Extracto
ADN polimerasa humana ápice (ι pol) posee características de replicación de ADN altas propensas a errores y realiza ADN translesion síntesis. Puede ser especializado y estrictamente regulado en células de mamífero normales. La desregulación de ι pol puede contribuir a la adquisición de un fenotipo mutador. Sin embargo, hay pocos informes que describen el mecanismo de regulación de la transcripción de Pol ι, y existe controversia en cuanto a su papel en la carcinogénesis. En este estudio, hemos realizado la supresión y punto de mutación experimento, EMSA, chip, la interferencia de ARN y el ensayo de western blot para demostrar que c-Jun activado por la quinasa c-Jun N-terminal (JNK) regula la transcripción de ι pol en condiciones normales y células cancerosas. proteína grupo xeroderma pigmentoso C (XPC) y ataxia-telangiectasia mutada proteína relacionada (ATR) promover la activación de JNK temprana en respuesta al daño del ADN y por lo tanto aumentar la expresión de ι pol, lo que indica que el nuevo papel de la vía de señalización de JNK está implicada en el daño del ADN respuesta. Además, asociado con la actividad elevada c-Jun, la sobreexpresión de ι pol se correlaciona positivamente con el grado tumoral clínico en 97 muestras de cáncer de vejiga y puede contribuir a la hipermutagénesis. La pol mutagénesis sobreexpresada ι-involucrado depende de vía de JNK /c-Jun en las células del cáncer de vejiga que identifican mediante los espectros especial mutación. Nuestros resultados apoyan la conclusión de que la desregulación de la pol ι por JNK /c-Jun está implicado en la carcinogénesis y ofrecen una novela comprensión del papel de la pol ι o c-Jun en mutagénesis
Visto:. Yuan F, Xu Z, Yang H, Wei Q, Zhang Y, Yu J, et al. (2013) sobreexpresa ADN polimerasa Iota regulada por JNK /c-Jun Contribuye a hipermutagénesis en el cáncer de vejiga. PLoS ONE 8 (7): e69317. doi: 10.1371 /journal.pone.0069317
Editor: Spencer B. Gibson, Universidad de Manitoba, Canada |
Recibido: Marzo 7, 2013; Aceptado: June 12, 2013; Publicado: July 26, 2013
Derechos de Autor © 2013 Yuan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencia natural de China, (30770460) y la Fundación de Ciencias de la naturaleza del Ejército de China (06H026). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
las células utilizan vías de reparación del ADN para corregir eficazmente los efectos deletéreos de daño del ADN. Sin embargo, en algunos casos, no todo el daño se puede reparar con prontitud y availably, que induce la detención del ciclo celular. Para superar este bloqueo para continuar la síntesis de la cadena creciente de ADN, las células emplean los mecanismos moleculares que permiten la síntesis de ADN translesion (TLS) para producir [1], [2]. TLS se realiza mediante polimerasas especializadas de ADN, incluyendo ADN polimerasas de la familia Y-pol (À, pol κ, eta pol y Rev1), que comúnmente se presentan altas tasas de error durante la síntesis de ADN. Se ha demostrado que ι pol tiene la fidelidad más bajo en el proceso de TLS a través de muchos tipos de lesiones del ADN
in vitro Opiniones y ι pol también puede replicar el ADN en buen estado con baja fidelidad [3].
medida en que las funciones de replicación de ADN propensos a errores de ι pol, desregulación de ι pol puede contribuir a la adquisición de fenotipo mutador que, junto con el control del ciclo celular defectuoso o otros genoma vías de estabilidad, podría facilitar para acelerar la progresión del tumor. Nosotros previamente primero descubierto que las células de cáncer de mama sobreexpresan la proteína ι pol, lo que conduce a hipermutagénesis inducida por UV [4]. ι pol también está involucrado en la mutagénesis inducida por UV en las líneas de linfoma y XPV de células de Burkitt [5], [6]. Por otra parte, ι pol era preliminar encontrado que se sobreexpresa en una variedad de tejidos de tumor primario, incluyendo la próstata, útero, estómago y cáncer rectal, pero hay una falta de la valiosa evidencia clínica [7]. Sin embargo, el papel de ι pol en la carcinogénesis es todavía oscuros y bajo debate [8] y pocos informes están preocupados por el mecanismo de regulación de ι pol o el mecanismo de desregulación potencial de ι pol en el cáncer. Por lo tanto, es importante para hacer que nuestros esfuerzos para aclarar el mecanismo de regulación y para determinar el papel de la carcinogénesis Pol ι
in vivo
.
