Resumen
Los pacientes con cáncer de páncreas tienen pronósticos funestos, y se necesitan con urgencia nuevas terapias. Las mutaciones del gen KRAS de oncogenes se producen con frecuencia en el cáncer de páncreas y representan un objetivo atractivo. La focalización directa de las vías KRAS predominantes han sido un desafío y la investigación en las estrategias terapéuticas han sido centrada actualmente en el de las vías descendentes de KRAS, fosfoinosítido 3-quinasa (PI3K) y la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK [MEK]). La hipótesis de que la inhibición simultánea de las vías PI3K y MEK resultaría en la actividad antitumoral sinérgica, ya que sería eludir el bucle de realimentación de compensación entre las dos vías. Se investigó el efecto combinado del inhibidor de PI3K, GDC0941, y el inhibidor de MEK, AZD6244, sobre la viabilidad celular, la apoptosis y la señalización celular en un panel de líneas celulares de cáncer de páncreas. Un
in vivo
análisis se llevó a cabo en xenoinjertos de cáncer de páncreas. Mientras que (mutado KRAS) BxPC-3 (KRAS tipo salvaje) y MIA PaCa-2 líneas celulares eran sensibles a GDC0941 y AZD6244 como se observaron agentes individuales, inhibición sinérgica del crecimiento de células tumorales y la inducción de apoptosis en ambas líneas celulares en las que las dos fármacos se combinaron. Curiosamente, la fosforilación de los componentes de la traducción dependiente de la cubierta, se encontró proteína de unión 4E-(p-4E-BP1) y S6 estar estrechamente asociada con la sensibilidad a la GDC0941 y AZD6244. En BxPC-3 xenoinjertos de células, se observaron diferencias en la supervivencia entre el control y el AZD6244, GDC0941, y grupos de combinación. Nuestro estudio proporciona el fundamento para la orientación concurrente de la PI3K y MEK vías, independientemente del estado de KRAS, y sugiere que la fosforilación de 4E-BP1and S6 puede servir como un biomarcador predictivo de la respuesta al tratamiento
Visto:. Zhong H , Sánchez C, D Spitrzer, Plambeck-S Suess, Gibbs J, Hawkins WG, et al. (2013) sinérgicos efectos del bloqueo simultáneo de PI3K y MEK Rutas en modelos preclínicos de cáncer de páncreas. PLoS ONE 8 (10): e77243. doi: 10.1371 /journal.pone.0077243
Editor: Adriano Angelucci, Universidad de L'Aquila, Italia |
Recibido: 15 Abril, 2013; Aceptado: 30 Agosto 2013; Publicado: 9 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Zhong et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La publicación fue apoyado por el Instituto de la Universidad de Washington clínica y Ciencias de transferencia de Grant UL1TR000448 del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias traslacional (MCATs) y KL2TR000450. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en hombres y mujeres en los Estados Unidos. Se estima que 43.140 personas fueron diagnosticadas con y 36.800 murieron de cáncer de páncreas en 2013 [1]. La falta de métodos de detección y agentes terapéuticos eficaces hacen que la detección y el tratamiento del cáncer de páncreas un problema difícil. Mientras que los agentes específicos se han convertido en la corriente principal para otros tipos de cáncer, en la actualidad, sólo el factor de crecimiento epidérmico inhibidor del receptor de erlotinib ha obtenido la aprobación de la Administración de Alimentos y Medicamentos para el tratamiento del cáncer de páncreas [2]. Por desgracia, la utilidad clínica de erlotinib se limita en gran parte debido a su más bien modesto beneficio clínico, lo que refleja una continua urgencia de desarrollar fármacos dirigidos específicamente en el cáncer de páncreas
.
La presencia de una mutación KRAS se observa en el 30% de las lesiones premalignas [3] y en hasta el 90% de las muestras de tumor de cáncer de páncreas [4], lo que sugiere que la mutación KRAS es la característica conocida predominante de la patogénesis molecular de cáncer de páncreas. KRAS es una GTPasa, y convierte las señales extracelulares en señales intracelulares en bicicleta entre la población activa (RAS-GTP) y estados inactivos (RAS-PIB). Mutados resultados KRAS en la activación constante de la vía de RAS por bloqueo RAS en el estado de unión a GTP activo y aún más la activación de múltiples vías de señalización corriente abajo, incluyendo la proliferación celular, la apoptosis, la diferenciación, y la supervivencia [5]. La orientación directa de KRAS no ha tenido éxito en pacientes con cáncer de páncreas [6], por lo que los esfuerzos de investigación actuales han vuelto a centrar en dos vías descendentes, el fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) /Akt [7] y la RAF /MEK [8 , 9].
