Extracto
El cáncer de páncreas (PDAC) es una enfermedad letal con una supervivencia a cinco años del 3-5%. Las mutaciones en K-ras se encuentran en casi todos los casos, pero K-Ras mutaciones por sí solos no son suficientes para el desarrollo del PDAC. Otros factores contribuyen a la activación de la señalización de Ras y conducen a la formación de tumores. La galectina-3 (Gal-3), una proteína de unión a β-galactósido multifuncional, es altamente expresado en PDAC. Por ello, investigó el papel funcional de Gal-3 en la progresión del cáncer de páncreas y su relación con la señalización de Ras. La expresión de Gal-3 se determinó por inmunohistoquímica, Q-PCR y de inmunotransferencia. Los estudios funcionales se realizaron con líneas de células pancreáticas de ingeniería genética para expresar niveles altos o bajos de Gal-3. la actividad de Ras se examinó mediante ensayos de pull-down Raf. Co-inmunoprecipitación e inmunofluorescencia se utilizaron para evaluar las interacciones proteína-proteína. En este estudio, hemos demostrado que Gal-3 fue altamente regulados hasta en tumores humanos y en un modelo de ratón mutante K-Ras de PDAC. Baja regulación de Gal-3 por lentivirus shRNA disminución de la proliferación celular y la invasión PDAC in vitro y la reducción del volumen y el tamaño del tumor en un modelo de ratón ortotópico. Gal-3 enlazado Ras y se mantiene la actividad de Ras; baja regulación de Gal-3 disminución de la actividad de Ras, así como la señalización de Ras corriente abajo incluyendo la fosforilación de ERK y AKT y Ral Una actividad. La transfección de Gal-3 cDNA en células PDAC con bajo nivel de Gal-3 aumenta la actividad de Ras y su señalización corriente abajo. Estos resultados sugieren que Gal-3 contribuye a la progresión del cáncer de páncreas, en parte, mediante la unión y la activación de Ras señalización Ras. Gal-3 puede por lo tanto ser una diana potencial para esta enfermedad mortal
Visto:. Canción S, Ji B, Ramachandran V, Wang H, M Hafley, Logsdon C, et al. (2012) sobreexpresa galectina-3 en el cáncer de páncreas induce la proliferación celular y la invasión mediante la unión y activación de Ras señalización Ras. PLoS ONE 7 (8): e42699. doi: 10.1371 /journal.pone.0042699
Editor: H. Fazlul Sarkar, Wayne Facultad de Medicina de la Universidad del Estado, Estados Unidos de América
Recibido: 23 de febrero, 2012; Aceptado: 10 de julio de 2012; Publicado: 10 Agosto 2012
Copyright: © Song et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue financiado por los Institutos nacionales de la Salud Instituto de cáncer /Nacional conceder R01CA69480 (RSB), Premio Americana de Gastroenterología Asociación de Investigación Académico (S. canción), y el Servicio de Salud Pública de subvención DF56338, que apoya las Enfermedades del Aparato Digestivo del Centro Médico de Texas Center (S. Song) . Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
pancreático adenocarcinoma ductal (PDAC) es actualmente la cuarta causa principal de muerte relacionada con el cáncer, con un estimado de 43.140 nuevos casos y 36.800 muertes en los Estados Unidos [1]. Debido a su crecimiento agresivo, diseminación metastásica temprana y la falta de terapias eficaces, la tasa de supervivencia de cinco años para esta enfermedad se mantiene en un 3-5% [2]. Por lo tanto, se ha hecho un esfuerzo considerable para entender los eventos moleculares que pueden conducir la patogénesis de la PDAC. Entre las numerosas alteraciones moleculares identificados en PDAC, las mutaciones en el pro-oncogén K-Ras se encuentran en casi todos los casos [3] y es un evento temprano para el desarrollo de PDAC [4]. K-Ras mutaciones por sí solos no son suficientes para el desarrollo del PDAC. mutaciones K-ras se encuentran a menudo en la pancreatitis crónica y pueden incluso ser encontrados en individuos normales [5]. Por otra parte, K-Ras mutación en un modelo de ratón con baja actividad Ras no conduce espontáneamente al desarrollo de PDAC [6], mientras que K-Ras mutación en un modelo de ratón con un alto nivel de actividad de Ras se asocia con rápido desarrollo de CP con abundante fibrosis y la progresión a PDAC que imita la enfermedad humana [3]. Por lo tanto, se ha propuesto que es la actividad de K-Ras en lugar de la presencia de la mutación per se que es el parámetro biológicamente relevante asociada con la patogénesis de cáncer de páncreas [2]. se requieren factores adicionales que contribuyen a la actividad de Ras; sin embargo, son en gran parte desconocidos los mecanismos por los cuales se activa aún más la actividad Ras.