Una vía de señalización prominente activada en respuesta al estrés celular es la mitogen-activated proteína quinasa (MAPK). Tres grandes vías de MAPK se han descrito: la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK), c-Jun N-terminal quinasa (JNK) y las vías de p38 MAPK. Objetivos de la vía JNK incluyen la proteína activadora 1 (AP-1) grupo de factores de transcripción, tales como el Jun, Fos y miembros de la familia ATF [9]. Sin embargo, c-Jun fosforilada específicamente por JNK desempeña un papel central en diversas funciones de AP-1 complejo [10]. JNK puede ser activado por señales de estrés celular resultantes de citoquinas inflamatorias y agentes de daño en el ADN, mientras que AP-1 puede afectar la respuesta al daño del ADN celular mediante la regulación de la expresión de varios genes relevantes para los mecanismos de respuesta al daño de ADN [11], [12], [13]. El ex evidencia también ha demostrado que c-Jun contribuye a la transformación y el desarrollo de tumores y se clasifica como un proto-oncogén [14]. la activación de JNK se ha demostrado como un requisito para el desarrollo de diversos tipos de cáncer [15], [16], [17]. Sin embargo, ningún estudio ha informado de que aclara el papel de la vía de JNK /c-Jun en TLS y daño en el DNA inducido por hipermutagénesis. Por otra parte, la mayoría de los informes que describen la señalización de activación de la vía JNK después del daño de ADN se han centrado en la activación de JNK relacionadas con el receptor de membrana. La manera en que los mecanismos relacionadas con la respuesta al daño del ADN, contribuye a la activación de JNK en el núcleo es claro en la actualidad.
Nuestros estudios proporcionan la evidencia de que la vía de JNK /c-Jun juega un papel regulador de la transcripción crucial de ι pol. Los datos también proporcionan una visión novedosa que vía de JNK /c-Jun está involucrado en TLS y hipermutagénesis. Se determinó que la c-Jun vía de JNK /pueden ser activados por proteínas clave daño en el DNA, XPC y ATR. Además, se encontró que la sobreexpresión de ι pol estar relacionado con el grado de fosforilación de c-Jun en tejidos de cáncer de vejiga y estar asociada con la progresión del cáncer y hipermutagénesis identificado por los espectros especial mutación. Se sugiere que dysregulated ι pol por JNK /c-Jun puede funcionar como un mutador. Por lo tanto, la ADN polimerasa ápice puede ser un indicador potencial y objetivo para el tratamiento contra el cáncer en un tumor maligno.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
La investigación fue aprobado por la ética bordo del hospital del suroeste en la Tercera Universidad médica Militar (KY201016), y todos los participantes proporcionaron su consentimiento informado por escrito.
cultivo celular y tratamiento
T24, RT4 células de carcinoma de vejiga y células HEK293 fueron adquiridos de América Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, EE.UU.). Las células se mantuvieron en medio RPMI 1640, de McCoy 5A o medio DMEM suplementado con FBS 10% y una mezcla de antibióticos, respectivamente. Los inhibidores de la JNK (SP600125), p38 (SB203580) y ERK1 /2 (PD98059) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) fueron utilizados para el tratamiento de las células durante 2 horas. La exposición de las células y los plásmidos a luz UV (254 nm) se logró con un agente de reticulación ultravioleta CL-1000.