Dado que las redes de señalización celular son complejos, simplemente bloquear un solo mediador es poco probable que resulte en una respuesta clínica significativa, a menos que la alternancia genética hace que el objetivo "efector" ser un evento oncológicamente conducido. Este no es el caso en el KRAS vías descendentes, ilustrado por la muy baja incidencia de mutaciones PIK3CA o BRAF en tumores de páncreas [10]. Por lo tanto, se ha planteado la hipótesis de que el bloqueo simultáneo de dos vías paralelas, tales como PI3K y MEK se incrementará significativamente la probabilidad de éxito en la consecución de una respuesta clínicamente relevante. De hecho, se han observado efectos antitumorales sinérgicos cuando PI3K /AKT y las vías de MEK se inhibieron tanto en modelos preclínicos de tumores [11], incluyendo un modelo de cáncer de pulmón KRAS mutado [12].
GDC0941 es un agente oral desarrollado para inhibir las cuatro isoformas de clase І PI3K [13]. Tiene actividad dependiente de la dosis antitumoral contra glioblastoma y humanos xenoinjertos de cáncer de ovario [14]. GDC0941 ha demostrado actividad antitumoral prometedora en el ámbito preclínico, y actualmente está siendo probado en ensayos clínicos de fase temprana [14]. AZD6244 es un inhibidor selectivo de la generación secundaria potente MEK1 /2, que inhibe la MAPK /ERK en forma de ATP no competitivos [15]. Junto con otros inhibidores de MEK, AZD6422 se encuentra actualmente en los primeros ensayos clínicos de fase [16-18]. Las evaluaciones preclínicas de la combinación de un inhibidor de PI3K /AKT y un inhibidor de MEK en el cáncer de páncreas están surgiendo [19], y nuestro estudio confirma que un efecto sinérgico cuando se produce el bloqueo de estas dos vías. Por otra parte, hemos ilustrado más que el beneficio de bloqueo concurrente no es KRAS genotipo limitada. Además, nuestro estudio muestra que el proceso de traducción, en particular, la activación de 4E-proteína de unión 1 (4E-BP1) y S6 parece estar asociada con la respuesta fenotípica de las células del cáncer pancreático 'hacia los inhibidores.
Materiales Métodos y
cultivo celular e inhibidores de
líneas celulares de cáncer de páncreas, BxPC-3 (KRAS de tipo salvaje), MIA Paca-2 (KRAS mutado), PANC-1 (KRAS mutado) y Capan -2 (mutante KRAS) se obtuvieron de American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.) y se cultivaron en un medio de crecimiento de cualquiera de DMEM (PANC-1, MIA PaCa-2), RPMI-1640 (BxPC-3) o de McCoy medio 5A (Capan-2) suplementado con 10% de suero fetal bovino, 100 unidades /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina y piruvato de sodio 1 mM a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2. El GDC0941 inhibidor de PI3K y MEK AZD6244 inhibidor fueron adquiridos de Selleck Químicos LLC (Houston, TX, EE.UU.) y se disolvió en dimetilsulfóxido. Tanto los inhibidores se almacenaron a -20 ° C.
viabilidad celular Ensayo
pancreáticas líneas de células de cáncer se sembraron a una densidad de 3.000 células por pocillo en una placa de microtitulación de 96 pocillos en medio de crecimiento y se dejaron adherir durante la noche. GDC0941 o AZD6244 dosis-respuesta se determinó mediante el tratamiento de los páncreas líneas celulares de cáncer con 5 concentraciones de los fármacos basados en una serie de diluciones de 10 veces. La viabilidad celular se evaluó 72 horas más tarde por Alamar Blue (Invitrogen, NY, EE.UU.) (570λ
Ex /580λ
Em) con un lector de microplacas de fluorescencia, y se expresó como un porcentaje de las células tratadas con el fármaco con relación al control ( no) células de drogas. Los datos se analizaron usando el software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, EE.UU.), y la curva de respuesta a la dosis se utilizan para calcular la concentración de fármaco que resulta en una inhibición del 50% de la viabilidad celular (IC
50) utilizando un modelo logístico de cuatro paramétrica. Todos los ensayos se repitieron cinco veces
Para los estudios de combinación de fármacos, el efecto sinérgico se evaluó mediante el índice de combinación (CI), de acuerdo con el método de Chou & amp.; Talalay, en el que la sinergia se define como CI & lt; 1, mientras que el antagonismo es CI & gt; 1, y un efecto aditivo se considera como CI = 1 [20]. Las líneas celulares fueron tratados con GDC0941, AZD6244 o una combinación de AZD6244 y GDC0941, y el número de células viables se utilizó para calcular los valores de CI que utilizan el software Calcusyn (Biosoft, Cambridge, Reino Unido).
