Extracto
Las células cancerosas interactúan con los fibroblastos del estroma circundante durante la tumorigénesis, pero las reglas complejos moleculares que regulan estas interacciones siguen siendo poco conocidos obstaculizar así el desarrollo de la terapéutica estrategias para orientar estroma cáncer. Hemos tomado un enfoque matemático para empezar a definir estas reglas al realizar el primer análisis cuantitativo a gran escala de los efectos de fibroblastos en la proliferación de células cancerosas a través de más de cuatrocientas parejas de líneas celulares heterotípicos. el modelado de sistemas de nivel de este conjunto de datos complejo utilizando la descomposición de valor singular reveló que los fibroblastos de tejido normal variable expresan al menos dos actividades funcionalmente distintos, uno que refleja transcripcional programas asociados con células mesenquimales activados, que actúan, ya sea de forma coordinada o en pugna para modular células de cáncer proliferación. Estos hallazgos sugieren que los enfoques cuantitativos pueden resultar útiles para determinar los principios de organización que gobiernan las interacciones célula-célula heterotípicos complejo en el cáncer y otros contextos
Visto:. Wadlow RC, Wittner BS, Finley SA, Bergquist H, R Upadhyay, Finn S, et al. (2009) a nivel de sistemas de modelado de la interacción con el cáncer de fibroblastos. PLoS ONE 4 (9): e6888. doi: 10.1371 /journal.pone.0006888
Editor: J. Dov Stekel, Universidad de Nottingham, Reino Unido
Recibido: Abril 1, 2009; Aceptado: July 29, 2009; Publicado: 3 Septiembre 2009
Derechos de Autor © 2009 Wadlow et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por un premio del HHMI Médico-Científico de Carrera temprana (SR) y un Premio Sidney Kimmel Ciencia traslacional (SR). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las células cancerosas interactúan dinámicamente con rodea las células del estroma. Entre los muchos tipos de células relevantes dentro de estroma cáncer, aparecen fibroblastos para funcionar prominente [1]. Sin embargo, carecemos de una comprensión clara de cómo la heterogeneidad molecular y celular dentro de este tipo de células funcionalmente contribuye a la iniciación y progresión del cáncer [2]. En parte, esto es debido a los retos experimentales inherentes en el estudio de las interacciones multicelulares. Mientras que los modelos animales cada vez más sofisticados están siendo utilizados para definir los mecanismos discretos por el que los fibroblastos contribuyen a la progresión del tumor, estos modelos no están bien adaptados para el descubrimiento sistemática a través de múltiples contextos genéticos y epigenéticos [3] - [6]. Un enfoque experimental alternativo implica el análisis de la interacción de las células cancerosas disociadas y fibroblastos in vitro [7] - [11]. Este enfoque tiene el potencial de permitir la detección molecular sistemática e imparcial de nuevos objetivos del estroma que posteriormente pueden ser validados en sistemas más fisiológicamente relevantes.
In vitro enfoques para estudiar las interacciones celulares son generalmente limitado por la elección de células específicas, las condiciones de cultivo, y ensayos. El sistema ideal sería examinar las interacciones funcionales entre las diferentes poblaciones celulares de cáncer primario y fibroblastos co-derivados de los mismos tumores. Sin embargo, las células cancerosas humanas primarias son notoriamente difíciles de propagar a largo plazo ex vivo, y fibroblastos primarios derivados de tumores parecen experimentar cambios fenotípicos en cultivo a corto plazo [6]. En contraste, las líneas celulares establecidas se cultivan fácilmente, relativamente barato, y fácilmente disponibles, lo que representa un recurso potencialmente útil y renovable para el estudio de la interacción con el cáncer de fibroblastos. Además, las condiciones de cultivo pueden influir en el comportamiento celular, sino enfoques cada vez más complejos que tratan de imitar las condiciones fisiológicamente relevantes, tales como cultivo en tres dimensiones, escalar mal [12]. Por último, los fibroblastos afectan a muchos aspectos del comportamiento de las células cancerosas que incluyen la proliferación y la supervivencia, la angiogénesis, la invasión, metástasis y resistencia a los medicamentos, pero los ensayos para anotar fenotipos cada vez más complejos pueden ser difíciles de implementar en los estudios sistemáticos.
