentes agentes contra el cáncer es una estrategia razonable, con el que obtener un efecto citotóxico potente en las células cancerosas. En nuestro estudio, se determinó el efecto del tratamiento combinado de DTX y OCT en el perfil de expresión de genes asociados con la apoptosis, la angiogénesis y la droga-tolerancia en las células DU-145. Los resultados presentados en este documento muestran que la asociación de DTX y OCT proporcionó un más que aditivo respuesta apoptótica. Esta nueva combinación de drogas fue más eficaz en la inducción de la apoptosis y la reducción de la migración que cada fármaco por separado. Estos resultados proporcionan una comprensión global de las estrategias clínicas de cáncer de próstata y la inversión de la resistencia a fármacos.
Materiales y Métodos
Células y cultivo celular
células de cáncer de próstata DU145 y PC3 células fueron proporcionados amablemente como un regalo por el Prof. Peter Nelson (Fred Hutchinson Cancer Research Center). Mientras sean adquiridos en la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.). Las células se cultivaron en Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.), que fue suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Hyclone) y 1% de penicilina /estreptomicina a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% CO2. Las células confluentes se pasaron con tripsina-EDTA (0,05% de tripsina y 0,53 mM de tetrasodio EDTA) y se recogieron para preparar ARNm como se describe a continuación.
Tratamiento y viabilidad de las células de ensayo
Se sembraron células de cáncer de próstata DU145 en placas de 96 pocillos en quintuplicado con medio basal de Dulbecco más suero bovino fetal al 10% y mantenido en cultivo durante 24 h. Las células fueron tratadas con DTX (5, 10, 20, 50 o 100 nM) y OCT (10, 10
2, 10
3, 10
4, 10
5 nM), utilizado solos o en combinaciones simultáneas de 24 h, 48 h y 72 h, respectivamente. Al final de las incubaciones, el medio celular se eliminó y se añadieron 100 l /pocillo de solución de MTT (0,5 mg /ml en PBS). A continuación, las placas se incubaron durante 3 horas (a 37 ° C, protegido de la luz). Después de incubación a 37 ° C, 5% de CO2 durante 4 h, los sobrenadantes se retiraron cuidadosamente y se añadieron 150 l de DMSO a cada pocillo. Las células después se sorprendieron por 10 min en la oscuridad. Se midió la absorbancia a 450 nm en un lector de microplacas (Bio-Rad 680). El análisis de los resultados obtenidos se realizó utilizando GraphPad Prism programa de ordenador 4 para evaluar la tasa de proliferación celular y la tasa de citostático. Se utilizaron células no tratadas como controles.
ARN y ADN extracción
se determinaron
Total de ARN a partir de células cultivadas se extrajeron utilizando el reactivo Trizol (Takara, Dalian, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y sus concentraciones por un espectrofotómetro (NanoDrop, Nyxor Biotech). ADN genómico a partir de células cultivadas se extrajeron utilizando DNeasy Blood & amp; Kits de tejido (Qiagen) y sus concentraciones se midieron con el NanoDrop espectrofotómetro. Todos los procesos se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
RT-PCR y Q-RT-PCR
Quantitative PCR en tiempo real se realizó con la mezcla maestra QPK-201 SYBR Green (Toyobo, Osaka, Japón) y el sistema ABI 7300 de Applied Biosystems. Los cebadores utilizados en el estudio se obtuvieron de Invitrogen (Beijing, China) y presentan en la Tabla 1. Los parámetros de termociclado incluyeron una etapa de RT en 50 ° C durante 20 min, seguido de una etapa de activación de la polimerasa de ADN a 95 ° C durante 2 min y 50 ciclos de PCR (95 ° C durante 20 s, 60 ° C durante 30 s). Todas las reacciones se llevaron a cabo por triplicado. El factor de cambio en la expresión diferencial de cada gen se calculó utilizando el comparativo C
Tmethod (también conocido como el 2
-ΔΔCTmethod) como se describe por Lu et al [21].