galectina-3 (Gal-3), una proteína b-galactósido vinculante exhibe funciones biológicas y patológicas pleiotrópicos, y se ha implicado en la celda el crecimiento, la diferenciación, la adhesión, el procesamiento del ARN y la transformación maligna [7] - [10]. Gal-3 se encuentra en varios compartimentos celulares, incluyendo el citoplasma, la superficie celular, el núcleo, y Gal-3 también es secretada [11]. La importancia de Gal-3 expresión ha sido evaluada en muchos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de páncreas [12] - [16]. Varios estudios han indicado que Gal-3 ARNm es regulada en los tejidos tumorales pancreáticas en comparación con los tejidos de control [15], [17], [18], [19], y la supresión transitoria de la galectina-3 se ha informado de inducir páncreas la migración del cáncer celular y la invasión [16]. Wang et al encontró que Gal-3 fue también hasta reguladas en la pancreatitis crónica y sugirió que estaba implicado en los cambios tanto de la matriz extracelular (ECM) y la formación de complejos ductal [20]. Sin embargo, el significado completo de Gal-3 en PDAC sigue siendo poco clara y poco se sabe acerca de los posibles mecanismos de función de Gal-3 en la patogénesis de la PDAC. Recientemente, Kloog y colegas demostraron que K-RAS GTP recluta Gal-3 desde el citosol a la membrana plasmática donde se convierte en un componente nanocluster integral. El nivel citosólico de Gal-3 determina la magnitud de K-Ras GTP nanoclustering y señal de salida en células de cáncer de mama [21]. Más recientemente, las observaciones de un mismo grupo demostraron que la asociación K-Ras con Gal-3 contribuye a la malignidad de tiroides [22]. Dado que las mutaciones en K-Ras son casi universales en PDAC y el nivel de actividad de Ras parece ser un mecanismo clave para controlar el desarrollo de la PDAC, hemos tratado de determinar si Gal-3 afecta a la actividad de Ras contribuye a la patogénesis del cáncer de páncreas.
en este estudio, se evaluaron sistemáticamente la expresión de Gal-3 en 120 tejidos pancreáticos humanos pareadas de páncreas normal, pancreatitis y tumores pancreáticos, y por primera vez determinó la expresión de Gal-3 en los tejidos y células tumorales derivadas de un modelo de ratón mutante K-Ras de cáncer de páncreas. Hemos ampliado los resultados de estudios anteriores, y delineado aún más la función de Gal-3 in vivo e in vitro con respecto a la formación de cáncer de páncreas. Gal-3 expresión se incrementó en los cánceres de páncreas y células de cáncer, y estimuló la proliferación de células de cáncer de páncreas y la invasión y el crecimiento tumoral promovido. Gal-3 se une Ras y aumenta la actividad de Ras y de señalización corriente abajo. Estas observaciones apoyan la conclusión de que Gal-3 puede ser una diana potencial para esta enfermedad mortal.
Materiales y Métodos
Los estudios relacionados con los animales han sido aprobados por el Centro IACUC institucional MD Anderson Cancer comité (ACUF 09-04-08832). Todos los otros estudios presentados en este informe fueron la iniciada por el investigador y no requería la aprobación de otros organismos reguladores.
Células y reactivos
líneas celulares Paca Humano (L3.6pl, BxPC-3, Mpanc96, Panc-1, y MiaPaCa-2) fueron proporcionados amablemente por el Dr. C. Logsdon (Departamento de Biología del cáncer) y el Dr. S. Guha (Departamento de Gastroenterología, Hepatología & amp; Nutrición) del Centro de cáncer MD Anderson y UT se han descrito anteriormente [23], [31]. Todas las identidades de líneas celulares fueron verificadas por la huella de ADN. Las células fueron cultivadas en RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y antibióticos (100 mg /ml de estreptomicina y 100 IU /ml de penicilina). Se obtuvo el anticuerpo anti-Gal-3 como se describe anteriormente [8]. Anti-Ras anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal anti-Rala, anti-fosfo-AKT y los anticuerpos anti-fosfo-ERK eran de Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA). Anti-ciclina D1 y anticuerpo anti-c-myc fue de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA).