Por lo tanto, realizamos un análisis cuantitativo y integrado utilizando modelos matemáticos de la proliferación de células de cáncer en dos dimensiones co-cultivo con un gran número de líneas celulares de fibroblastos normales. Estos estudios revelaron que los fibroblastos de tejido normal variable expresan al menos dos actividades funcionalmente distintos en la modulación de la proliferación celular del cáncer. Además, el perfil transcripcional de estas diferentes poblaciones de fibroblastos revela que al menos una de estas actividades podrían relacionarse con programas moleculares que están presentes en el mesénquima activado. modelado de sistemas de nivel puede por lo tanto ser útil para la identificación de principios de organización que en términos generales se basan las interacciones de las células cancerosas y los fibroblastos, y por lo tanto puede informar a los estudios moleculares sistemáticas de la interacción con el cáncer de fibroblastos.
Materiales y Métodos
líneas celulares y el ADN del plásmido
Las líneas celulares se adquirieron de ATCC (Manassas, VA) o Coriell Cell Repositories (Camden, Nueva Jersey). Todas las líneas de fibroblastos fueron utilizados para la co-cultivos dentro de los 10 pasajes después de la compra. líneas de cáncer y células de fibroblastos se cultivaron en de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero de ternera fetal 10% (FCS), L-glutamina (4 mM), penicilina (100 unidades /ml) y estreptomicina (100 mg /ml). etiquetado EGFP de líneas celulares de cáncer se realizó utilizando un sistema de vector lentiviral tercera generación. Las células 293T se transfectaron usando Lipofectamine 2000 en un subconfluent 10-cm plato con la pCCLsin.PPT.hPGK vector (10 g), en el que se había clonado EGFP, así como pMDLg embalaje /p (7 g) y VSV-G envoltura que codifica pMD.G plásmidos (5 g). Estos plásmidos se obtuvieron de Rafaella Sordella en el MGH Centro de Investigación del Cáncer y Luigi Naldini en el Instituto San Raffaele Telethon para la terapia génica. sobrenadante viral se recogió después de 48 horas, se filtra con un filtro de jeringa de 0,45 micras, y se almacenó a -80 ° C. líneas celulares de cáncer se infectaron en los pozos subconfluentes de placas de 24 pocillos, usando 300 l de virus en 1 ml de DMEM medio de cultivo con suero de ternera fetal 10%. Este protocolo produjo tasas de infección en exceso de 80% (determinado por la evaluación visual mediante microscopía de fluorescencia). células EGFP-negativos fueron eliminadas mediante un láser modificado 5-Becton-Dickinson FACSDiVa con técnicas estándar como se describe anteriormente [13].
co-cultivos cuantitativos
2 × 10
4 fibroblastos se sembraron en 100 l de al menos 6 pocillos replicados en cada uno de dos placas de 96 pocillos y se dejaron adherir en una monocapa confluente durante la noche. Posteriormente 10
3 células de cáncer que expresan EGFP se sembraron en un 50 l adicionales en los fibroblastos que contiene pozos y en los pocillos vacíos (150 l de volumen total por pocillo). Un lector de placa Spectramax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) se utilizó para obtener lecturas fluorescentes aproximadamente una vez al día durante 14 días (excitación 477 nm, emisión 515 nm). Se añadieron treinta microlitros de medio fresco a cada pocillo en los días 3, 6, 9, y 12. Los pocillos que contenían fibroblastos o medio solo, todos con 150 l de los medios de comunicación por pocillo en el día 0, se midieron en paralelo y los valores restados de co -Cultura y el monocultivo pozos, respectivamente, para dar cuenta de auto-fluorescencia. Todos los cultivos se realizan en DMEM con 10% de FCS
heterotípicos xenoinjertos:.