Flujo de evaluación de citometría de células anexina V-FITC /PI-manchado
Las células cancerosas se cultivaron en placas de 6 pocillos durante 24 h, se trató con DTX (20 nM) y OCT (10
3 nM) solo o en combinación simultánea para adicional 48 h. Para detectar eventos apoptóticos, las células se lavaron dos veces con PBS y el sedimento se resuspendió en 1 × Anexina tampón de unión a una concentración de 10
6cells /ml. Entonces, 100 l de la suspensión celular se transfirió a tubo de cultivo de 5 ml. A continuación, se añadieron 5 l de la anexina V-FITC y 5 l de yoduro de propidio a cada prueba, y las muestras se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de este tiempo, se añadieron 400 l de tampón de unión 1 × Anexina a cada tubo y las células se analizaron utilizando un citómetro de BD FACSCanto flujo (BD Biosciences). Cada experimento incluyó las células muestras de control teñidas con anexina V-FITC (sin PI) y las células teñidas con PI (no de Anexina V-FITC). Las células viables fueron Anexina V-FITC y PI-negativas, las células en apoptosis temprana eran Anexina V-FITC y PI-positivo-negativo y las células a finales de la apoptosis o muerte fueron positivas tanto para Anexina-FITC y PI. Los resultados se representan como cambios veces en relaciones medias relativas entre las células no tratadas en comparación con las diferentes modalidades de tratamiento. Cada experimento se realizó por triplicado.
cicatrización de heridas ensayo
El ensayo de rayado se realizó para evaluar la influencia de DTX y OCT en la motilidad de las células del cáncer de próstata solos y en combinación. las células DU145 se sembraron en una alta densidad en placas de 6 pocillos y se cultivaron durante 24 h. El medio se retira y se sustituye con medio que contiene DTX y /o para otro octubre 24 h. Las células de la monocapa fueron heridos físicamente por rayar la superficie con una punta de pipeta (1000 l) del modo más uniforme y más recto posible. Las imágenes de células que invaden el cero fueron capturados en los puntos de tiempo indicados (0, 4, 6, 8 y 24 horas) utilizando microscopía de contraste de fase (IX 70 Olympus Optical Co., Alemania). Las imágenes se evaluaron mediante la medición de la diferencia en el área de las heridas con un sistema de análisis de imágenes Leica (Leica, Mannheim, Alemania) y tasa de migración expresado como porcentaje de cierre cero se calculó como sigue:% de cierre cero = a-b /a, donde (a) es una distancia entre los bordes de la herida, y (b) es la distancia que se mantuvo libre de células durante la migración celular para cerrar la herida. Los experimentos se repitieron en pocillos por triplicado al menos dos veces.
El análisis estadístico
Los datos de los experimentos fueron analizados utilizando el software SPSS 18.0 y se expresaron en forma de media ± SD. se utilizó la prueba t de Student de dos caras para analizar las diferencias en los experimentos. El valor de p & lt; 0,05 fue considerado como significativo, mientras que el valor p & lt; 0,01 ó & lt; 0,001 como altamente significativa
Resultados
propiedades apoptótica de las células DU145 tratados por sí sola DTX, OCT. solos y su combinación durante 48 h
en el estudio inicial, se examinó el efecto inhibidor del crecimiento de la DTX, el PTU y la combinación de ellos en las células de cáncer de próstata DU145. Tras el tratamiento de estos agentes, partes de las células comienzan a contrajo, el espaciado entre celdas se hizo más grande y se observó deposición de partículas citoplasmática en el DTX y OCT células tratadas. Este efecto fue mucho más potente en el grupo de tratamiento combinado que en los grupos de tratamiento individuales. Había más flotante y células espumosas muestran características morfológicas de la apoptosis en los grupos de tratamiento de combinación y el aumento de la concentración de tratamiento mejoraron las apariencias apoptóticas. Higo. 1 muestra la morfología de las células de diferentes concentraciones de DTX y /o tratamiento octubre durante 48 h. Además, a medida que pasaba el tiempo de tratamiento, el crecimiento celular se volvió lenta y no hubo aumento del número de células flotantes pueden ser observados en el medio.