aislamiento de proteínas y análisis de inmunotransferencia
Un total de lisados celulares de cáncer pancreático humano incluidos y un modelo de ratón K-Ras G12D [25] se prepararon en tampón de lisis SDS 2% como [9] se describe anteriormente. Citoplasmática y extracciones nucleares se prepararon usando NE-PER nucleares y citoplasmáticas de extracción Reactivos (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) según las instrucciones del fabricante. Se realizaron análisis de Western blot como se describe anteriormente [9].
Generación de Gal-3 estable silenciamiento y líneas de células que sobreexpresan PADC con lentiviral shRNA
Para producir lentivirus de Gal-3 sobreexpresión (L- Gal3) o Gal-3-shRNA (A3), pLVTHM-Gal3 o pLVTHM-shGal3, respectivamente, y el control de vectores se cotransfectaron con el plásmido de empaquetamiento (MD2G) y plásmido de la cubierta (PAX2) requerido para la producción viral en 293FT células usando lipofectamina 2000 reactivo (Invitrogen). Medio que contiene lentivirus con Gal-3 shRNA (llamado A3) y el vector de control (llamado GN10) se utilizó para transducir Mpanc96, MiaPaCa-2 y líneas de células Panc-1 con altos niveles de Gal-3 expresión. Medio que contiene lentivirus con Gal-3 sobreexpresión (llamado L-gal-3) y el vector de control (llamado V) se utilizó para transducir líneas celulares BxPC-3 y L3.6pl PACA con baja expresión de Gal-3. clasificación de células se llevó a cabo en un ARIA clasificación de células activadas por fluorescencia citómetro de flujo (BD Biosciences). Gal-3 de expresión de líneas celulares estables se confirmó adicionalmente mediante bloting Western.
proliferación de las células de ensayo
La viabilidad celular se midió usando el One Solution kit ensayo de proliferación celular CellTiter acuosa como se describe [24].
ensayo de formación de colonias en agar blando
5 × 10
3 MPanc96 células que expresan de forma estable pLVTHM-shRNAGal3 o pLVTHM control de vectores se mezclaron con agar al 0,6% en DMEM. Las mezclas de células /agar se colocaron en placas de 6 pocillos recubiertas con agar al 0,3% por triplicado. Las células se incubaron a 37 ° C durante 10 días. Las colonias se tiñeron con Diff-Quik (Dade Behring). El experimento se repitió tres veces de forma independiente.
se realizaron Co-inmunoprecipitación
Co-inmunoprecipitación en GN10 control y Gal-3 células shRNA A3 de ambas células Panc-1 y Mpanc96 como se describe [9 ].
Ras y Ral Un ensayo de actividad
Igual cantidad de proteína lisado celular de las células de control o células GN10 gal-3 A3 shRNA de Panc-1 y Mpanc96 o BxPC-3 L-gal -3 y su control BxPC-3 V se incubaron durante 45 min a 4 ° C, con perlas de agarosa recubiertas con Raf1-RBD para la actividad de Ras, total o perlas de agarosa recubiertas con Ral BP1 de agarosa para el total de Ral Una actividad (Upstate Biotechnology, Inc. , Lake Placid, Nueva York). entonces perlas se lavaron y la proteína unida se eluyó con 2 x tampón de muestra de Laemmli que había sido precalentado a 95 ° C y se analizaron por inmunotransferencia para Ras usando el anticuerpo anti-Ras o actividad rala usando el anticuerpo anti-rala.
