Resumen
Antecedentes
Las células madre del cáncer (CSC) juegan un papel importante en la iniciación del tumor, progresión y metástasis y son responsables de los altos índices de fracaso terapéutico. Identificación y caracterización de CSC son cruciales para facilitar el control, el tratamiento, o prevención del cáncer. Grandes esfuerzos se han pagado por desarrollar una metodología más eficaz. Sin embargo, el modelo ideal para la investigación CSC sigue evolucionando. En este estudio, hemos creado un sistema de cultivo no adhesivo para enriquecer células madre cancerosas de líneas celulares de carcinoma de células escamosas orales humanos con formación de esferas y caracterizar sus propiedades más CSC.
Métodos
Un sistema de cultivo no adhesivo estaba diseñado para generar esferas de las líneas celulares OECM-1 SAS y. Una investigación posterior de sus propiedades CSC, incluyendo stemness, auto-renovación, y quimio y radioresistance
in vitro
, así como la capacidad de la iniciación del tumor
in vivo
, también se llevó a cabo.
Resultados
Esferas y requiere mucho tiempo de manera eficiente dentro de 5 a 7 días. Por otra parte, hemos podido comprobar que estas esferas expresan marcadores de células madre putativas y exhibieron resistencia chemoradiotherapeutic, además de las capacidades iniciadoras del tumor y la auto-renovación.
Conclusiones
El uso de este sistema de cultivo no adhesivo, que con éxito establecido un modelo rápido y rentable que exhibe las características de células madre cancerosas y se puede utilizar en la investigación del cáncer
Visto:. Chen SF, Chang YC, Nieh S, Liu CL, Yang CY, Lin YS (2012) Sistema de cultivo no adhesivo como un modelo de Rapid Esfera Formación con propiedades de células madre del cáncer. PLoS ONE 7 (2): e31864. doi: 10.1371 /journal.pone.0031864
Editor: Shree Ram Singh, Instituto Nacional del Cáncer, Estados Unidos de América
Recibido: 15 de diciembre de 2011; Aceptado 14 de enero de 2012; Publicado: 16 de febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por el hospital general y Centro Médico de Defensa Nacional Tri-Service: Grant Nº TSGH-C100-007-009-10-S02, TSGH-C100-161, TSGH-C100-155 y la I-29; Departamento de Higiene Dental, Universidad Médica de China: Grant Nº CMU99-N1-04-1; Consejo Nacional de Ciencia, República de China (Taiwán): Otorga Nº 99 a 2320 NSC-B-039-028-MY3 y NSC 100-2320-B-016-009; Departamento de Salud, Yuan Ejecutivo, República de China (Taiwán): DOH100-TD-PB-111-TM007-22. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma oral de células escamosas (COCE) es una de las enfermedades más comunes y letales de cabeza y cuello en Taiwán y en todo el mundo [1], [2]. CCCA es una enfermedad que es difícil de tratar debido a las diversas estrategias de tratamiento disponibles y el comportamiento natural variable del cáncer. La invasión local y frecuentes metástasis de ganglios linfáticos regionales, junto con la relativa resistencia a los fármacos quimioterapéuticos, conducir a un resultado impredecible [2] - [4]. A pesar de una mayor experiencia en la tecnología quirúrgica y tratamientos adyuvantes, los pronósticos globales del COCE permanecen sin mejoras, lo que resulta en la necesidad urgente de una estrategia novedosa para el tratamiento CCCA [3], [5].
evidencias sustanciales de los estudios recientes muestran que los tumores sólidos contienen una subpoblación de células madre de cáncer (CSC) [6] - [8]. Es bien sabido que los CAC tienen un papel importante en la iniciación del tumor, progresión, metástasis, y la resistencia terapéutica [9] - [11]. Sin embargo, las células madre cancerosas putativas de CCCA no han sido bien caracterizado. La hipótesis es que los CAC tienen varias características que las hacen resistentes a la quimioterapia y la radioterapia convencional, incluyendo una alta expresión de transportadores de fármacos, la quiescencia del ciclo celular relativa, alta función de la maquinaria de reparación del ADN, y la resistencia a la apoptosis [12], [13] . La identificación y caracterización de células madre cancerosas del CCCA son cruciales para facilitar el control, el tratamiento y la prevención de la enfermedad.