A. Las células no tratadas; B. 1 DTX nM; C. 100 nM PTU; D. 10 DTX nM; E. Dos-fármaco de combinación de 10 nM DTX y 100 nm PTU; F. 100 nM DTX. Inhibición
El crecimiento por sí solo DTX y OCT respectivamente
El efecto inhibidor del crecimiento de DTX y OCT se examinó respectivamente. Es obvio que cada uno de los dos agentes muestran un efecto anti-proliferación en células DU145 (Fig. 2A y 2B). Tanto DTX y OCT disminución de la proliferación celular en un tiempo y manera dosis dependiente. Como se muestra en la Fig. 2C, en comparación con los controles no tratados, había 14%, 31% y 43% de inhibición en la proliferación de las células DU145 expuesto a 10 nM de DTX a las 24 h, 48 h y 72 h. En cuanto a OCT (Fig. 2D), en comparación con el control, el que había un 10%, 18% y 29% de inhibición en la proliferación de las células DU145 se expone a 100 nM del fármaco a las 24 h, 48 h, y 72 h . Los datos mostraron que la mayor citotoxicidad fue a las 72 horas y IC
50 valores de DTX (Fig. 2A) y OCT (Fig. 2B) se calcularon a partir de gráficas de proliferación celular, respectivamente. DTX mostró una citotoxicidad más fuerte con el menor IC
50 con un valor de 10.784 ± 3.122 nM de la OCT mostró un efecto de inhibición más débil con IC
50 siendo 2,342 ± 0,262 M.
La viabilidad celular fue determinó por el ensayo MTT y se expresó como un porcentaje del valor de control (media ± SEM de tres experimentos realizados por triplicado); barras de error = SEM (n = 6).
DTX junto mediante OCT produce una inhibición sinérgica del crecimiento en las células DU145 humanos
Para evaluar los posibles efectos sinérgicos de DTX-OCT combinados en el crecimiento de las células cancerosas, las células DU145 se expusieron a diferentes concentraciones de DXT y OCT combinó durante 72 h (Fig. 3B). Se observó el efecto sinérgico de DTX y OCT sobre la proliferación de células DU145. Los porcentajes de inhibición del crecimiento celular inducidos por DTX en combinación con octubre fueron mayores que cada agente individual solo. A la concentración de 10
3 nM, OCT redujo significativamente el valor de IC50 (P & lt; 0,05) y promovió la apoptosis (P & lt; 0,05) en las células DU145 en respuesta a DTX. Como se muestra en la Fig. 3A, 10 nM DXT y 10
2 nM octubre resultado una inhibición del 39% y 14% en la proliferación en las células DU145, respectivamente, mientras que la combinación de ambos en las mismas dosis causó una disminución del 68% en la proliferación celular en comparación con el control no tratado, que indican una fuerte sinergia.
los resultados son el porcentaje del valor de control obtenido con las células no tratadas (media ± SEM de tres experimentos realizados por triplicado). (**) La proliferación se redujo significativamente (
p Hotel & lt; 0,001); barras de error = SEM.
VEGFA, CASP3, CASP9 y expresión de ABCB1 mRNA en células DU145
Para explorar el posible mecanismo por el cual DTX además octubre induce la muerte celular por apoptosis, la expresión de genes implicados en la señal apoptótica, resistencia de las células a DTX y la angiogénesis se evaluó mediante RT-PCR y QRT-PCR tras 48 h (Fig. S3) y 72 h de tratamiento. En comparación con el control, 10 nM DTX y 100 nM PTU, el grupo de combinación de dos agentes disminuyeron marcadamente la expresión de VEGFA mRNA (Fig 4A.) (P & lt; 0,01). En cuanto a CASP9 y CASP3, el nivel de mRNA basal de CASP9 y CASP3 eran bajos pero detectable y la expresión de ARNm se incrementó significativamente como se demuestra en la Fig. 4B y Fig. 4C (P & lt; 0,01). El nivel de expresión de proteínas de los dos genes de caspasas también se examinó y consistente con el resultado de QRT-PCR (Fig. S4). Además, la expresión de ABCB1, que se reconoce como un gen asociado con la resistencia a fármacos [22], no se vio afectada en los grupos de tratamiento (Fig. 4D). Estos resultados implican que el efecto antitumoral de DTX en combinación mediante OCT podría estar involucrado en la promoción de la apoptosis asociada con una alta expresión de la caspasa 9 y caspasa 3.