Las muestras clínicas e inmunohistoquímica
muestras de tejido carcinoma urotelial se obtuvieron de 97 pacientes por el transuretral resección de tumores de la vejiga y la cistectomía radical en el hospital sudoeste. Se recogieron todas las muestras entre 2008 y 2010. Estos tejidos fueron asignados grados patológicos de carcinoma urotelial I, II o III según la clasificación de la OMS (1973). Las secciones de tejido incluidas en parafina fijadas con formalina se deparaffinized, rehidratada en serie alcoholes graduados, y se procesaron mediante el método de la inmunoperoxidasa estreptavidina. Un anticuerpo anti-pol ι (LS-B296; Vida útil Biosciences, Seattle, WA, EE.UU.) y un anticuerpo anti-pc-Jun; se utilizaron (sc-822 Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.) a diluciones de 1:200 y 1:100, respectivamente. Los niveles de expresión de proteína se cuantificaron y se calificó mediante la evaluación de la intensidad de la señal de anticuerpos y estimando el porcentaje de células de carcinoma de urotelio teñidas positivamente [18]. Cinco campos aleatorios de vista fueron elegidos, y se analizaron 100 células por campo. La puntuación se realizó ciego sin datos clínicos. La puntuación fue catalogado como 1 puntuación (porcentaje de células teñidas positivamente & lt; 25%), 2 puntuación (25-50%), 3 puntuación (50-75%) y 4 puntuación (& gt; 75%), respectivamente. Mientras tanto, la señal de tinción fue clasificado como débil (1 puntuación), moderada (puntuación 2) y fuerte (3 puntuación), respectivamente. El porcentaje de puntuación multiplicando la puntuación de la señal era el resultado final. El marcador final fue definido bajo nivel (& lt; 6 puntuación) y el nivel de intensidad (& gt; 8 puntuación).
ensayo Western blot
La igualdad de proporciones de cada lisado de células se analizaron por SDS-PAGE [19]. Los anticuerpos se encuentran anti-pol À (ab1324; Abcam, Inc., Cambridge, Reino Unido), anti-XPC (ab6264; Abcam), anti-ATR (sc-1887; Santa Cruz), anti-c-Jun (SC- 44X; Santa Cruz), anti-pc-Jun (sc-822; Santa Cruz), anti-p-MKK4 (BS4168; Bioworld, St. Louis Park, MN, EE.UU.), anti-p-MKK7 (4171; Señalización celular tecnología, Boston, MA, EE.UU.), anti-p-JNK (sc-6254; Santa Cruz), anti-JNK (9252; Cell Signaling Technology), anti-MKP-1 (SC-1102; Santa Cruz), y anti -GAPDH (KC-5G4; Kangchen, Shanghai, china). expresión de la proteína se evaluó utilizando el kit SuperSignal West Pico (NCI4106; Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). El experimento se repitió al menos tres veces. El nivel de expresión de la proteína se cuantificó usando el software Scion imagen densitometría (Scion Corporation, Frederick, MD).
Construcción de pGL3-
POLI
deleción y mutagénesis dirigida al sitio
el -2751 /+ 63, -1832 /+ 63, -1299 /+ 63, -685 /+ 63, -275 /+ 63, -208 /+ 63, -160 /+ 63 y -126 /+ 63 de ADN fragmentos de humano
POLI
gen (con relación al sitio de inicio de la transcripción) se amplificaron a partir de ADN genómico HEK293 mediante PCR. cebadores mutagénicos fueron diseñados para la c-Jun sitio de unión dentro de -275 /+ 63 con una falta de coincidencia 2 pb (en negrita y subrayado); hacia adelante: 5'-TGAGCCGGTATTGCCACACTGTTGCCCAC-3 'y revertir: 5'-CTGCAACCTCTGCCTCCCGGATTCAAGC-3'. Los productos de PCR amplificados se insertaron entonces en el
KpnI Opiniones y
HindIII
sitios de vector pGL3-basic (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Todas las construcciones fueron confirmadas por secuenciación del ADN (Invitrogen, Shanghai, China).
Ensayos
transfección transitoria de luciferasa y
Las células (1 × 10
5) o bien fueron transfectadas con diferentes subclonado plásmidos informadores de luciferasa y pSV-β-galactosidasa o transfectadas colectivamente con pcDNA3.1-c-Jun usando el reactivo de transfección Lipofectamine (Invitrogen). Los vectores pGL3-básicos y vacíos pcDNA3.1 se utilizaron como controles. A las 48 horas post-transfección, las células se recogieron y se analizaron usando Luciferase Assay System (E1500; Promega). El pSV-β-gal (E2000; Promega) se analizó como control. El ensayo se realizó por triplicado, y cada experimento se repitió al menos tres veces.