El aislamiento de células madre cancerosas de las células del cáncer se ha logrado con éxito mediante el uso de diferentes técnicas. El aislamiento de células madre cancerosas se lleva a cabo mediante citometría de flujo basado en la expresión de marcadores de superficie celular específicos, tales como CD133, CD44 y ALDH1, por CSC [14] - [20]. Debido a la resistencia terapéutica de células madre cancerosas, la clasificación de las poblaciones secundarios de las células cancerosas a través de intracelular Hoechst 33342 exclusión o la selección de células resistentes a los fármacos de quimioterapia-también se ha utilizado para la identificación y caracterización de células madre cancerosas [21] - [23]. estudios simultáneos confirmaron que el sistema de cultivo de esfera es tan eficiente en la separación de células madre cancerosas de muchos tumores sólidos o líneas de células cancerosas. Estos estudios han sugerido que los CAC se pueden enriquecer en esferas cuando éstas se cultivan en medio libre de suero suplementado con mitógenos adecuados, tales como el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y factor de crecimiento epidérmico (EGF) [11], [24] - [26]. Sin embargo, la derivación de células madre cancerosas de los tumores sólidos y las líneas celulares de cáncer cultivadas en medio libre de suero suplementado con bFGF y EGF es un proceso que consume tiempo y se necesitan 2-6 semanas para la formación de esfera [11] [24], - [26 ]. Además, los factores de crecimiento seleccionados, tales como el factor de crecimiento derivado de plaquetas, bFGF y EGF, son costosas e ineficaces. Para superar estos inconvenientes y limitaciones, se utilizó un sistema de cultivo esfera no adhesivo con características para determinar y enriquecer células madre cancerosas de líneas celulares humanas establecidas CCCA, y caracterizar sus propiedades CSC adicionalmente usando fenotípica /caracterización genotípica.
Resultados
La formación esfera de líneas celulares CCCA humanos
líneas celulares OSCC (SAS y OECM-1) se disociaron suavemente en células individuales y se sembraron en plástico de cultivo de mercancías con un recubrimiento no adhesivo, como se muestra en la figura 1. Parte de la suspensión de células puede someterse a la apoptosis durante los primeros 2 días cuando se cultivan en un medio ambiente no adhesivo, suspendido. Algunas de las células en suspensión agregados y luego se fusionaron y desglosa en (3D) bolas tridimensionales con una configuración esferoidal. La alteración morfológica posterior (~3-5 días) consistía en esferas flotantes. Después de 5-7 días de cultivo, se observaron esferas con una ronda y el contorno liso. Estas esferas crecieron gradualmente con el tiempo (Figura 1A). Morfológicamente, las esferas aparecieron más estrechamente unido, el agrupamiento o la superposición en una configuración de 3D, en comparación con los observados en las células parentales. Un estudio anterior sugirió que la derivación de las esferas a partir de líneas celulares de cáncer o células de cultivo primario puede acompañar a la alteración de las características fenotípicas /genotípicas, tales como la transición epitelial-mesenquimal (EMT) [27]. Los marcadores de EMT representativos E-cadherina y fibronectina se eligieron para identificar y comparar las diferencias entre las células de los padres y las esferas en las células OECM-1 y SAS. El examen microscópico de las células y esferas parentales tiñe inmunohistoquímicamente mostró la presencia de expresión generalizada y difusa de E-cadherina y expresión escasa de la fibronectina en las células parentales, mientras que las esferas exhibieron pérdida de expresión de E-cadherina y la sobreexpresión de la fibronectina (Figura 1B).
(a) microfotografías de contraste de fase de las esferas cultivadas de SAS (arriba) y OECM-1 (abajo) líneas celulares usando un diseño no adhesivo (cuatro paneles superior e inferior más a la izquierda: desde el día 0 hasta el día 7, ampliación , 200 ×, y más a la derecha paneles superior, inferior: el día 10, ampliación, 100 ×). (B) Los resultados de inmunohistoquímica muestran diversos patrones de expresión de transición representante epitelio-mesenquimal (EMT) marcadores en OECM1 células parentales y esferas (ampliación, 200 ×).
Expresión de putativo marcadores de superficie de células madre
para dilucidar si las esferas podrían enriquecer las células que expresan marcadores de células madre del cáncer putativo, optamos por analizar el perfil de expresión de dos marcadores de superficie de células madre representativas de COCE, CD133 y ALDH1 [11], [14] - [18]. Como se muestra en la Figura 2A y B, las células y esferas parentales (después de 7 días de cultivo no adhesivo) se tiñeron positivamente para CD133 y ALDH1. La expresión de CD133 y ALDH1 era por lo general ausente o muy baja en las células parentales. Se detectó un aumento del 3-4% en la expresión de CD133 y un aumento del 20-30% en la expresión ALDH1 en esferas en comparación con las células parentales. Los niveles de expresión de CD133 y ALDH1 fueron significativamente mayores en las esferas de lo que eran en las células parentales (Figura 2C).