Ensayo de apóptosis
Aproximadamente el 2 × 10
5 células fueron sembradas en placas de 6 pocillos durante 24 horas. Las células se trataron entonces con diferentes concentraciones de GDC0941, AZD6244 o una combinación de GDC0941 y AZD6244 durante 72 horas. Se recogieron las células con 0,25% de tripsina, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS), y se recogieron juntos por centrifugación. Las células se tiñeron a continuación con la solución de Anexina V-FITC y PI (BD Biosciences, San Diego, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante y se analizaron con un flujo de exploración FAC citómetro (Becton Dickinson, San Diego, CA, EE.UU.) . Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
Western Blot ensayo
Las células fueron sembradas en placas de 6 pocillos para
in vitro
análisis. Cuando las células se convirtieron en el 70-80% de confluencia, se incubaron con GDC0941, AZD6244 o ambos GDC0941 y AZD6244 durante 24 horas. Luego, las células se lavaron con PBS frío y se lisaron en tampón RIPA (Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, 1 desoxicolato% de sodio, 0,1%, SDS, EDTA 1 mM, inhibidores de proteasa ). Los sobrenadantes se recogieron después de tratamiento con ultrasonidos y centrifugación, y cantidades iguales de proteínas se sometieron a electroforesis a través de 4-12% Bis-Tris geles y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Las membranas se bloquearon con leche no grasa al 5% después de la incubación durante la noche con los anticuerpos primarios apropiados a 4 ° C. Todos los anticuerpos primarios se incubaron en 5% albúmina de suero bovino (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.). Las membranas se lavaron 3 veces para eliminar el anticuerpo no unido y después se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas fueron tratadas con reactivos de quimioluminiscencia potenciada de acuerdo con el protocolo del fabricante (GE Healthcare Life Science, PA, EE.UU.). Los anticuerpos primarios incluyeron anti-fosfo-AKT (Ser473), anti-Akt, anti-fosfo-ERK (T202 /Y204), anti-ERK, anti-fosfo-S6 (S240 /244), anti-S6, anti-fosfo 4E-BP1 (S65) y anti-4E-BP1 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EE.UU.). ImageJ (freeware) se utilizó para comparar la densidad de las bandas y terminar el análisis densitométrico.
Los estudios in vivo
Los ratones desnudos, 4 o 5 semanas de edad, fueron adquiridos de la Nacional Cancer Institute. Ellos se aclimataron durante 1-2 semanas antes de que fueran sometidos a ningún procedimiento experimental. por vía subcutánea BxPC-3 células (1x10
6) fueron inyectados (por vía subcutánea) en los flancos de ratones. Los volúmenes tumorales se miden en dos dimensiones (longitud y anchura) con pinzas antes del tratamiento y dos veces a la semana, una vez se inició el tratamiento. Los ratones también fueron pesados en estos tiempos, y los cambios de peso se calcularon mediante el siguiente formulario: [1- (nuevo peso /peso inicial)] x 100. tamaños de los tumores se calcularon mediante la fórmula estándar del tamaño del tumor = largo x ancho
2 x 0,5. Los ratones que desarrollaron tumores alcanzan 100-150 mm
3 de tamaño fueron distribuidos aleatoriamente en los siguientes cuatro grupos de 8 ratones en cada grupo: vehículos, GDC0941, AZD6244, o la combinación de tratamiento. Ambos fármacos se administraron una vez o dos veces al día por sonda oral en un volumen de 10 ml /kg de peso corporal. Los fármacos se disuelven en un vehículo de 0,5% (w /v) metilcelulosa /0,2% de Tween 20 para la administración. El inhibidor de PI3K se entrega a diario a una concentración final de 50 mg /kg [14], mientras que el inhibidor de MEK se administró dos veces al día a una concentración final de 25 mg /kg [15]. Los animales de control se les dio un volumen equivalente de 0,5% metilcelulosa /0,2% de Tween 20 solamente, dos veces al día mediante alimentación por sonda oral. La duración del tratamiento fue de 18 días. Si el diámetro del tumor del ratón se convirtió en más de 15 mm durante el tratamiento o el peso del ratón disminuyó en un 20% en comparación con su peso inicial, el ratón se sacrificó por el CO
2 sobredosis. Todos los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con el protocolo aprobado por el Fondo Institucional de Cuidado de Animales de la Universidad de Washington (Número de protocolo: 20100114).