electroforética ensayos de movilidad
Los experimentos se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente, pero con algunas modificaciones [20]. Los oligonucleótidos se marcaron con biotina un extremo 3 'del ADN Labeling Kit (89818; Pierce). Las 29 pb oligos marcados con biotina (5'-TGAGCCGGTATTGCGTCACTGTTGCCCAC-biotina-3 '; AP-1-como sitio de unión se indica en el subrayado) el mutante 29 oligos de doble cadena pb (5'-TGAGCCGGTATTGCCACACTGTTGCCCAC-3 y'; el sitio de mutación en negrita y subrayado) se utilizaron para probar la unión específica. oligonucleótidos no marcados con fueron utilizados para la competencia. El Kit LightShift quimioluminiscente EMSA (20148; Pierce) se utilizó para realizar las reacciones. Los oligos marcados (20 fmol) se incubaron con extractos nucleares (4 g) a partir de células HEK293. Después de la electroforesis en desnaturalización no en gel de poliacrilamida 6%, el gel se secó y se sometió a quimioluminiscencia. Supershift ensayos se realizaron usando un anticuerpo anti-c-Jun anticuerpo (sc-44X; Santa Cruz) y una IgG de ratón. (sc-2025; Santa Cruz)
cromatina ensayo de inmunoprecipitación
chip se realizó como se describió anteriormente [21]. En pocas palabras, después de la reticulación con formaldehído al 1%, las células HEK293 se lisaron y se sometieron a ultrasonidos. Antes de la inmunoprecipitación con anticuerpos c-Jun (sc-44X, Santa Cruz) IgG de ratón o, una pequeña alícuota de la cromatina se salvó y se utiliza como un control de entrada. El fragmento de ADN específico selectivo se midió con cebadores específicos (adelante: 5'-GCCGGTATTGCGTCACTGTT-3 '; inversa: 5'-CAGAGTGACACGCATGCCAAGGAATCG-3') para amplificar la región -236 /-61 de
POLI
gen.
Bioinformática análisis
Aproximadamente 3.000 pb de la región 5 'de acompañamiento de la
se obtuvo POLI
secuencia utilizando el algoritmo BLAST del Centro Nacional de Información Biotecnológica (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/y http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgc). sitios de unión del factor de transcripción putativo se identificaron con el software profesional TransFac 8.1 (http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html). Un análisis de predicción promotor se ha realizado mediante una base de datos en línea (http://fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)
experimentos de interferencia de ARN
c-Jun siRNA (sc-29223.; Santa Cruz), que es una piscina de 4-objetivo especial de 19-25 nt siRNAs, ATR siRNA (sc-29763; Santa Cruz), que es un grupo de 3-objetivo especial de 19-25 nt siRNAs o controlar siRNA-a (SC- 37.007; Santa Cruz) diluido en medio de transfección (sc-36868; Santa Cruz) se transfectó en células de reactivo de transfección (sc-29528; Santa Cruz). -XPC específica shRNA (5'-GGATGAAGCCCTCAGCGAT-3 ') [22] y el control no específico shRNA se sintetizaron y se inserta en un vector de lentivirus (Genechem, Shanghai, China), las células infectadas a continuación, respectivamente. Los experimentos se efectuará independientemente al menos tres veces.
mutaciones mediadas por UVC en Detección de
SupF
gen reportero
El pSupFG1 plásmido se ha descrito anteriormente [23], [ ,,,0],24]. Brevemente, el plásmido dañado UV-(10 g) se transfectó en células pretratadas con o sin SP600125. El ADN del plásmido se aisló después de 48 horas y se transforma en un
E. coli SY204
(lacZ ámbar) cepa a través de electroporación a 1800 V /20 mF. La frecuencia de mutación en el
SupF
gen informador se determinó como el número de colonias mutantes (blancas) en placas de agar dividiendo el número de colonias totales. El espectro de mutaciones de
SupF
gen en colonias blancas se demostró mediante secuenciación de ADN. El experimento se repitió al menos cuatro veces.
-PCR en tiempo real
El ARN total se aisló usando TRIzol y transcrito de forma inversa para generar ADNc (Invitrogen). curvas de amplificación se generaron mediante el control de la fluorescencia de SYBR Green (Invitrogen). Los cebadores utilizados para la amplificación fueron las siguientes: MKP-1 adelante, 5'-GTACATCAAGTCCATCTGAC-3 'y revertir, 5'-GGTTCTTCTAGGAGTAGACA-3'; GAPDH hacia delante, 5'-AAGGTCGGAGTCAACGGATT-3 'y revertir, 5'-CTCCTGGAAGATGGTGATGG-3'. El ensayo se realizó por triplicado, y cada experimento se repitió al menos tres veces.