(A) Las células de los padres y las esferas se tiñeron con un anticuerpo IgG control negativo (abierto espacio) o anticuerpos anti-CD133 experimentales (espacio sólido). (B) Comparación de la expresión de ALDH1 entre células parentales y esferas; DEAB, un inhibidor de ALDH1, se utilizó como control negativo. (C) Las comparaciones cuantitativas y estadísticas del porcentaje de señales positivas para CD133 y ALDH1 entre las células y esferas parentales (*
P Hotel & lt; 0,05).
Expresión de cáncer de células madre genes y proteínas relacionados
la expresión de genes de las células madre y las proteínas relacionadas, incluyendo
Sox2
,
Oct4
, y
NANOG
, fue examinado en el los niveles de transcripción y traducción. El ARN total se purificó a partir de células de los padres y las esferas después de 7 días de cultivo no adhesivo. Los niveles de SOX2, transcripciones Oct4, y NANOG se incrementaron significativamente en las esferas en comparación con las células parentales, tal como se evaluó mediante análisis de transcripción inversa PCR (Figura 3A). de datos de transferencia Western mostraron que la expresión de las proteínas SOX2, Oct4, y NANOG también se upregulated en esferas en comparación con células parentales (Figura 3B). Además, se utilizó la tinción de inmunofluorescencia para evaluar los niveles celulares de CD133, ALDH1, SOX2, Oct4, y NANOG en esferas. Hemos observado diversos patrones de expresión de estas proteínas, como se indica en la Figura 3C, lo que sugiere la heterogeneidad de CCCA. CD133 se expresa en la membrana celular y ALDH1 se expresó en la membrana celular y el citoplasma, mientras que SOX2, Oct4, y NANOG se expresaron en el núcleo.
(A) Un análisis de RT-PCR mostró que la expresión de
Sox2, Oct4 y NANOG
genes se reguló en esferas en comparación con las células parentales. (B) análisis de transferencia Western mostró que la expresión de Sox2, Oct4, y NANOG se upregulated en esferas en comparación con células parentales. (C) El análisis de inmunofluorescencia de marcadores CSC en esferas demostró la presencia de células madre cancerosas con niveles variables de expresión de CD133, ALDH1, SOX2, Oct4, y NANOG, como se indica por las flechas (ampliación, 200 ×).
Radio- y quimiosensibilidad
para evaluar la radiosensibilidad de las células de los padres y las esferas, se trataron estas células y esferas con dosis de radiación de hasta 10 Gy para evaluar la viabilidad celular, que se midió usando un ensayo MTS después 36 h de tratamiento con radiación. Esferas eran más radioresistant que las células parentales (Figura 4A). También se examinó la quimiosensibilidad de las células de los padres y las esferas utilizando cisplatino. células parentales y las esferas fueron tratadas con cisplatino durante 48 h y la viabilidad celular se midió posteriormente usando un ensayo de MTS (Figura 4B). Esferas eran más resistentes a cisplatino que las células parentales. Para imitar la situación clínica, se aplicó una quimioterapia combinada y tratamiento de radioterapia (CCRT), con (1) la quimioterapia inicial que consiste en 20 mM cisplatino durante 24 h seguido de radiación (Figura 4C) o (2) la radiación inicial seguida de quimioterapia utilizando cisplatino 20 mM durante 24 h (Figura 4D). Los resultados del tratamiento el uso de estos dos regímenes de CCRT revelaron que las combinaciones eran más eficaces en la reducción de la tasa de supervivencia de las células parentales y las esferas en comparación con el tratamiento solo de cualquiera de radiación o quimioterapia. Además, las esferas eran más resistentes que las células de los padres (con niveles de significación de variables) cuando se utiliza el tratamiento combinado.