Análisis estadísticos
Los datos de viabilidad celular fueron representados como la media ± norma desviación (SD). los datos de la apoptosis de células y experimentos de crecimiento tumoral se representan como la media ± error estándar de la media (s.e.m.). Se utilizaron las curvas de Kaplan-Meier para el análisis de supervivencia. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante ANOVA (factor único) y t-test (dos pares de muestras de medios y la prueba t no pareada), tal como se indica. Un valor de p & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
inhibición concurrente de PI3K y MEK tiene un efecto sinérgico sobre el crecimiento del cáncer de páncreas líneas celulares
in vitro
Para determinar la actividad anti-tumor de los inhibidores de PI3K y MEK solo y en combinación
in vitro
, se seleccionaron cuatro líneas celulares de cáncer de páncreas para el estudio. BxPC-3 es un tipo silvestre línea celular de cáncer de páncreas KRAS, mientras que las otras tres líneas celulares albergan la mutación KRAS. Las cuatro líneas celulares no son conocidos por llevar ya sea PI3K o mutaciones de BRAF [21]. El efecto anti-proliferativo de la PI3K o inhibidor de MEK solo en BxPC-3, MIA PaCa-2, las células PANC-1 y Capan-2 se midió por Alamar Blue. Sólo el crecimiento de BxPC-3 y las células MIA PaCa-2 se vio afectada por GDC0941. Las concentraciones de GDC0941 que resulta en una inhibición del 50% de la viabilidad celular (IC
50) después de 72 horas de exposición eran 376,4 nM en BxPC-3 células y 754,6 nM en células MIA PaCa-2 (Figura 1A). AZD6244 solo también suprimió el crecimiento celular con una CI
50 valor de 599 nM y 375 nM en BxPC-3 y las células MIA PaCa-2, respectivamente (Figura 1B). El IC
50 no se alcanzó para las líneas de células PANC-1 y Capan-2 y, como resultado, estos se consideraron líneas celulares resistentes. Sí observamos un ligero aumento en el crecimiento de células PANC-1 con GDC0941at 1 nM, 10 nM y 100 nM, pero los cambios no fueron estadísticamente significativas (control vs 1 nM, p = 0,32, control frente a 10 nM, p = 0,17, control frente a 100 nM , p = 0,22). Además, se comparó el control vs 1 nM AZD6244 en PANC-1 y MIA células Paca-2, y no se observaron diferencias significativas (p = 0,20, p = 0,64, respectivamente)
Las células fueron tratadas con concentraciones variables de GDC0941 (a) o AZD6244 (B) solo durante 72 horas. Las dosis varió de 1 nM a 10 mM.
El efecto anti-proliferativo de la combinación de un inhibidor de PI3K y MEK se midió en las células BxPC-3 y MIA PaCa-2 mediante el cálculo del índice de combinación (CI) de acuerdo con el método de Chou-Talalay (20) usando una relación de dosis fija. Tanto GDC0941and AZD6244 se introdujeron a los cultivos celulares a 0,25 × 0,5 ×, × 1, 2 × y 4 × sus respectivos IC
50 años en el Paca-2 líneas celulares MIA BxPC-3 y. El crecimiento celular en ambas líneas celulares se disminuyó notablemente después del tratamiento de combinación en múltiples pares de concentraciones en comparación con cualquiera de los agentes solo solo. Los datos fueron evaluados para obtener el CI bajo la correspondiente dosis eficaz (ED) en BxPC-3 y Paca-2 líneas celulares MIA (Figura 2) por el software Calcusyn. Para la línea de BxPC-3 de células se obtuvieron los siguientes valores de CI: 0,4101 (ED50), 0.0112 (Ed75) y 0.0003 (ED90). Para la línea celular MIA Paca-2 los valores de CI fueron 0,02052 (ED50), 0,0295 (Ed75) y 0,0440 (ED95). Los resultados sugirieron que CI GDC0941 y AZD6244 trabajaron en sinergia para producir un efecto anti-proliferativo en el PaCa-2 líneas de células MIA BxPC-3 y (Figura 2A-B).