El análisis estadístico
Los datos se recogieron al menos por triplicado y se expresan como media ± error estándar (SE). Las diferencias entre los grupos para la densitometría de expresión molecular se analizaron mediante la prueba t de Student. La significación estadística entre la expresión de Pol ι y el grado patológico de los tejidos tumorales de vejiga se estimó utilizando una prueba de chi-cuadrado. La correlación entre ι pol y la expresión de P-c-Jun se analizó con un ensayo de dos variables. software SPSS13.0 se utilizó para llevar a cabo el análisis estadístico (p & lt; 0,05 se consideró significativo). Los datos de inmunotransferencia, EMSA y el análisis de cortes eran representativos de al menos tres a cinco estudios independientes con resultados reproducibles.
Resultados
c-Jun es un factor de transcripción crítico para
POLI
gen
Teniendo en cuenta los indicios experimentales mostraron que la expresión alterada de ι pol puede estar asociada a hipermutagénesis y la carcinogénesis, que en primer lugar aclarar su mecanismo de regulación transcripcional. Para mapear la actividad del promotor mínimo y las secuencias reguladoras, se analizaron humana
POLI
gen identificado por la bioinformática y el promotor básico de
POLI
gen con un putativo AP-1
cis
-elemento. Una serie de deleciones en la región flanqueante 5 'de
POLI
genes se subclonaron en el vector pGL3-básica (un vector indicador de luciferasa). Los cebadores se enumeran en la Tabla 1. Las actividades de estas construcciones se evaluaron en base a la actividad de la luciferasa después de la transfección transitoria en células HEK293, células de una línea de uso común como células de herramientas. Nuestros resultados mostraron que el mínimo
POLI
promotor está situado en la región -275 /+ 63 (Fig. 1A). Otros análisis demostraron que la región (-275 /-208) contiene un putativo AP-1-como unión
cis
-elemento (TGCGTCA) en el sitio -228, que es similar con la AP- altamente conservadas evolutivamente 1 secuencia de TGAGTCA (fig. 1B) de unión.
(A) la actividad de luciferasa de las supresiones de 5 'de acompañamiento región de
POLI
gen se normalizó por β-
gal
actividad. Cada barra representa la media ± SD de al menos tres experimentos independientes. (B) Las representaciones esquemáticas de la parte distal
POLI
región promotora. (C) las actividades de la transcripción de la eliminación o mutante de
POLI
promotor. * Diferencia estadísticamente significativa en comparación con el pGL3-275 /+ 63 y pGL3-275 /+ constructo 63MU (p & lt; 0,01; prueba t de Student). (D) Ensayo de la EMSA. ensayo (E) chip. IgG de ratón como control negativo. El ADN de entrada o sin ADN añadido se utilizaron cada uno como control positivo y blanco, respectivamente.
Además, para aclarar la función de regulación de la transcripción de esta unión
cis
-elemento , se realizó un análisis de la mutagénesis de la región -275 /+ 63 del gen
POLI
. Un vector designado pGL3-275 /+ 63MU (un motivo de unión mutada AP-1-like) se construyó con dos mutaciones puntuales (TGCcaCA). Curiosamente, la actividad luciferasa fue severamente atenuada en pGL3-275 /+ 63MU (Fig. 1C, columna izquierda). c-Jun juega un papel central en diversas funciones del complejo AP-1, por lo tanto, que transitoriamente co-transfectadas HEK293 células con los constructos y pcDNA3.1-c-Jun para determinar si c-Jun podría activar el
POLI
promotor. El resultado de la co-transfección de luciferasa reveló que era el más activa significativamente en pGL3-275 /+ 63, aunque se observó pGL3-275 /+ 63MU y pGL3-208 /+ 63 para ser también aumentó (Fig. 1C, columna derecha) . Es posible que la secuencia puede contener elementos reguladores adicionales indirectamente controlados por el overexpressed c-Jun que no fueron identificados por nuestro estudio. Sin embargo, nuestros datos sugieren que todavía c-Jun eficiente puede activar la transcripción de
POLI
gen
a través de
la AP-1
cis
-elemento en el sitio -228.
para comprobar que la c-Jun se une directamente al motivo en el
POLI
promotora, EMSA se realizó utilizando extractos nucleares a partir de células HEK293. Una banda desplazado fue especialmente producida y análisis supershift con un anticuerpo anti-c-Jun demostró que la banda realmente contenida proteína c-Jun (Fig. 1D). Para hallar la prueba de c-Jun uniéndose directamente a la región
in vivo
, chip fue también realizada con un anticuerpo anti-c-Jun para precipitar la cromatina de las células HEK293 (Fig. 1E). En combinación con las conclusiones anteriores, c-Jun parece unirse directamente a la
POLI
promotor y constitutivamente activar la expresión de Pol ι en células HEK293.