Se observaron diferencias significativas en la radiosensibilidad (A) y quimiosensibilidad (B) entre las células parentales y esferas. (C) la quimioterapia y radioterapia combinadas (CCRT) con quimioterapia inicial durante 24 h seguido por la radiación. (D) CCRT con radiación inicial seguida de quimioterapia durante 24 h. Los dos regímenes de CCRT fueron más eficaces en la reducción de la tasa de supervivencia de las células de los padres y las esferas en comparación con el tratamiento simple, que utiliza radiación o quimioterapia (*
P Hotel & lt; 0,05).
en vivo
tumorigenicidad
para confirmar las capacidades iniciadoras del tumor enriquecidas de esferas
in vivo
, tanto las células parentales y las esferas fueron inyectadas en ratones desnudos, para el análisis de tumorigenicidad trasplantado. Esferas derivadas de células SAS dieron lugar a tumores cuando aparezca 1 × 10
se inyectaron 5 células en ratones (dos de cada tres ratones), y esferas derivadas de tumores OECM-11 células generadas cuando sólo 1 × 10
4 células se inyectaron en ratones (uno de cada tres ratones). En contraste, 1 × 10
se necesitaban 6 células parentales para generar tumores, lo que sugiere que las esferas fueron enriquecidas para células iniciadoras de tumores por lo menos 10 a 100 veces en comparación con células parentales (tabla 1). Un análisis comparativo de aspecto macroscópico entre los tumores recién generadas a partir de células parentales y esferas reveló la presencia de diferencias significativas en cuanto a tamaño y contorno. Esferas produjeron tumores de un tamaño mucho más grande con un contorno irregular, expansible en comparación con los tumores generados por las células parentales (figura 5A). Un análisis comparativo de los estudios histológicos correspondientes y los resultados de inmunohistoquímica para marcadores de EMT representativos mostraron que los tumores derivados de las esferas parecían ser más agresivos y tienen una apariencia similar a mesenquimales y prominente invasión del estroma en comparación con los tumores derivados de células de los padres. Hemos observado la expresión desigual de E-cadherina en los tumores derivados de células de los padres y una pérdida de expresión de E-cadherina en los tumores derivados de las esferas. Hubo una sobreexpresión obvio de la fibronectina en los tumores derivados de las esferas en comparación con tumores derivados de las células parentales (Figura 5B). Los cultivos primarios preparados a partir de la resección de tumores inducidos por esferas en ratones NOD /SCID demostraron una transformación gradual de la formación de esfera primaria y secundaria, lo que sugiere que las esferas tienen una capacidad potente para la auto-renovación (Figura 5C).
( a) aspecto macroscópico de un tumor representativo formado por la inoculación de células parentales y disociada esferas en ratones NOD /SCID (n = 3 en cada grupo). (B) correspondiente hallazgos histológicos y los resultados de inmunohistoquímica para marcadores de EMT de representación en NOD /SCID (magnificación, 100 ×). (C) El cultivo primario de células disociadas de las esferas inducidas por OECM-1 originalmente aisladas de ratones NOD /SCID demostraron una transformación gradual de primaria (1
st) y secundaria (2
nd) Esferas (ampliación, 100 × ).
Discusión
El concepto de células madre cancerosas y sus aplicaciones se han reportado en las últimas décadas. El término "cáncer de células madre" fue definida en 2006 por la Asociación Americana para el Taller de Investigación del Cáncer de células madre del cáncer como una célula dentro de un tumor que posee la capacidad de auto-renovación y generar los linajes heterogéneas de células cancerosas que componen el tumor [6]. Una revisión de la literatura demostró que los CAC se aislaron por primera vez por Bonnet y Dijk en la leucemia mieloide aguda, y Al Hajj fue el primero en identificar en tumores sólidos [28], [29]. Hasta la fecha, se han identificado células madre cancerosas en muchos tumores sólidos, incluyendo cerebro, mama, pulmón, próstata, y cánceres de colon [24], [25], [30] - [33] teoría .El CSC aclara no sólo la cuestión de tumor iniciación, el desarrollo, la metástasis, y la recaída, pero también la ineficacia de terapias convencionales del cáncer. Según los conocimientos actuales, el inicio, recurrencia, y la metástasis de los cánceres se puede explicar, al menos en parte, por la presencia de células madre cancerosas [6] - [8], [34]. En consecuencia, el desarrollo de un modelo fiable de los CAC se convierte en crucial para la investigación básica y clínica del cáncer.