BxPC-3 (A) y MIA PaCa-2 células (B) fueron tratados con solo GDC0941, solo o AZD6244 GDC0941-AZD6244 en combinación. Los resultados se analizaron de acuerdo con el método de Chou-Talalay [18]. Los valores del índice de combinación (IC) se calcularon usando el software Calcusyn. PANC-1 (C) y la línea celular Capan-2 (D) fueron tratados con GDC0941 a 400 nM, AZD6244 a 200 nM o la combinación. * Valor de p. & Lt; 0,05 en comparación con un control o un único agente
Curiosamente, mientras GDC0941 o AZD6244 solo no tuvo impacto en PANC-1 y el crecimiento de células Capan-2, la administración de estos dos fármacos en combinación crecimiento celular ligeramente inhibido. El crecimiento celular se redujo a 71,4% y 67,0% en las líneas celulares PANC-1 y Capan-2, respectivamente, después de la administración de los fármacos en combinación (p & lt; 0,05, la combinación en comparación con el grupo no tratado o un único agente) (Figura 2C- D).
PI3K concurrente y la inhibición de MEK inducir la apoptosis de las células de cáncer de páncreas líneas
in vitro
Para determinar el efecto apoptótico de la terapia combinada, dos concentraciones diferentes de GDC0941 y AZD6244 se utiliza solo y en combinación. Mientras que la tasa de apoptosis de BxPC-3 células al inicio del estudio fue de 17,0%, se incrementó de manera significativa a 34,0% y 47,8% después de la administración de GDC0941 a 380 nM y 1.520 concentraciones nM, respectivamente (p & lt; 0,05, GDC0941 solo vs. grupo no tratado). AZD6244 solo a 600 nM y 2400 nM aumentó la tasa de apoptosis de BxPC-3 células a 26,5% y 27,2%, respectivamente (p & lt; 0,05, AZD6244 solo vs grupo no tratado). Una combinación de GDC0941 y AZD6244 resultó en una tasa mucho más alta de la apoptosis en BxPC-3 células en comparación con el grupo de control o inhibidor solo. La combinación de GDC0941 a 380 nM y AZD6244 a 600 nM o la combinación de GDC0941 a 1520 nM y AZD6244 a 2400 nM aumentó la tasa de apoptosis de las células BxPC-3 a 63,3% y 82,8%, respectivamente (p & lt; 0,05, combinación vs. grupo no tratado o un único agente) (Figura 3A). La tasa de apoptosis en la línea base en las células MIA PaCa-2 fue 8,0%, y se elevó a 17,4% y 24,7% con GDC0941 administrado a 400 nM y 1.600 concentraciones nM, respectivamente (p & lt; 0,05, GDC0941 solo vs. grupo no tratado). AZD6244 solo a 200 nM o 800 nM aumentó la tasa de apoptosis a 22,7% y 36,9%, respectivamente (p & lt; 0,05, AZD6244 solo vs. grupo no tratado). La combinación de GDC0941 a 400 nM y AZD6244 a 200 nM o la combinación de GDC0941 a 1600 nM y AZD6244 a 800 nM aumentó la tasa de apoptosis MIA PaCa-2 a 49,5% y 55,6%, respectivamente, y esto fue una diferencia estadísticamente significativa en comparación para el grupo no tratado o un único agente (p & lt; 0,05) (Figura 3B). Para las líneas celulares resistentes PANC-1 y Capan-2, mientras que ni agente solo tuvo un impacto significativo en la apoptosis, la combinación del inhibidor de PI3K y MEK como resultado una tasa de apoptosis de 31,8% en las células PANC-1; esto fue estadísticamente significativo en comparación con una tasa de apoptosis 14,0% en estas células sin tratamiento o con un solo inhibidor (p & lt; 0,05) (Figura 3C). La combinación de AZD6244 GDC0941 y también aumentó significativamente la tasa de apoptosis en las células Capan-2 hasta el 41,3%, frente al 12,2% sin tratamiento o con un único agente (p & lt; 0,05). (Figura 3D)
celulares de cáncer pancreático líneas fueron tratados con solo GDC0941, AZD6244 solo o GDC0941-AZD6244 en combinación durante 72 horas. apoptosis de las células se detectó por citometría de flujo. A, B: combinaciones frente a los grupos no tratados (* Los valores P & lt; 0,05), en comparación con las combinaciones de los fármacos solos (los valores de p & lt; 0,05), agentes individuales frente a los grupos no tratados (* valores de P & lt; 0,05). C, D: combinaciones frente a los grupos no tratados (* valor de p & lt; 0,05) y combinaciones de los fármacos solos (vs. * Valor de p & lt; 0,05) guía empresas
Efectos de PI3K y MEK inhibiciones en la señalización celular.