Píldoras de estradiol (0,72 mg, de liberación de 60 días, Innovative Research of America, Sarasota, FL) fueron implantados en mujeres ratones desnudos (Charles River Laboratories) dos días antes de xenoinjerto inyecciones. Los ratones se dividieron en 2 grupos: 5 ratones fueron inyectados con fibroblastos AG09877 y células de cáncer de mama T47D EGFP-expresión, y 5 ratones fueron inyectados con fibroblastos AG04351 y T47D células EGFP-expresión. Las células se tripsinizaron y se re-suspendieron en solución salina equilibrada de Hank a una concentración de 4 × 10
6 millones de células por 100 microlitros. Animales anestesiados con isoflurano fueron inyectados con 4 x 10
6 fibroblastos y 4 × 10
5 células cancerosas en el tejido subcutáneo sobre la almohadilla de grasa mamaria. señal de EGFP fue fotografiada y se cuantificó usando un sistema de imagen óptica de fluorescencia Bonsai inmediatamente después de la inyección, al día durante cuatro días, y luego cada 2-3 días. Los ratones fueron tratados de acuerdo con las regulaciones MGH Institucional de Cuidado de Animales y el empleo y se sacrificaron 43 días después de la inyección. El tejido tumoral se resecó y flash congelado. Las secciones congeladas se tiñeron con hematoxilina y eosina o con anti-citoqueratina (CAM 5.2, Becton-Dickinson).
Procesamiento de datos
Para cuantificar el efecto de los fibroblastos en el crecimiento de las células cancerosas, que se define la curva de monocultivo, que es la diferencia en el día
t
entre el medio de las mediciones de fluorescencia de los pocillos con células cancerosas, pero no los fibroblastos y la medición de fluorescencia media de los pocillos con medio solo. Hemos definido la curva de co-cultivo, como la diferencia en días
t
entre el medio de las mediciones de fluorescencia para los pocillos con las células y los fibroblastos de cáncer y la medición media de fluorescencia para los pozos con fibroblastos solo. Hemos eliminado señal constante restando el valor más pequeño día 0. En concreto, dejamos y vamos. relaciones de Co-cultivo se define como la relación del área bajo estas dos curvas. En concreto, donde
M
es el área bajo la curva, dejamos que sea los días en los cuales no tenemos mediciones e interpolado linealmente entre los tiempos de medición. Por la regla trapezoidal, España
Hemos definido
C
de manera similar a como el área bajo la curva. a continuación, definimos la relación de co-cultivo,
E
, por
Para calcular intervalos de confianza (IC) para
E
, se utilizó la unión de tres BC arranque
una de dos caras IC del 95%, calculada a partir de cada 10.000 muestras de arranque [14]. Las muestras de arranque se forman por primera elección con el reemplazo de las dos placas de 96 pocillos replicados y para entonces elegir con pozos de reemplazo de cada tipo (es decir, sólo para medios, fibroblastos, mono-cultura, co-cultivo) de las placas elegidas. La relación de co-cultivo se consideró significativa si el IC del 95% para
E
estaba completamente por encima o por debajo de uno.
El modelado matemático
La hipótesis de que un pequeño número de funcionalmente tipos de interacción distintos subyacen a la gran cantidad de puntos de datos en la matriz de los coeficientes de co-cultivo. Sospechamos que si pudiéramos determinar el número óptimo,
N
, de las matrices más simples con el que a la aproximación de la matriz de relación de co-cultivo, entonces eso óptima
N
nos daría una idea de la número de tipos de interacción funcionalmente distintos en el trabajo y las matrices que conforman la aproximación nos puede dar una idea de la naturaleza de esas interacciones.
una variedad de métodos existen para descomponer una matriz matemática en una suma de matrices simples que son en cierto sentido ortogonal o independiente el uno del otro [15]. Los modelos basados en la descomposición en valores singulares (SVD) o análisis de componentes principales (ACP) han sido más ampliamente utilizado en una amplia gama de factores biológicos, químicos, físicos y ciencias [16]. Los ejemplos incluyen la deconvolución de la información anatómica o fisiopatológico de dinámica MRI con contraste y análisis de tridimensionales relaciones cuantitativas estructura-actividad para predecir la actividad de los fármacos candidatos [17] - [19]. Elegimos SVD para nuestro análisis sobre PCA PCA desde primeros centros de los datos restando medios de fila o columna. Sin embargo, el valor cero de nuestra matriz se fijó para ser igual a una relación de AUC de 1, lo que significa la ausencia de un efecto de co-cultivo sobre la proliferación de células de cáncer. Así, para cambiar el valor cero por medio de restar habría sacrificado su significado intrínseco.
métodos de descomposición son a menudo acompañadas de estrategias de validación cruzada para distinguir los componentes significativos de ruido estadístico [20]. La estrategia de validación cruzada se optó por utilizar emplea el algoritmo EM para la estimación de los datos que faltan [21], como se detalla a continuación.