M: marcador, se examinaron los niveles de expresión de los genes objetivos por RT-PCR (a, B, C y D) y cuantitativa en tiempo real -PCR (B, D, F y H) respectivamente, utilizando células tratadas con los fármacos de ensayo durante 72 horas. El nivel de expresión de cada ARNm se normalizó al nivel de ARNm de β-actina. Los valores representan la media ± desviación estándar de análisis por triplicado (*
p Hotel & lt; 0,05, **
p Hotel & lt; 0,01).
Efectos de la DTX, OCT solo y el tratamiento de combinación de dos fármacos en las células DU145 apoptosis
de acuerdo con los resultados de QRT-PCR, los experimentos se dividieron en cuatro grupos de tratamiento, incluyendo el control, DTX (10 nM), OCT (100 nM) y los grupos de combinación de dos fármacos (Fig. 5). Después del tratamiento durante 48 h, una prueba de apoptosis se realizó por citometría de flujo de acuerdo con las instrucciones proporcionadas en el kit Annexin V-FITC /PI tinción (Fig. 5A). En contraste con el grupo de control, se indujo apoptosis tanto en los grupos de DTX y OCT (P & lt; 0,05). De acuerdo con observaciones anteriores, la proporción de células apoptóticas se incrementó notablemente por la aplicación de DTX plus octubre en comparación con DTX o octubre tratamiento solo (Fig. 5B). Estos resultados indican que el tratamiento de combinación mejora la muerte celular apoptótica en las células DU145.
datos son la media ± SEM de dos experimentos independientes realizados por triplicado. ***
p
. & Lt; 0,000 frente al control
Efecto de la DTX, OCT solo y combinación de dos fármacos sobre la migración de las células DU145
para detectar el efecto de la combinación de dos fármacos en la migración de las células DU145, un ensayo de cicatrización de la herida se realizó siguiendo 24 h de tratamiento. Los resultados de los ensayos de curación de la herida mostraron que cualquiera de los fármacos solos tienen el efecto inhibitorio sobre la migración de células. Pero las células en el grupo de combinación migran más lentamente que los del fármaco solo y los grupos de control no tratados (Fig. 6A). En comparación con el control, la distancia migrada relativa de las células en el DTX, OCT y DTX /OCT grupos combinados (Fig. 6B), fueron respectivamente de 76,5 ± 10,21, 53,2 ± 12,13, 79,4 ± 13,04 (P & lt; 0,05). Las células incubadas en el grupo control migraron a través de un área que era notablemente mayor que la de las células incubadas en el grupo combinado de drogas, lo que indica que DTX en combinación con octubre inhibió la migración de las células DU145.
( a) de la herida ensayo de curación para determinar el efecto de los fármacos indicados en la migración de células DU145. (B) La relación de la migración se resume (%) después del tratamiento 72 h medido por el ensayo de curación de la herida. Cada columna representa la media ± SEM. **
p
. & Lt; 0,01, frente al control
Discusión
quimioterapia basada en la orientación microtúbulos es el método más ampliamente utilizado en el tratamiento del cáncer de próstata [23]. Sin embargo, el tratamiento a largo plazo con frecuencia resulta en efectos secundarios y resistencia a la quimioterapia, por lo general contribuir a los resultados clínicos variables entre pacientes con tipos de tumores aparentemente similares. En un intento de superar la resistencia a fármacos, decidimos investigar las concentraciones citotóxicas y apoptóticas eficaces de los microtúbulos de metas de docetaxel drogas (DTX) y octreotida análogo de la somatostatina (OCT) y su efecto sinérgico de los dos fármacos en la línea celular de cáncer de próstata resistente a la castración DU145.