Varias técnicas han sido utilizadas para aislar células madre cancerosas de cánceres (Tabla 2 y Figura S1). Inicialmente, como los marcadores de superficie específicos CD34 y CD38 habían sido ampliamente validado en la identificación de células madre hematopoyéticas normales, estas moléculas fueron utilizados como marcadores en los estudios originales de las células madre de la leucemia [28]. Posteriormente, CD24 y CD44 se seleccionaron como marcadores CSC en los tumores de mama [29]. Sin embargo, actualmente no existe un consenso en cuanto a la aparente "mejor marcador (s)" que se utilizará para la identificación de células madre cancerosas en cualquier tipo de cáncer en particular. Hay algunos informes demostraron que el CD44 es un marcador selectivo de células madre cancerosas de HNSCC [19], [20]. Sin embargo, nuestros datos muestran que CD24 y CD44 fueron muy presentes tanto en las células parentales y esferas (hasta 20-40%) (Figura S2). Se seleccionaron otros dos marcadores de superficie de células madre representante del CCCA, CD133 y ALDH1, para detectar el perfil de expresión de ambas células parentales y esferas [11], [14] - [18]. La expresión de CD133 y ALDH1 era normalmente ausente o muy baja en células parentales en comparación con el más alto CD133 (3-4%) y ALDH1 (20-30%) expresión en esferas. Aunque la expresión de CD133 y ALDH1 fue significativamente mayor en esferas que en las células parentales, CD133 y ALDH1 eran relativamente adecuados marcadores CSC en OSCC, pero no eran apropiados para el aislamiento de células madre cancerosas del cáncer adecuada debido a la heterogeneidad tumoral y la reproducibilidad impredecible (Figura S1 A). La identificación de marcador de superficie específico (s) para la identificación de células madre cancerosas y dianas terapéuticas sigue siendo un reto. Ordenando las poblaciones secundarios de las células cancerosas a través de intracelular Hoechst 33342 exclusión y /o la selección de las células resistentes a los fármacos de quimioterapia-también se han utilizado para la identificación y caracterización de células madre cancerosas [21] - [23], [31]. Sin embargo, el método de clasificación de las poblaciones secundarios a través de Hoechst 33342 exclusión produjo sólo un pequeño número de células madre cancerosas (0,23 a 22,3%), que es inadecuado para la experimentación adicional [21], [22], [31]. Estudios recientes mostraron que la selección CSC a través de aislamiento de células resistentes a los fármacos de quimioterapia-puede proporcionar un número limitado de células madre cancerosas (20-40%); sin embargo, la producción de grandes cantidades de células madre cancerosas era caro y consumir (Figura S1B) tiempo [17]. Estudios recientes también han sugerido que los CAC se pueden enriquecer en esferas cuando se cultivan en medio libre de suero suplementado con factores de crecimiento adecuados [11], [24] - [26]. La producción de células madre cancerosas derivadas de células CCCA cultivadas en medio libre de suero suplementado con bFGF y EGF era mucho, mucho tiempo, y el procedimiento poco rentable para la formación de esfera [11], como se muestra en la parte superior de la Figura S1C.
estudios previos revelaron que se han descrito muchos tipos de células respecto a la formación de esferoides 3D cuando se cultivan en suspensión o en un ambiente no adhesivo [35], [36]. esferoides 3D son ampliamente utilizados como modelos de estudio de la metástasis del cáncer y la invasión y para la detección terapéutico; Sin embargo, en la medida de nuestro conocimiento, ninguno de ellos menciona las propiedades de las células madre cancerosas [36] - [39]. En el presente estudio, se estableció por primera vez un modelo de formación rápida y adecuada ámbito de las líneas celulares humanas CCCA. Sobre la base de un sistema de cultivo no adhesivo, este modelo fue eficiente en el tiempo debido a las esferas se generaron en 5 a 7 días (Figura 1A). Además, este sistema de cultivo no adhesivo modificado es rentable y no requiere factores de crecimiento en comparación con el sistema de cultivo esfera anterior. No puede enriquecer solamente con éxito la formación de la esfera de las líneas celulares CCCA (SAS, OECM-1, Cal27, SCC25, y Ca922), sino que también genera esferas de líneas celulares de cáncer de otras partes de la cabeza y el cuello (Fadu y TW205), a partir de colon (HT29 y COLO320), y desde el pulmón (NCI-H23 y NCI-H661) (datos no mostrados). Cierta evidencia muestra que la formación de esferas se puede llegar en 10-15 días en un medio libre de suero suplementado con factores de crecimiento [30], [40]. Sin embargo, estas esferas son morfológicamente más probabilidades de ser agregados de cuerpos similares a uvas con contorno irregular, y no es realmente esferas, como los observados en nuestro estudio (Tabla 2 y Figura S1). En nuestro sistema de cultivo no adhesivo, las esferas aparecieron más estrechamente unida, redondo en forma de bola, y suave en el contorno. Por otra parte, la expresión de genes representante madre del cáncer de células y proteínas relacionadas, incluyendo