La sobreexpresión de ι pol se depende de activado JNK /c-Jun
está bien documentado que las ADN polimerasas, incluyendo translesion ι pol, pueden desempeñar un papel importante en la respuesta al daño del ADN. Hasta la fecha, los ciertos tipos de daño en el ADN, que es capaz de ser anuladas por ι pol son todavía oscuros y controvertidos. Examinamos ADN expresión daño inducido de ι pol, que no se observó ser inducida por algunos tipos de daño en el ADN, incluyendo cisplatino, bleomicina y etopósido (datos no publicados). Sin embargo, muchas evidencias apoyan la idea de que una de las características predominantes de ι pol es la propensión de incorporar de forma incorrecta los nucleótidos opuestos algunos tipos de lesiones del ADN, que incluyen dímeros de pirimidina ciclobutano y 6-4 pirimidina distorsión pirimidona foto aducto siguientes daños UV [8 ], [25]. Más importante aún, hemos podido comprobar que ι pol se puede inducir de manera significativa a los rayos UV en el estudio anterior [4].
Con el fin de definir el papel de JNK /c-Jun en el TLS mediada por ι pol, elegimos irradiación UV (UVC 254 nm) como el modo de estudio del daño del ADN. Para determinar si la expresión pol ι inducida por UV es controlada por la actividad de JNK /c-Jun, se verificó que la expresión de ι pol fue rápidamente inducido por la exposición de las células HEK293 a UVC luz de 30 J /m
2 (a dosis media apropiado [26]) y permaneció elevada durante 2-8 horas, lo que era concomitante con la activación de c-Jun y JNK después de la irradiación UV (Fig. 2A). La actividad del promotor de la construcción pGL3-275 /+ 63 también aumentó aproximadamente 3 veces después de 2 horas de los rayos UV a la misma dosis (Fig. 2B).
(A) La cinética de ι pol, p -JNK expresión y pc-Jun bajo los rayos UV en las células HEK293. (B) El efecto de los rayos UV sobre la actividad de la
POLI
región promotora. * Diferencia estadísticamente significativa en comparación con el pGL3-275 /+ 63 y pGL3-275 /+ constructo 63MU (p & lt; 0,01; prueba t de Student). ** Diferencia estadísticamente significativa en comparación con las células tratadas con o sin UV (p & lt; 0,01). (C) La expresión de Pol ι, c-Jun y p-c-Jun en RT4 y las células de cáncer de vejiga T24. La expresión de ι pol se observó en las células (D) HEK293, T24 y RT4 tratados con diferentes concentraciones de SP600125 cultivadas para longitudes diferentes adicionales de tiempo; células (E) HEK293 tratados con PD98059 o SB203580; células (F) HEK293 tratadas con o sin SP600125 y UV; células (G) HEK293 transfectadas con siRNA-c-Jun durante 48 horas. El siRNA no específica se utiliza para el control. valores densitométricos se indican a continuación cada panel.