Vamos a
R
sea la matriz de diferencias entre el co-cultivo matriz de relación y 1, tal que los valores positivos de
R
corresponden a co-cultivos que estimularon la proliferación de células cancerosas y los valores negativos de
R
corresponden a co-cultivos que inhibieron la proliferación de células cancerosas. Se desea determinar una óptima
N Opiniones de
R
. Para ello, utilizamos modelos cuya complejidad aumenta con
N
para predecir el valor de cada elemento de
R
de todos los otros elementos de
R
y consideren como óptimo el
N
para la que dichas predicciones son máximamente precisa.
en concreto, para cualquier matriz
S
, vamos a denotar el elemento de
Hoteles en S
i
ª fila y
j
ª columna, dejar que denotan
S Vaya con el elemento de
S
en el
i
ª fila y
j
ª columna de falta y dejar que sea con el elemento que falta rellenar por
x
. Dejar ser la aproximación de
S
conseguido mediante la adición de la mejor
N
matrices de la descomposición de valor singular de
S gratis (es decir, los correspondientes a la
N
valores singulares más grandes). En el caso de los datos que faltan se define por el algoritmo EM para la estimación de los datos perdidos de la siguiente manera. Letand vamos
En nuestra experiencia, este algoritmo EM siempre ha convergido como
k
aumenta así que podemos dejar
Letand dejes la mediana de los más de todo el
i
y
j
. El
N Opiniones de los cuales es mínima se considera que es el óptimo
N Opiniones de
R
.
La expresión de genes de perfiles
confluentes placas de fibroblastos (que se replican las condiciones de co-cultivo) o células cancerosas en crecimiento de fase log se tripsinizaron, se centrifugaron en gránulos, y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. Se aisló el ARN con kits de Qiagen RNeasy y perfilado utilizando 2,0 microarrays con protocolos estándar [22].
Resultados y Discusión
En primer lugar, sistemáticamente co-cultivadas doce de mama humano, el melanoma Affymetrix HG-U133 Plus y líneas celulares de cáncer de pulmón con treinta y seis líneas no transformadas, de fibroblastos humanos de células derivadas de la piel normal y pulmón (ver Tabla S1 y S2 tabla para más detalles). Cada línea celular de cáncer fue etiquetado con EGFP usando transducción lentiviral para permitir la cuantificación de material compuesto de la proliferación de células de cáncer y la supervivencia más de catorce días usando un sistema sencillo ensayo basado en lector de placas. Para cada emparejamiento línea de células (n = 432), que se examinaron en múltiples repeticiones más de experimentos independientes, se calculó la relación del área bajo la curva de EGFP de células cancerosas cultivadas en co-cultivo dividido por el área bajo la curva para las células cancerosas crecido solo (Figura 1A). Se encontró que cincuenta y tres de 432 parejas de líneas celulares (12%) eran de crecimiento-estimuladoras en términos absolutos, definido por un intervalo de confianza del 95% con un límite inferior mayor que 1 (Figura 1B). Por el contrario, 176 (41%) eran inhibidor del crecimiento y 203 (47%) eran nulas. Estos datos demuestran que sólo una minoría de los emparejamientos línea celular heterotıpica brindar un aumento del crecimiento de células cancerosas.
A) Mapa de calor representación de relaciones de co-cultivo determinado experimentalmente para 432 interacciones línea celular de cáncer-fibroblastos. Rojo se refiere a las interacciones de crecimiento-estimuladoras y azul para las interacciones de crecimiento supresores. B) Las interacciones que resulta en la estimulación del crecimiento estadísticamente significativa de las células cancerosas (es decir, el límite inferior del intervalo de confianza del 95% para la relación de co-cultivo es & gt; 1) se muestran en rojo, y las interacciones que resultan en la inhibición del crecimiento estadísticamente significativo de células cancerosas ( es decir, el límite superior del IC del 95% para la relación de co-cultivo es & lt; 1) se muestran en azul. El círculo indica la interacción entre T47D y AG04351, y el cuadrado indica la interacción entre T47D y AG09877.