Sox2
,
Oct4
, y
NANOG
, se reguló en esferas en comparación con los detectados en los padres células, tanto en el ARN y los niveles de proteína (Figuras 3A y B). Utilizando el análisis de inmunofluorescencia, hemos demostrado que las esferas presentan heterogeneidad histológica explícita, así como las propiedades de CSC (Figura 3C). Pruebas de mayor resistencia terapéutica de células madre cancerosas, que es otra importante característica de estas células, se ha informado. El fenómeno de la recurrencia de muchos tipos de cáncer después de la quimioterapia o radioterapia puede ser resultado de la supervivencia y el mantenimiento de células madre cancerosas. En nuestro estudio, hemos demostrado que las esferas eran más radio y quimioresistente en comparación con las células parentales (Figura 4A y B). Debido a la diferente origen y características de SAS y las células OECM-1, no había un resultado de tratamiento diferentes en estos dos tipos de células. células SAS eran más sensibles a la quimioterapia, pero más resistentes a la radiación; por el contrario, OECM-1 células fueron más sensibles a la radiación, pero más resistentes a la quimioterapia. CCRT fue más eficaz en la reducción de la tasa de supervivencia para ambas células parentales y las esferas en comparación con un solo tratamiento con radiación o quimioterapia. Sin embargo, las esferas fueron aún más resistentes que las células de los padres cuando se utiliza el tratamiento combinado. El uso de este sistema de cultivo no adhesivo puede proporcionar una nueva visión y un nuevo modelo de células madre cancerosas que se aplica en la investigación terapéutica. Los estudios de xenotrasplantes también pueden ayudar a identificar y confirmar la capacidad consecutivamente tumorigénico de sistemas de cultivo no adhesivas. La inoculación de las dos células parentales y las esferas en ratones NOD-SCID generado nuevo tumor (s) 7 días después de la implantación y condujo a un aumento en el tamaño del tumor con el tiempo. Un análisis comparativo mostró que los tumores de esfera generada exhiben un tamaño mucho más grande con un contorno irregular, expansible en comparación con los generados por las células parentales (figura 5A). Basado en cultivo primario de las células disueltas de tumores de esfera generada, que se procesaron utilizando los mismos protocolos, esferas primarias y secundarias se han generado con éxito, lo que indica su capacidad de autorrenovación (Figura 5C). Curiosamente, los resultados histológicos e inmunohistoquímicos correspondientes mostraron que los tumores derivados de las esferas mostraron una pérdida de E-cadherina y la regulación positiva de la fibronectina, que parecía ser más agresivo, y tenía un aspecto mesenquimales-como en comparación con los tumores derivados de células parentales (Figura 5B) .
Como se mencionó anteriormente, las esferas enriquecidas cultivadas a partir de líneas celulares CCCA a través de un sistema de cultivo no adhesivo inicialmente puede llegar a ser suspendido y separado de las células de los padres, y forman pequeños racimos. Tales esferas cultivadas en una condición no adhesivo posteriormente exhiben reducidos célula-célula o interacciones célula-matriz, pierde su anclaje, y se quedaron sin hogar. Esto desencadena un fenómeno llamado "anoikis", presumiblemente resultando en respuesta apoptótica [41]. Flotantes esferas en un estado de anoikis en el medio de cultivo se aíslan y, a pesar de que tratan de adherirse, no pueden adherirse a la placa subyacente o los alrededores, que se espera para desaparecer al final. ¿Cómo pueden estas células cancerosas sobrevivir y proliferar para superar la amenaza de anoikis? ¿Qué mecanismo está implicado en la adquisición de señales de supervivencia que ofrecen la capacidad de sobrevivir y proliferar en una población flotante del tumor que carece de los andamios normales en fase sólida, que constituye un microambiente desafiado? Varios estudios han sugerido que la adversidad conocido por esferas en un estado no adhesivo, suspendido puede ser estimulada por la EMT y también fomentar la inscripción del potencial de las propiedades CSC [42], [43]. La literatura también revela que algunas vías de señalización median EMT y CSC propiedades, como WNT, Sonic hedgehog, Caracol /Slug, y Notch [44] - [46]. Cada vez hay más pruebas que sugieren que existe una relación entre la EMT y células madre cancerosas que implica la alteración de la motilidad y morfología de las células. Estos conceptos explican por qué nuestro sistema de cultivo no adhesivo se puede usar para enriquecer células madre cancerosas de líneas celulares de cáncer.