A la luz de los resultados, hemos tratado de confirmar si JNK /c-Jun es el factor clave de la regulación de la expresión de Pol ι en el mecanismo general. Se comparó la diferente expresión de ι pol, c-Jun y p-c-Jun en RT4 (una línea celular bien diferenciado del tumor de bajo grado) y T24 (una línea celular representa un alto grado invasivo del tumor) células de cáncer de vejiga. Como se muestra en la Fig. 2C, la expresión de ι pol en células T24 era notable mayor que en RT4, mientras que la expresión de c-Jun y la actividad de p-c-Jun se mejora también. Los tiempo o dependientes de la dosis inhibiciones de pol ι se observaron en las células del cáncer de vejiga HEK293, T24 y RT4 pre-tratada durante 2 horas con un inhibidor de JNK-específico (SP600125) (Fig. 2D), a pesar de que la expresión de pol ι en HEK293 células parecían aumentar a las 48 horas. Puede ser la inhibición de la SP600125 a la actividad de JNK que dura sólo durante 48 horas, que causan la expresión de pol ι recuperó en 48 horas después del tratamiento SP600125. Como control, la expresión de la pol basal ι no se observó alteración en las células HEK293 pre-tratados con PD98059 y SB203580 (inhibidor específico de ERK y p38, respectivamente) (Fig. 2E). Los resultados muestran que la activación de la vía de JNK /c-Jun no sólo es responsable de la expresión de pol ι en las células normales, pero también contribuye a la desregulación potencial de ι pol en células de cáncer de vejiga. Además, demostró que la JNK /c-Jun también regula directamente la basal y expresiones inducidos por UV de ι pol. Cuando las células HEK293 fueron pre-tratados con SP600125 (20 M), la expresión de pol ι se redujo a 4 horas después de la exposición UV de 30 J /m
2 (Fig. 2F). Y c-Jun caída redujo notablemente la basal y la expresión inducida por UV de Pol ι (Fig. 2G). En conjunto, estos datos sugieren que la sobreexpresión de ι pol se depende en gran medida de la vía de JNK /c-Jun activado.
ATR y XPC promueven p-JNK para regular la expresión pol ι en respuesta al daño UV
Nuestro hallazgo nos llevó a examinar por encima de la señalización de MAPK aguas arriba. Una función de señalización de respuesta al daño del ADN se ha convertido, que puede, además de membrana indirecto conocido o de señalización citoplásmica, activar la vía de MAPK a través de la señalización nuclear [27]. Por lo tanto, hemos desarrollado la hipótesis de que JNK /c-Jun vía responsable de la expresión pol ι inducida por UV también puede estar regulada por la respuesta al daño del ADN. Se evaluó el efecto de las proteínas de respuesta al daño de ADN XPC y ATR de la extensión de la fosforilación de JNK y de expresión pol ι con daño UV. Con las células T24 siRNA-ATR o shRNA-XPC, la HEK293 silenciada y ambos expresaron niveles más bajos de ι pol siguientes los rayos UV, y p-JNK se reduce correspondientemente. Por el contrario, en ausencia de los rayos UV, la expresión de ι pol o p-JNK no se alteró significativamente por ATR y la inhibición XPC, aunque se observó la p-JNK para ser ligeramente mayor por shRNA sistema lentivirus (Fig. 3A, 3B, 3C y 3D). Este resultado puede ser explicado por la potencial reacción de estrés celular específica del sistema de lentivirus. Por lo tanto, ATR y XPC están implicados en la señalización de JNK inducida por UV, que regulan la expresión de ι pol en células normales y células de cáncer de vejiga.
expresión de la proteína se investigó en diferentes células con un tratamiento diferente. (A) Las células HEK293 transfectadas con siRNA-ATR. (células B) HEK293 infectadas con el shRNA-XPC. (células C) T24 transfectadas con siRNA-ATR. células (D) T24 infectadas con el shRNA-XPC. (E) Un análisis de PCR en tiempo real de la expresión de MKP-1 en las células HEK293 no tratados o tratados con siRNA-c-Jun, siRNA-ATR o shRNA-XPC; los niveles de ARNm de GAPDH se determinaron como un control interno. * Diferencia estadísticamente significativa en comparación con las células HEK293 con o sin tratamiento (p & lt; 0,01; prueba t de Student). (F) MKP-1 y la expresión de proteínas en células HEK293 tratados con siRNA-ATR o shRNA-XPC. Se utilizó el siRNA no específica o no específica shRNA-lentivirus de control. valores densitométricos se indican a continuación cada panel.
En la red de regulación MAPK, JNK es fosforilada y activada por los MAPKKs de especificidad dual, incluyendo MKK4 /SEK1 y MKK7. actividad JNK sostenida se ha atribuido a la desfosforilación alteración de JNK por la MAP quinasa fosfatasa-1 (MKP-1) [28]. Para evaluar cómo ATR y XPC activan la vía de JNK, se investigó si MAPKK señalización regulada por ATR y XPC en respuesta a los rayos UV. Primero se determinó el grado de fosforilación inducida por UV de MKK4 y MKK7. En relación con las células de tipo salvaje, no se observó ningún cambio claro en la expresión de p-MKK4 o p-MKK7 en Atr- y las células HEK293 y T24 XPC-silenciada; esto puede reducir la posible participación de ATR y XPC en la activación directa MAPKK señalización (Fig. 3A, 3B, 3C y 3D), mientras que la expresión de MKP-1 fue significativamente mayor en el Atr- y células HEK293 XPC-silenciada tras el daño UV (Fig. 3E y 3F). Colectivamente otros resultados, nuestros hallazgos implican que la proteína de respuesta al daño del ADN ATR y vía de JNK influencia XPC y regulan la transcripción de Pol ι mediante la reducción de la señal inhibidora de MKP-1 en lugar de la activación de MKK4 y MKK7.