para evaluar los efectos de ambos fármacos en los efectores de las vías PI3K y MEK, se utilizó el análisis de Western blot para observar la expresión de la proteína total y estado de fosforilación. Los niveles de proteína total de ERK, S6 y 4E-BP1 se mantuvo sin cambios después del tratamiento con AZD6244 GDC0941 y en cada uno de las líneas celulares (Figura 4). p-ERK, p-S6 y p-4E-BP1 parecían ser suprimida por GDC0941 y AZD6244 tratamiento de combinación. Sin embargo, hemos observado cambios en la expresión de AKT siguientes tratamientos combinación de fármacos y se utilizó el análisis densitométrico para cuantificar los niveles de expresión. Se utilizó la relación de p-AKT /AKT producido a partir de cada dosis para la comparación. Después de p-AKT /Akt niveles de los grupos de tratamiento se normalizaron a la relación entre el grupo no tratado, se observó el tratamiento de combinación para suprimir los niveles de p-AKT por 90% en la línea celular BxPC-3, un 6% en el MIAPaCa-2 línea celular, en un 29% en la línea de células PANC-1 y un 8% en la línea celular Capan-2. La combinación de ambos fármacos redujo p-ERK (T202 /Y204), p-AKT (S473), p-S6 (S240 /244) y la expresión de P-4E-BP1 (S65), en comparación con la línea base en todas las líneas celulares ensayadas. Si bien los niveles de p-AKT y p-ERK fueron expresados diferencialmente en las cuatro líneas celulares, nuestro estudio mostró que los niveles basales de p-AKT no predecir la respuesta al inhibidor de PI3K, ni los niveles de p-ERK basales predicen la respuesta a la MEK inhibidor.
las cuatro líneas celulares de cáncer pancreático fueron tratados con la combinación GDC0941-AZD6244 durante 24 horas, los lisados celulares se recogieron a continuación para detectar p-AKT (S473) /AKT, p-ERK (T202 /Y204) /ERK, p-S6 (S240 /244) /S6 y p-4E-BP1 (S65) /4E-BP1.
Para entender las diferencias fenotípicas observadas en el MIA Paca-2 (sensibles a GDC0491 y AZD6244) y PANC-1 (resistente a líneas celulares, los cuales albergan la mutación KRAS GDC0491 y AZD6244), se examinaron las diferencias en sus efectores siguientes GDC0941 y administración AZD6244 (Figura 5). En ambas líneas celulares, GDC0941 suprime la fosforilación de AKT, AZD6244 disminución de los niveles de p-ERK, y la combinación de los dos fármacos suprimidos tanto los niveles de p-ERK p-AKT y. GDC0941 y AZD6244 tuvieron un efecto similar en AKT y ERK en las dos líneas celulares. Curiosamente, el impacto de ambos inhibidores de la p-S6 y los niveles de p-4E-BP1 era, en su defecto, la línea celular específica. Por ejemplo, GDC0941 y AZD6244 solo y en combinación marcadamente inhibida niveles de p-4E-BP1expression p-S6 y en las células MIA PaCa-2, en comparación con la supresión mínima observada en PANC-1 en las células (Figura 5). Ni GDC0941 ni AZD6244 solo suprimen p-S6 y p-4E-BP1 en las células PANC-1, lo que sugiere que ambos efectores pueden servir como biomarcadores asociados con la respuesta al tratamiento. Los niveles de expresión de p-S6 y p-4E-BP1 se suprimieron significativamente por la terapia de combinación en las células MIA Paca-2, y esto era consistente con las respuestas fenotípicas de la línea celular hacia el tratamiento de combinación.
Tanto MIA Paca células -2 y PANC-1 se trataron con 400 GDC0941 nm, 200 nM AZD6244 o una combinación a estas dosis durante 24 horas. proteínas de las células se recogieron a continuación para detectar p-AKT (S473) /AKT, p-ERK (T202 /Y204) /ERK, p-S6 (S240 /244) /S6 y p-4E-BP1 (S65) /4E-BP -1.
Efectos
antitumoral de PI3K y MEK inhibiciones
in vivo.