Para explorar la relevancia de estos co-cultivos in vivo, el próximo se centró en dos cáncer- específica emparejamientos de fibroblastos que muestran efectos proliferativos in vitro opuestos. En concreto, AG09877 estimuló la proliferación de células T47D, mientras AG04351 era inhibidor del crecimiento de esta misma línea celular de cáncer. Co-inyección de células T47D y fibroblastos AG09877 por vía subcutánea en ratones desnudos condujo a la formación de tumores pequeños más de una semana (Figura 2A y 2B). En contraste, los xenoinjertos de estas células de cáncer con fibroblastos AG04351 no dio lugar a la formación de tumores. Estos resultados confirmaron que los efectos opuestos de diferentes poblaciones de fibroblastos sobre el crecimiento de células de cáncer in vitro también pueden ser observados in vivo. T47D solo es débilmente tumorigénico (datos no mostrados) [23], [24], y el hecho de que los tumores más inducidos regresión de forma permanente después de la primera semana sugirió que el efecto de crecimiento-estimuladora de fibroblastos AG09877 era generalmente insuficiente para sostener el crecimiento prolongado de esta línea celular in vivo. Notablemente, sin embargo, un animal en realidad desarrolló un tumor persistente en el transcurso de seis semanas. El examen patológico de este tumor único reveló células cancerosas EGFP-positivas incrustados dentro de un componente del estroma desmoplásico significativa (Figura 2C). Mientras que sólo un único experimento, este resultado provocativa sugiere que los fibroblastos de crecimiento-estimuladoras identificados in vitro pueden ser capaces de ejercer tanto efectos tumorigénicos transitorios y más sostenidos sobre las células cancerosas adyacentes en vivo.
A) señal de EGFP a partir de inyecciones de EGFP-expresando células T47D con fibroblastos AG09877 (5 ratones, curva azul) o fibroblastos AG04351 (4 ratones, curva roja). Las barras de error representan el error estándar de la media. B) Representante imágenes de los ratones con xenotransplantes de cada aditivo tomado 3 días después de la inyección, con flechas blancas apuntando a los puntos de inyección. C) Las fotomicrografías de un tumor T47D-AG09877. De izquierda a derecha:. Hematoxilina y eosina, la fluorescencia de GFP, y la inmunohistoquímica para citoqueratina
A continuación tuvo como objetivo identificar los principios de organización que subyacen a la matriz de co-cultivos que podrían dar una idea de los determinantes biológicos de cáncer de fibroblastos interacción. Sistemáticamente la recreación de la matriz de interacción celular usando xenoinjertos heterotípicos podría haber ofrecido una mayor comprensión de la importancia fisiológica de emparejamientos individuales, pero no era factible para 432 interacciones diferentes. Por ello, utilizó un enfoque a nivel de sistemas para caracterizar y nuestro modelo de datos in vitro. Para empezar, la inspección superficial de los datos de la Figura 1 reveló que las líneas celulares de cáncer podrían agruparse en los que eran predominantemente inhibido (n = 3), en gran parte inhibido (n = 6), o fuertemente estimulada (n = 3) por los fibroblastos , lo que sugiere que la respuesta de crecimiento de una línea celular de cáncer en un estroma de co-cultivo dado fue pre-programado e independiente de la línea de fibroblastos emparejado (por ejemplo, la Figura 3A). Sin embargo, sólo aparece SKBR3 respuestas uniformes en todas las líneas de fibroblastos, que implican a múltiples contribuciones de fibroblastos-específica a la proliferación de células cancerosas. En varios casos, esta contribución de fibroblastos fue suficiente para anular la predisposición general de la línea celular de cáncer, lo que lleva a una interacción estimuladora del crecimiento con una línea celular de cáncer de lo contrario el crecimiento inhibido o viceversa (por ejemplo, la Figura 3B). Por lo tanto la respuesta de crecimiento de líneas celulares de cáncer de estroma de co-cultivo parecía resultar de la combinación de una contribución determinada por células de cáncer dominante y un efecto de fibroblastos más pequeño, pero a menudo críticamente importante.