En este estudio, se evaluó el efecto combinado de DTX y OCT contra el cáncer de próstata DU145 y PC3 células (Fig. S1). La combinación de DTX con octubre indujo una mayor disminución de la viabilidad celular de cualquiera de los agentes solo. Octubre redujo la IC
50 valor de DTX en DU145 y células PC3 de manera dependiente de la dosis, inhibió la PCa células de proliferación (Fig. S2), aumento de la sensibilidad DTX, citotóxica celular y apoptosis. Aunque se encontró que las células PC3 mostraron más sensibles a DTX que las células DU145, que en consonancia con el estudio in vivo (Fig. S5). Estos resultados sugieren que la TCO potencia sinérgicamente la eficacia de los agentes de microtúbulos focalización en células de CaP in vitro. Estos consistente con el reciente estudio de Lattanzio et al. docetaxel en combinación con octreotide sinérgicamente reforzada en el efecto del tratamiento combinado en una línea celular PC-3 en particular docetaxel resistente [24]. Sin embargo, encontramos cualquiera de los dos fármacos solo estimula la proliferación de las células DU145 en una concentración menor de DTX & lt; 1 nM o octubre. & Lt; 10 nM, respectivamente, que no se observó en su grupo combinado
El anti-proliferativa efecto de la DTX y OCT puede ser debido a cualquiera de necrosis celular o apoptosis de las células. Por lo tanto, se investigó el efecto apoptótico de DTX, solo PTU y su tratamiento de combinación en las células DU145. Los resultados mostraron que la combinación de DTX con octubre disminución de la viabilidad celular y aumentar la caspasa 9/3 actividad a un mayor grado que cualquiera de los agentes solo solo en una manera dependiente del tiempo (Fig. S4). En comparación con el control no es evidente aumento de la caspasa 3 de expresión en particular en los grupos de tratamiento combinado solos y de dos fármacos OCT. Esto es consistente con el informe demostró que octubre aumentó la caspasa 3 expresión mRNA y la apoptosis celular inducida en células HepG2 [18]. Se indicó que programa apoptótico de la muerte celular fue despedido por la activación del iniciador de la caspasa-8, induciendo mitocondrial permeabilización de la membrana exterior (MOMP), la fragmentación mitocondrial, y en última instancia, la activación de las proteasas aguas abajo caspasa-9 y -3. MOMP indujo la salida de citocromo c, la formación de apoptosome y en última instancia, la activación de la caspasa-9 [25]. En el presente estudio, la actividad de la caspasa 9 se aumentó significativamente después del tratamiento de las células DU145 después de la combinación de tratamiento DTX y OCT, que implican a la MOMP y la inducción de fragmentación mitocondrial, lo que resulta en la activación de la apoptosis observada en la línea celular DU145.
señalización VEGF promueve la angiogénesis mediante la estimulación de la formación de la proliferación celular, la migración y el tubo endotelial vascular y aumenta notablemente la permeabilidad vascular [26]. La familia VEGF incluye cinco miembros, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D y factor de crecimiento placentario (PlGF) y VEGF-A es conocida por sus papeles clave en la angiogénesis relacionada con el tumor [27]. Por lo tanto, se investigó el efecto de la OCT, DTX y la combinación de los dos fármacos sobre la expresión de VEGFA en las células DU145. Estudio mostró que la combinación de DTX y OCT ejerce un gran efecto inhibitorio sobre la expresión del ARNm VEGFA pero tuvo un efecto moderado por DTX tratamiento solo. Informe demostró que la expresión de VEGF se suprimió significativamente en células de glioma mediante OCT forma dosis-dependiente. Sin embargo, OCT tuvo poco efecto en el microambiente de la producción de VEGF inducida por hipoxia in vivo [28].