En conclusión, el uso de un sistema de cultivo no adhesivo modificado y una posterior serie de experimentos, no sólo las propiedades validado CSC de esferas aislado de líneas celulares CCCA, sino que también estableció con éxito un método rápido y económico que puede proporcionar nuevos conocimientos y un modelo de nueva aplicable a la investigación CSC.
Materiales y Métodos
Las células
la línea celular de cáncer de lengua humana SAS, obtenido de la Colección japonesa, se cultivó en DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) a 37 ° C en presencia de 5% de CO
2. La línea escamosas gingival humano de células de carcinoma con un p53 missens OECM-1, se cultivó en RPMI 1640 suplementado con 10% FBS a 37 ° C en presencia de 5% de CO
2. Estas dos líneas celulares bien establecidas fueron amablemente proporcionados por el Dr. Yi-Sheng Shieh del Departamento de Diagnóstico Oral y Patología, Hospital General Tri-Service, Taipei, Taiwán [47].
cultura Esfera
Las dos líneas celulares se cultivaron en cultivo y plástico con superficie no adhesiva. 10 cm plato son de no adhesivo para las células mediante el recubrimiento con las películas delgadas de agarosa. Las células se sembraron a una densidad de 5 × 10
4 en vivo células /placa de 10 cm, y el medio de cultivo se cambió cada dos días hasta que la formación de esferas.
La inmunohistoquímica
Las secciones de tejido o bloque de celdas se de-encerado en xileno y rehidratada en alcohol. La recuperación del antígeno se llevó a cabo mediante incubación en tampón de citrato 10 mM (pH 6,0) a 95 ° C durante 40 min. La peroxidasa endógena fue bloqueada con peróxido de hidrógeno 0,3% durante 10 min después se incubaron con suero normal de caballo 5% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 60 min a temperatura ambiente para bloquear la reacción de anticuerpo no específica. Después de un lavado con solución salina tamponada con Tris más 0,1% de Tween 20 (TBST), los portaobjetos se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios, E-cadherina (sc-8426; 1:800) y fibronetin (SC-18825; 1: 500) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA. EE.UU.). Después de ser enjuagado en TBST, los portaobjetos se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario biotinilado seguido de complejo de estreptavidina-biotina-enzima (kit streptABComplexes; Dako, Glostrup, Dinamarca). Posteriormente, se tiñeron con 0,003% tetrahidrocloruro de 3,3-diaminobencidina, por contraste con hematoxilina de Mayer, deshidratadas y montadas.
La citometría de flujo
1 × 10
6 suspensión de una sola célula a partir de células tratadas con tripsina y esferas fueron respondido en 1 ml de PBS y se tiñeron con CD133 (clon C24B9, 1:200) (Tecnología de Señalización celular, Danvers, MA) y aldehído deshidrogenasa 1 (ALDH1) (kit de ensayo ALDEFLUOR; StemCell Technologies, Durham, Carolina del Norte , ESTADOS UNIDOS). Después del marcaje, las células se lavaron con PBS tres veces y posteriormente se tiñeron con FITC o anticuerpo secundario marcado con PE durante 30 min en la oscuridad. Las células se analizaron en un citómetro de flujo después de tres lavados con PBS.
reacción en cadena de transcripción inversa de la polimerasa (RT-PCR)
El ARN total se aisló con el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, California , EE.UU.) y se cuantifica por espectrofotometría a 260 nm. En un GeneAmp® PCR System 9700 termociclador (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.), 5 g de cada uno de RNA total fue transcrito inversa con superíndice III (Invitrogen) a 55 ° C durante 1 hora en el ADN complementario total, que se utilizó como la plantilla para las posteriores reacciones y análisis de PCR. Las reacciones de PCR utilizando una desnaturalización inicial a 94 ° C durante 5 minutos, seguido de 25 o 30 ciclos a 94 ° C durante 30 segundos, la exposición a una temperatura de hibridación apropiada (58-62 ° C) durante 30 segundos, y luego una final de incubación a 72 ° C durante 45 segundos. Los cebadores de PCR para el análisis de mRNA fueron: gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), el sentido (5'-AGCCGCATCTTCTTTTGCGTC-3 ') y antisentido (5'-TCATATTTGGCAGGTTTTTCT-3');
Oct-4 , el sentido (5'-CGCACCACTGGCATTGTCAT-3 ')
y antisentido (5'-TTCTCCTTGATGTCACGCAC-3');
Nanog, el sentido (5'-AATACCTCAGCCTCCAGCAGATG-3 ')
y antisentido (5'-CTGCGTCACACCATTGCTATTCT-3 ');
Sox2, el sentido (5'-GGCAGCTACGCATGATGCAGGAGC-3')
y antisentido (5'-CTGGTCATGGAGTTGTACTGCACG-3 ') . Los productos amplificados de RT-PCR se analizaron entonces el 1% en geles de agarosa y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio y un sistema de cámaras (Transiluminador /SPOT; Instrumentos de diagnóstico, Sterling Heights, MI, EE.UU.). Las imágenes en gel de los productos de RT-PCR se exploran directamente (1-D Software ONEDscan Gel Analysis; Scanalytic Inc. de Fairfax, VA, EE.UU.), y las densidades relativas se obtuvieron determinando la relación de la intensidad de la señal a la banda de GAPDH. La expresión de genes entre la prueba (ciclosporina A tratada) y los grupos de control se comparó.