A) la respuesta de crecimiento de cáncer líneas celulares (círculos) a los fibroblastos (formas oblongas) se determina principalmente por la capacidad de las células cancerosas preprogramado para proliferar en respuesta a las señales de fibroblastos genéricos (flechas negras) en un hecho común en todas las líneas de fibroblastos. Algunas líneas celulares de cáncer (verde) son el crecimiento estimulado, mientras que otros (amarillo) no responden o crecimiento inhibido. B) Las señales adicionales producidos por subconjuntos de fibroblastos (flechas rojas) añaden complejidad ya sea por la proliferación de estimular más células cancerosas (panel superior izquierdo) o compensar la falta de respuesta a las señales genéricas (panel inferior izquierdo). Aunque todas las señales en este esquema se definen como crecimiento-estimuladoras, también pueden ser inhibidor del crecimiento añadiendo así una mayor complejidad.
Aunque la figura 3B representa esquemáticamente una parsimoniosa dos modelo de señal, el número total de interacción tipos no podía deducirse fácilmente a través de la inspección cualitativa de nuestra base de datos. Por ello, utilizó el modelado matemático basado en la descomposición de valor singular para preguntar si el complejo patrón de estimulación del crecimiento y la inhibición se observó a través de este conjunto de datos resultado de un número pequeño, finito de tipos de interacción entre las células cancerosas y los fibroblastos. La descomposición de la matriz de los coeficientes de co-cultivo en una suma de
N
matrices de componentes, se utilizó una estrategia de validación cruzada de dejar uno de salida para definir el valor óptimo para
N gratis (Figura 4 , ver materiales y métodos para los detalles completos del modelo). Se encontró que la mediana de error de validación cruzada alcanzó su punto más bajo con
N
= 3, lo que sugiere que la relación de co-cultivo neto para cada emparejamiento línea celular resultante de la suma de los valores de la interacción representados por tres matrices de componentes distintos. Matrix A, que representó la mayor parte de la reducción de errores en el modelo, que se refleja la capacidad de respuesta variable de diferentes líneas celulares de cáncer a las señales del estroma genéricos producidos por los fibroblastos (Figura 5A). Por ejemplo, 9 de 12 líneas celulares de cáncer en general respondieron a fibroblastos con crecimiento lento, como se ejemplifica por SKBR3 y MCF7, mientras que tres líneas celulares de cáncer eran típicamente crecimiento estimulada, como se evidencia por BT-474 y SK-MEL-2.
licencia-un-out la mediana de error de validación cruzada cuando la matriz de relaciones de co-cultivo se aproxima por la suma de las matrices de componentes N.
A) -C) descomposición de la co -cultura matriz en 3 matrices de componentes. Cuando las líneas aplicables, cáncer y celulares de fibroblastos se dividen en dos grupos (X, verde, e Y, púrpura) de tal manera que las interacciones dentro del mismo grupo que el crecimiento-estimuladoras (es decir, positivo) contribuciones a la relación de co-cultivo estimado y las interacciones entre opuesta grupos hacen contribuciones inhibidoras del crecimiento (es decir, negativos) a la relación de co-cultivo estimada. Los valores de p se refieren a los tejidos de la segregación origen entre los grupos X e Y. Los círculos indican la interacción entre T47D y AG04351, y los cuadrados indican la interacción entre T47D y AG09877. Red se refiere a las interacciones de crecimiento-estimuladoras y azul para las interacciones de crecimiento supresores, con una intensidad que corresponde a la intensidad del efecto y ampliarse de forma independiente dentro de cada matriz.
En contraste, la matriz B y la matriz C reflejada distinta actividades de fibroblastos que se correlacionaron significativamente, pero imperfectamente con el tejido de un fibroblasto dada de origen (p = 6 × 10
-5 y p = 0,0072 para las matrices B y C, respectivamente) (Figuras 5B y 5C). En el espacio de cada matriz, los fibroblastos fueron subdivididos en dos grupos que interactúan con distintos subconjuntos de líneas celulares de cáncer de promover la proliferación de células cancerosas (verde frente a púrpura en la figura 5). Mientras que la mayoría de las líneas celulares de cáncer de interactuó en cooperación con los fibroblastos de la piel "-like" en la matriz B, una mayoría diferente a favor de los fibroblastos de pulmón "-like" en la matriz C. En consecuencia, hemos sido capaces de identificar múltiples ejemplos en los que la misma fibroblastos emparejamiento: cáncer resultó en efectos positivos sobre la proliferación de células cancerosas en una matriz y los efectos negativos en el otro (por ejemplo, T47D-AG07139), lo que sugiere que los fibroblastos podrían interactuar con las células de cáncer en al menos dos formas funcionalmente distintas.