En el presente estudio hemos demostrado una disminución significativa en la migración de células in vitro después de la exposición al tratamiento de combinación de dos fármacos . Estudio sugiere que la DTX en combinación con octubre inhibe la proliferación de DU145 o la migración a través de la inhibición de la liberación del péptido VEGFA y, posteriormente, da como resultado la inhibición de la migración celular. Estudio informó que el aumento de la interacción VEGF /VEGFR mejora la migración de las células de cáncer de colon [29]. Sin embargo, se descubrieron algunos resultados del estudio inconsistentes. Por ejemplo, en hepática modelo de lesión por reperfusión isquémica, OCT mostró el efecto inhibidor de la apoptosis hepatocelular y el daño de los hepatocitos atenuada causada por isquemia y reperfusión [30]. aplicación a corto plazo de la TCO podría inducir octubre receptor de SSTR2 desensibilización e internalización, lo que inhibe la apoptosis efecto de la OCT en células de cáncer de hígado [31]. Estos resultados contrarios pueden ser debido a las diferentes características de las células, microambiente celular, la expresión de la concentración de tratamiento receptores y octubre
Se ha informado de que ABCB1 se expresa en más del cincuenta por ciento de los cánceres resistentes a los medicamentos y reconocido como una principal mecanismo de resistencia a los medicamentos subyacente [32]. ABCB1 expresión es regulada hasta después de la quimioterapia en diversos tumores como una respuesta al estrés generalizado [33], [34]. En nuestro estudio no se observaron diferencias significativas entre los diferentes grupos tratados con DTX combinado y OCT, cada uno un único agente y el control untreatment. Alta expresión del gen ABCB1 antes y después de estos tratamientos drogas indica una línea celular resistente a los medicamentos DTX y /o el PTU de las células DU145 de cáncer de próstata que se ha observado en nuestro estudio anterior de modelo de xenoinjerto de ratón in vivo (datos no publicados).
Estos datos sugieren que el tratamiento combinado de DTX y OCT en las células DU145 y PC3 ejerce una mayor inhibición de la proliferación de células tumorales y la apoptosis inducida notablemente, lo que puede estar relacionado con la regulación de la actividad de la caspasa 9/3 y disminución de la expresión de VEGFA in vitro. Aunque nuestros resultados deben extenderse a modelos in vivo en estudios futuros, plantean la intrigante posibilidad de que la orientación microtúbulos con un taxano combina un análogo de la somatostatina puede ser un enfoque útil para mejorar los resultados en el cáncer de próstata.
Información de Apoyo
Figura S1.
Efecto de la DTX solo, efecto sinérgico de DTX en combinación con 100 nM octubre sobre la proliferación de células PC3 después de 48 h (A) y 72 h (B) de tratamiento. Los resultados son el porcentaje del valor de control obtenido con las células no tratadas (media ± SEM de tres experimentos realizados por triplicado). (**) La proliferación se redujo significativamente (
p Hotel & lt; 0,001); barras de error = SEM
doi:. 10.1371 /journal.pone.0091817.s001 gratis (TIF)
figura S2.
efecto sinérgico de DTX en combinación con un PTU respecto de la proliferación de células DU145 después de 48 h de tratamiento. Los resultados son el porcentaje del valor de control obtenido con las células no tratadas (media ± SEM de tres experimentos realizados por triplicado). (**) La proliferación se redujo significativamente (
p Hotel & lt; 0,001); barras de error = SEM
doi:. 10.1371 /journal.pone.0091817.s002 gratis (TIF)
Figura S3.
Efectos de la DTX solo, OCT solo y la combinación de DTX /PTU en la expresión de VEGFA, caspasa 9, caspasa 3 y ABCB1 en las células DU145 de QRT-PCR respectivamente, utilizando células después de 48 h de tratamiento. El nivel de expresión de cada ARNm se normalizó al nivel de β-actina. Los valores representan la media ± desviación estándar de análisis por triplicado (*
p Hotel & lt; 0,05, **
p Hotel & lt; 0,01)
doi: 10.1371 /journal.pone.0091817.s003. gratis (TIF)
figura S4.
Detección de la caspasa 3, y la expresión de la caspasa 9 en las células DU145 por Western blot (A). Los resultados muestran que el aumento de forma significativa los niveles de caspasa 3 y caspasa 9 expresión en DTX solo y en combinación con octubre después del tratamiento 48 h. (B) Análisis densitométrico se realizó usando software de análisis de imagen unidimensional Kodak. (P & lt; 0,01)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0091817.s004 gratis (TIF)
Figura S5. curvas de crecimiento de PC3
xenoinjerto de cáncer de próstata (A) y DU145 (B) en los ratones de control, los ratones castrados y los ratones tratados con docetaxel incluyendo dos grupos de 10 mg /kg y 20 mg /kg el tratamiento con docetaxel. medición tumor comienza a partir del tratamiento del fármaco (p & lt; 0,015). (N = 5)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0091817.s005 gratis (TIF)