Para detectar el efecto de AZD6244 y GDC0941 sobre el crecimiento tumoral
in vivo
, se utilizó GDC0941, AZD6244, y una combinación de AZD6244 GDC0941and tratar a ratones BxPC-3 de xenoinjerto durante 18 días. En comparación con el grupo de control (vehículo), volúmenes de los tumores se redujo significativamente en los grupos de AZD6244 y de combinación (p = 0,037 y p = 0,032, respectivamente), pero no en el GDC0941group comparado con el control (Figura 6A). Sobre la base de las curvas de Kaplan-Meier (Figura 6B), hubo una diferencia estadísticamente importancia en la supervivencia entre los cuatro grupos (p = 0,005)
A:. 1 × 10
6 BxPC-3 cáncer de páncreas las células se inyectaron sc en el flanco derecho de ratones hembra desnudos. Los ratones recibieron vehículo (0,5% metilcelulosa /0.2% Tween-20), 50 mg /kg GDC0941 QD, 25 mg /kg BID AZD6244, o 50 mg /kg QD GDC0941 más 25 mg /kg BID AZD6244 por vía oral durante 18 días. Los datos se presentan como media ± SE. * Los valores de p se determinaron mediante la prueba t no pareada. B:. De Kaplan-Meier curvas de supervivencia de xenoinjertos que recibieron vehículo, GDC0941 solo, AZD6244 solo y GDC0941-AZD6244 en combinación
Discusión
A pesar de la terapia dirigida se ha convertido en un enfoque convencional para el cáncer el tratamiento, el desarrollo clínico de fármacos dirigidos específicamente en el cáncer de páncreas no ha tenido éxito. Debido a la alta frecuencia de mutaciones de KRAS en el cáncer de páncreas, KRAS ha sido objeto de ataques directos en los ensayos preclínicos y clínicos, pero los resultados han sido decepcionantes. A la luz de estos retos, los esfuerzos de investigación se han vuelto a centrar en la orientación de las vías descendentes KRAS, PI3K y MEK. El beneficio de bloqueo de una vía individual ha sido en gran medida limitado por la presencia de un bucle de realimentación de compensación entre PI3K y MEK. Por ejemplo, la inhibición de los resultados de la vía MEK en la activación de la vía PI3K [11], y la activación de PI3K media la resistencia a la inhibición de MEK [22]. Para sortear esta retroalimentación compensatoria, el bloqueo simultáneo de las dos vías ha sido probado y se ha detectado la sinergia en los efectos anti-tumorales, proporcionando la justificación de los ensayos clínicos de fase I. Por otra parte, se ha informado de los primeros signos de beneficio clínico en el cáncer avanzado de un análisis retrospectivo de los pacientes agentes que se dirigen las dos vías que reciben [23].
A diferencia de trabajar en otros tipos de tumores, evaluaciones preclínicas de la regulación a la baja tanto vías en el cáncer de páncreas se han limitado [19,24]. Nuestro estudio es importante en varios aspectos. En primer lugar, hemos demostrado que la sensibilidad de líneas celulares de cáncer de páncreas hacia cualquiera de PI3K o los inhibidores de MEK no es KRAS dependiente. Si bien difieren en estado de KRAS, BxPC-3 y MIA Paca-2 células tienen PI3K tipo salvaje y PTEN, y ambos eran sensibles a ambos inhibidores, lo cual es coherente con los informes publicados previamente [22,25]. En segundo lugar, nuestro estudio mostró que la inhibición de PI3K y MEK ya sea solo o en combinación puede inducir apoptosis. En el pasado, se pensaba que las drogas dirigidas a PI3K o MEK a tener más de un efecto citostático, pero informe reciente sugiere que este efecto es apoptótica [26] sinergia En tercer lugar, nuestro estudio ha demostrado en la supresión del crecimiento celular y la inducción de la apoptosis en dos sensible líneas celulares (BxPC-3 y MIA Paca-2) con el régimen de combinación. Por otra parte, la inhibición leve en el crecimiento celular y la inducción de apoptosis se observaron con la combinación de fármacos en las líneas celulares resistentes (PANC-1 y Capan-2). Aunque el grado de beneficio con el tratamiento de combinación fue modesta para ambas líneas celulares resistentes, una mayor comprensión de este beneficio está garantizado por esta enfermedad devastadora. Nuestro estudio apoya un estudio preclínico similar en el cáncer de páncreas que demostró que el beneficio del tratamiento de un inhibidor de MEK se ve reforzada por un inhibidor de AKT [24].