a pesar el hecho de que la mayoría de la reducción de errores en el modelo ha sido aportada por la matriz a, en algunos casos el tamaño del efecto en matrices B y C en combinación era suficiente para anular que en la matriz A. de hecho, el análisis más detallado reveló que los efectos netos de diferentes fibroblastos en proliferación de células cancerosas sólo podían determinarse con precisión por teniendo en cuenta los
cuantitativos
contribuciones de los efectos de las tres matrices. Esto se ilustra por las interacciones entre la línea celular de cáncer de mama T47D y las dos líneas celulares de fibroblastos de la piel AG09877 y AG04351 (indicado en la Figura 1A y la Figura 5A-C por cuadrados y círculos, respectivamente). Matriz A (Figura 5A) reveló que T47D fue generalmente predispuesto a la supresión del crecimiento por todas las líneas celulares de fibroblastos. Una explicación biológica plausible para esto podría ser la expresión de un receptor de superficie celular para algún factor citostático secretada por todos los fibroblastos. Sin embargo, la matriz B (Figura 5B) se indica que la mayoría de las líneas celulares de fibroblastos de la piel tenían una actividad estimulante de crecimiento para T47D, con algunas excepciones notables, entre ellas AG04351. En teoría, esta actividad podría ser debido a la expresión por la mayoría de los fibroblastos de la piel de un factor de crecimiento mitogénico específico. En contraste, la matriz C (Figura 5C) indica que la mayoría de las líneas celulares de fibroblastos de la piel también tenían una segunda actividad inhibidora del crecimiento distinta para T47D, con la importante excepción de AG09877 y varios otros. Esta actividad plausiblemente podría atribuirse a la secreción por la mayoría de los fibroblastos de la piel de una citoquina específico inhibidor del crecimiento. Por lo tanto AG09877, mediante la expresión de la actividad de crecimiento-estimuladoras y que carecen de la actividad inhibidora del crecimiento, hizo dos contribuciones de crecimiento-estimuladoras del crecimiento funcionalmente distintos T47D que eran suficientes en combinación para anular la predisposición general de T47D de fibroblastos mediada por la supresión del crecimiento. Por el contrario, AG04351 sólo hizo contribuciones supresores de crecimiento con respecto tanto a las actividades de fibroblastos.
Para obtener una perspectiva de la identidad molecular de estas actividades de fibroblastos, se aisló el ARN a partir de fibroblastos 36 monocultivos de líneas celulares y se realizó la expresión génica basada en microarrays perfilado utilizando chips genéticos Affymetrix. En primer lugar, identificamos los genes que son expresados diferencialmente entre la piel y de pulmón fibroblastos, entre grupos X e Y en la matriz B, y entre los grupos X e Y en la matriz C. A continuación, utiliza el análisis conjunto de genes de enriquecimiento (GSEA) [25] para identificar conjuntos de genes enriquecida dentro de cada comparación. El uso de un umbral de tasa de falso descubrimiento (FDR), de 0,25, se identificaron nueve conjuntos de genes enriquecido en la piel frente a la distinción de fibroblastos de pulmón, incluyendo dos que caracterizan el fenotipo epitelial-mesenquimal transición (EMT) (Tabla 1) [26]. Aunque asociado con mayores FDR, ambos conjuntos también se enriquecieron en el B
x (piel similar) vs B
y (pulmón similares a) distinción. Por el contrario, no hay conjuntos de genes fueron marcados en el C
x (piel similar) vs. C
y distinción (pulmón similar), lo que sugiere que esta actividad de los fibroblastos o bien puede reflejar diferencias transcripcionales inducidos solamente en el contexto de co-cultivo o las diferencias no-transcripcional que no podían ser detectados con facilidad utilizando el perfil transcripcional basado en microarrays.