La expresión elevada de pol ι se asocia con la actividad de c-Jun y la malignidad en el cáncer de vejiga humana
células uroteliales están continuamente expuestos a muchos tipos de reactivos de daño en el DNA que están presentes en la orina a partir de aminas aromáticas industriales, el humo del cigarrillo y la absorción de productos químicos drogas [29]. La disfunción de respuesta al daño de ADN se ha implicado como un factor crucial subyacente a la aparición de inestabilidad genética en la carcinogénesis urotelial. Por otra parte, ι pol, que es la propensión a incorporar de forma incorrecta los nucleótidos opuesto de las lesiones del ADN se expresión anormal en muchos tipos de cáncer, aunque los mecanismos no están claros. En consecuencia, hemos hecho un esfuerzo para determinar si Pol ι juega el papel potencial mutagénico en el cáncer de vejiga que es alta heterogeneidad y la recurrencia [29]. Se examinó la expresión de la pol ι en los tejidos tumorales de vejiga 97 por análisis inmunohistoquímico. pol ι proteína se localiza principalmente en los núcleos, y se observó una pequeña cantidad en el citoplasma. Este resultado reveló que la expresión de pol ι fue significativamente mayor en los tumores de vejiga de alto grado que en los tumores de bajo grado (Fig. 4A). El análisis estadístico indicó que existía una fuerte asociación entre la expresión de pol ι y el grado patológico de los tejidos tumorales de vejiga (Tabla 2; p & lt; 0,01). También se observó expresión pol ι a ser elevados en tejidos de cáncer de vejiga en comparación a los lados de carcinoma de tejidos por transferencia de western (Fig. 4B). Estos resultados sugieren que la expresión de pol ι puede servir como un indicador de la enfermedad maligna y la progresión de carcinomas uroteliales.
(A) pol ι proteína se expresa de forma aberrante en diferente grado del tumor de acuerdo con la clasificación de la OMS. A1 es un tumor de grado I-; A2 es un tumor de grado II; A3 es un tumor de grado III-(magnificación × 400). (B) La expresión de pol ι en 5 pares de lados de carcinoma de vejiga y cáncer de los tejidos. "N" se representó lados de carcinoma de tejido, "C" se representó el tejido de cáncer. valores densitométricos se indican a continuación cada panel. (C) Casos representativos de la concordancia de ι pol y la expresión de P-c-Jun en el cáncer de vejiga. C1 y C2 se mostraron respectivamente la alta expresión de ι pol y p-c-Jun en unos pares de simple. C3 y C4 fueron la baja expresión en otros pares (× 100 y 400 × magnificación).
Para determinar si la sobreexpresión de los resultados pol ι de la desregulación de la activación de JNK /c-Jun
in vivo
, se analizó la concordancia de ι pol elevada y una actividad anormal de c-Jun en los tejidos de cáncer de vejiga. Se seleccionaron al azar 41 tejidos tumorales de vejiga incluidos en parafina de un total de 97 muestras de pacientes. El nivel de p-c-Jun era en su mayoría de acuerdo en la expresión de la pol ι (Fig. 4C). La expresión de p-c-Jun se asoció positivamente con elevada expresión pol ι en los cánceres de vejiga (Tabla 3; r = 0,662, p & lt; 0,01). El resultado refuerza la conclusión de que c-Jun regula positivamente la expresión de Pol ι y sugiere que la PC-Jun anormal contribuyen a la expresión desregulada de Pol ι implicados en la progresión del cáncer de vejiga.
La sobreexpresión de ι pol activado por JNK /c-Jun promueve hipermutagénesis inducida por UV en las células T24
Para evaluar la importancia de la sobreexpresión de ι pol y pc-Jun
in vivo
, se analizó el potencial papel en hypermutagenic células de cáncer de vejiga.