Un elemento crucial del desarrollo terapia dirigida es determinar marcadores moleculares que predicen la respuesta al tratamiento. se han encontrado alteraciones vía PI3K, incluyendo la amplificación de HER2, las mutaciones PI3KCA o pérdida PTEN estar asociado con la sensibilidad a la GDC0941 en cáncer de mama líneas celulares
in vitro
y
in vivo
[27]; Sin embargo, las alteraciones genéticas anteriores no suelen estar presentes en los tumores de páncreas [21]. Nuestro estudio sugiere que aguas abajo p-AKT suprimida por GDC0941 no predice la sensibilidad de las células, ni tampoco predecir downregulated p-ERK sensibilidad a AZD6244. Esta observación es consistente con los informes anteriores [27]
.
Para entender mejor los eventos moleculares que ocurren después del bloqueo simultáneo de ambos KRAS mutado líneas celulares, se comparó la expresión de proteínas en el PANC-1 (resistente) y MIA PaCa- 2 líneas celulares (sensibles). Estas dos líneas de células difieren en su respuesta fenotípica a inhibidores de PI3K y ERK, a pesar de albergar grandes alteraciones genéticas similares. se reportan las dos líneas celulares que contienen mutaciones KRAS, las mutaciones de p53, P16 tipo salvaje y de tipo salvaje DPC-4 [21]. Mientras que en nuestro estudio hemos demostrado que la supresión de p-AKT por el inhibidor de PI3K y p-ERK por el inhibidor de MEK se lograron en ambas líneas celulares, células PANC-1 experimentaron solamente una supresión mínima de p-S6 y p-4E-BP1 cuando se tratan con ya sea la PI3K o inhibidor de MEK solo. Estos hallazgos sugieren que los inhibidores de PI3K o MEK solo son capaces de suprimir su inmediata mediadores aguas abajo correspondiente (AKT y ERK) en células Panc-1, pero no son capaces de regular a la baja los mediadores aguas abajo adicionales (p-S6 y p-4E-BP1 ). Ambos marcadores, por lo tanto, están estrechamente relacionados con la sensibilidad a ambos inhibidores de PI3K y MEK. En una compleja red de señalización, la capacidad de un agente dirigido a inhibir el proceso de fosforilación de sus objetivos de abajo con frecuencia no se traduce en cambios fenotípicos. Por ejemplo, Serra et al han informado de la identificación de algunos genes que pueden promover la supervivencia celular en el contexto de bloqueo PI3K, y entre esos genes, ribosomal S6 quinasas rps6ka2 (RSK3) y RPS6KA6 (RSK4) están siendo validado más para contribuir a resistencia PI3K
in vitro
y
in vivo
través de la atenuación del proceso de apoptosis y la regulación positiva de la traducción de proteínas [28]. Nuestra observación resuena con nuevas pruebas de que aguas abajo traducción dependiente de la cubierta puede ser un mejor indicador de la respuesta a estos agentes dirigidos [29,30].
4E-BP1 juega un papel importante en la traducción dependiente de la cubierta. Se une al complejo casquillo elF4E-ARNm para inhibir la traducción dependiente de la cubierta, y fosforilados 4E-BP1 luego cae fuera del complejo de la traducción, por lo que la iniciación de la traducción puede comenzar [31]. mTORC1, un efector aguas abajo de la vía PI3K, puede fosforilar 4E-BP1 para iniciar el proceso de traducción [32]. El papel crucial de 4E-BP1 como un efector clave de las vías de señalización Akt y ERK en los tumores ha sido elegantemente estudiada por Ella et al [29]. Por otra parte, los altos niveles de expresión de 4E-BP1 se han encontrado para tener valor pronóstico en varios tipos de tumores [33-37]. Por lo tanto, una mayor exploración de la orientación 4E-BP1 debe explorarse en el futuro para múltiples tipos de tumores, entre ellos, y sobre todo, el cáncer de páncreas.
En resumen, hemos explorado el beneficio de bloqueo de la vía concurrente por parte de PI3K y MEK inhibidores solos y en combinación para el cáncer de páncreas. Se observó sinergia en el crecimiento celular y la disminución de los efectos no fueron KRAS dependiente. fosforilación persistente de S6 y 4E-BP1 parece estar asociado con la resistencia a los inhibidores de PI3K y MEK. Las futuras investigaciones sobre los mecanismos alternativos de fosforilación de 4E-BP1 y focalización de 4E-BP1 en el cáncer de páncreas están garantizados.