EMT describe un programa coordinado de fenotipos celulares cada vez más reconocido como crucial para la metástasis de las células de carcinoma. Estos fenotipos incluyen pérdida de la polaridad de las células epiteliales, aumento de la migración celular y la invasión a los tejidos circundantes [27]. Por otra parte, la evidencia reciente indica que los programas EMT también regulan las funciones celulares mesenquimales incluyendo la angiogénesis [28]. Por otra parte, el factor de transcripción Snail, un regulador maestro de la EMT, se expresa en fibroblastos activados en la curación de heridas y en la interfase tumor del estroma [29]. Así, nuestros datos sugieren que los programas de EMT se expresan preferentemente por muchos fibroblastos de la piel, tal vez que sirve como la base molecular de una de las actividades de fibroblastos (Tipo B) descrito por nuestro modelo cuantitativo
.
Más cerca de inspección del gen dos EMT conjuntos revela que muchos de los genes que impulsan el enriquecimiento en fibroblastos de la piel (es decir, los genes del núcleo enriquecido) son de superficie celular y moléculas secretadas que han sido implicados en las contribuciones del estroma a la progresión del tumor (Figura 6). Por ejemplo, metaloproteinasas de la matriz y las catepsinas, incluyendo MMP-2, MMP-12, y catepsina Z están regulados hacia arriba en el estroma del tumor y promover la proliferación del cáncer celular, la migración y la invasión mediante la degradación de las membranas basales y la exposición de señales migratorias y de crecimiento crípticos [30] . La tenascina C es una proteína matricellular que estimula la proliferación de células cancerosas y la angiogénesis [31]. N-cadherina (CDH2) se expresa en la filopodios de miofibroblastos que migran hacia las células cancerosas malignas en un beta-dependiente manera factor de crecimiento transformante [32]. SPARC (proteína secretada ácida y rica en cisteína) es otra proteína de la matriz estromal que aumenta la invasión de células de cáncer y que ha sido inversamente correlacionada con la supervivencia en pacientes con cáncer de páncreas [33], [34]. Estromal PDGFRB regula la presión del líquido intersticial y la captación del fármaco dentro de los tumores [35]. Por lo tanto los mismos genes que regulan EMT en las células cancerosas epiteliales también regulan contribuciones funcionales a la progresión maligna de la estroma tumoral. Enriquecido expresión de estos genes en fibroblastos de la piel sugiere pre-programación específica de tejido de las poblaciones mesenquimales para la funcionalidad del estroma tumoral.
Mapa de calor (derecha) y la trama de enriquecimiento (izquierda) para el gen EMT establecido a partir del análisis de GSEA oposición a la piel fibroblastos de pulmón [26].
los fibroblastos, por tanto, parecían mostrar al menos dos efectos distintos sobre la respuesta proliferativa de las células cancerosas en el co-cultivo. Es importante destacar que, a
equilibrio cuantitativo entre estas dos actividades de fibroblastos y la capacidad de respuesta general de las células cancerosas a los fibroblastos señales determinado en gran medida la relación de co-cultivo durante un emparejamiento línea celular particular. Estos efectos independientes de fibroblastos aparentemente pueden coexistir dentro de las poblaciones de fibroblastos individuales, funcional, ya sea de forma cooperativa o con objetivos opuestos con respecto al crecimiento de células cancerosas. Curiosamente, nuestro análisis sugiere que ambas actividades se segregan los fibroblastos en gran medida de acuerdo con tejido de origen. Por otra parte, los microarrays de perfiles indicó que una de estas actividades podría reflejar la expresión diferencial de un programa transcripcional coordinado asociado con células mesenquimales activados. Se requiere trabajo adicional para caracterizar completamente la base molecular de cada actividad de los fibroblastos y para evaluar la relevancia de nuestros hallazgos a la interacción con el cáncer de fibroblastos en los tumores reales
.
Este trabajo se vio limitada por la naturaleza de las poblaciones de células examinadas , en la medida en líneas celulares de cáncer establecidas y fibroblastos de tejido normal pueden no phenocopy completamente esas poblaciones de células que existen dentro de un tumor humano en evolución. Estudios adicionales con paneles de fibroblastos de mayor tamaño o más variadas también podrían identificar nuevas y diferentes patrones de actividad. Además, estos experimentos incluyeron sólo 12 líneas celulares de cáncer.