Western blotting
lisados de células enteras se separaron por electroforesis en 12% SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno . Las membranas se bloquearon con 5% de leche sin grasa a temperatura ambiente durante 1 h. Se utilizaron los anticuerpos primarios: GAPDH (ab9482; 1:5000 dilución) (Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.), Oct-3/4 (sc-8630; 1:1000), NANOG (sc-81961; 1:1000) y SOX2 (sc-17320; 1:500) (Santa Cruz Biotechnology) en tampón TBST que contiene 3% de leche sin grasa a 4 ° C durante la noche y posteriormente con anti-ratón y anticuerpo secundario de conejo anti-cabra conjugada con peroxidasa (1:1000) (Santa Cruz de Biotecnología) a 25 ° C durante 1 h. Las inmunotransferencias se desarrollaron usando un sistema de quimioluminiscencia mejorada, y la luminiscencia se visualizó en la película de rayos X.
inmunofluorescencia
Las células vivas y las esferas fueron fijadas en paraformaldehído al 4%, se permeabilizaron en 0,1% Triton X-100, y se bloqueó en 5% de suero normal de cabra PBS. Las células se incubaron con anticuerpos primarios,-3 Oct /4 (sc-8630, 1:200), NANOG (sc-81961,1:200), SOX2 (sc-17320; 1:500) (Santa Cruz Biotechnology), CD133 (clon C24B9,1:200) (Cell Signaling Technology) y ALDH1 (clon 44, 1:200) (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.) se lavaron tres veces en PBS, y luego incubadas con cabra anti-ratón o anticuerpos secundarios conjugado con FITC (verde) o PE (rojo). El DAPI se utilizó como colorante nuclear (azul). Las imágenes se obtuvieron usando microscopía fluorescente y una cámara digital.
Quimiosensibilidad y radiosensibilidad ensayo
Las células fueron sembrando en placa de 10 cm a una densidad de 1 × 10
6 células /placa. Para el ensayo de quimiosensibilidad, las células fueron tratadas con cisplatino 10-200 mM (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) durante 48 h. Para el ensayo de radioresistance, las células se irradiaron usando un sistema de radiocirugía CyberKnife (Accuray, EE.UU.) para suministrar dosis diferentes (2 a 10 Gy). fracción relativa de supervivencia de las células se determinó mediante el ensayo de MTS utilizando el CellTiter 96 Aqueous One Solution kit de ensayo de proliferación celular (Promega, Madison, WI, EE.UU.) después de 36 h de tratamiento con radiación.
In vivo
estudio de tumorigenicidad
el estudio de tumorigenicidad in vivo se realizó siguiendo las directrices del comité de ética local que tenían la plena acreditación otorgado por la Asociación para la Evaluación y acreditación de Laboratorio Animal Care en el Centro Médico de la Defensa Nacional. Los ratones se mantuvieron a 18-26 ° C, 30-70% de humedad, y de forma independiente de aire acondicionado bajo un ciclo de luz 12 h h oscuridad /12 durante 7 días antes de la inyección de xenoinjerto. Las células y esferas parentales CCCA se inyectaron en la /c ratones desnudos BALB (6 semanas). La suspensión celular (100 l) se inyectó subcutáneamente en cada ratón con diferentes números de células de 1 x 10
6, 1 × 10
5, 1 × 10
4 células. Los tumores se forman en 7 días después de la inyección. El nivel de significación estadística se fijó en 0,05 para todas las pruebas.