Matrigel invasión ensayo
La capacidad invasiva de las células se determinó mediante el uso de cámaras de invasión recubiertas con Matrigel con el tamaño de 0,8-micras de poro (BD Biosciences). Se añadió una suspensión de una sola célula que contiene 1 × 10
5 células a la cámara interior. Después de 16 h de incubación a 37ºC en 5% de CO2, las células en la superficie superior de la cámara interior se eliminaron con hisopos de algodón. células invadidas que se adhirieron en la superficie inferior de la membrana se fijaron, se tiñeron con Diff-Quik (Dade Behring), y se contaron.
tinción de inmunofluorescencia indirecta y microscopía láser confocal
indirecta tinción de inmunofluorescencia en se realizaron las células BxPC-3 como se describe [9]. Expresión y localización de las proteínas se observaron bajo un sistema de microscopio confocal (FluoView FV500; Olympus, Melville, NY) y se analizaron mediante CellQuest software Pro (BD Biosciences, San Jose, CA) a la Citometría de Flujo e Imagen Core Laboratorio de Análisis de la Universidad del Centro de cáncer de Texas MD Anderson.
en tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa
Para cuantificar los cambios en los niveles de ARNm de Gal-3, en tiempo real RT-PCR se realizó en el ABI Prism 7900 ( Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando el ensayo disponible comercialmente para la expresión de genes de Gal-3 (Mm00802901_m1), y la ciclofilina a (4326316E; Applied Biosystems) como se describe anteriormente [9]. El software 7900 Sequence Detection System 2.2 (Applied Biosystems, Foster City, CA) determina automáticamente el cambio de tapa de Gal-3 en cada muestra utilizando el método δδCt con una confianza del 95%.
La inmunohistoquímica
tinción inmunohistoquímica para Gal3 se realizó en portaobjetos de tejido de microarrays que consta de 125 adenocarcinomas ductales pancreáticas y sus tejidos pancreáticos no neoplásicas apareados de pacientes que se sometieron a pancreaticoduodenetomy en el MD Anderson Cancer Center. Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de M. D. Anderson Cancer Center. Después de la recuperación de antígeno y el bloqueo de la peroxidasa endógena, las secciones se incubaron con anticuerpo contra Gal3 (1:100 dilución) a 4 ° C durante la noche, después se incubó con el anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 60 min. análisis inmunohistoquímico avidina-biotina estándar de las secciones se realizó según las recomendaciones del fabricante (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Los resultados de la tinción fueron evaluadas por un patólogo (HW) sobre la base del porcentaje de la tinción en las células tumorales (0, sin tinción; 1, ≤10%; 2, 10 a 50% y 3, & gt; 50%) y la intensidad de la tinción (0-negativo, 1-débil, 2-moderada y 3- fuerte). Los tumores se clasificaron en Gal3-bajo (scores≤3 combinado) y Gal3-alto (puntuación combinada ≥4).
Othotopic modelo PADC
células
MPanc96 transfectadas de forma estable con Gal-3 y shRNA correspondiente vector de control fueron transducidas de forma estable con luciferasa como se describe anteriormente [25], [26]. Los animales se dividieron en 2 grupos (n = 5 por grupo). El primer grupo fue inyectado con células MPanc96 que fueron transfectadas con el vector (GN10) y sólo el segundo grupo con las células transfectadas con MPanc96 Gal-3 shRNA (A3). Los animales fueron anestesiados con una solución de ketamina-xilazina, se hizo una pequeña incisión en el flanco abdominal izquierda, y (1 × 10
6) MPanc-96 células en 50 l de PBS se inyectaron en la región subcapsular del páncreas usando una de calibre 27 aguja y un dispositivo calibrado pulsador de dispensación controlada (jeringas Hamilton Company). La herida abdominal se cerró en una capa con grapas para heridas (Braintree Scientific, Inc.).
Una semana después de la implantación, los volúmenes tumorales se monitorizaron semanalmente por imágenes de bioluminiscencia en tiempo real no invasiva por IVIS 200 (Xenogen) utilizando un sistema de enfriado criogénicamente imágenes de bioluminiscencia acoplado a una imagen de software de adquisición de datos del ordenador en marcha de la vivienda (Xenogen) como se describe anteriormente [23]. Los ratones fueron imágenes en los días 7, 14, 21 y 28 después de la implantación de células tumorales. Los animales se sacrificaron el día 28 después de la implantación de células tumorales. Los tumores primarios en el páncreas se escindieron, y se midió el peso final. Todas las mediciones se compararon entre los dos grupos utilizando
t
de Student no pareada. El tejido del tumor y los órganos circundantes fueron incluidos en parafina y se cortaron secciones seriadas de 5 micras, se tiñeron con hematoxilina-eosina, y se examinaron con un microscopio óptico para verificar la presencia de tumor y las metástasis microscópicas. Los tejidos tumorales se procesaron para inmunohistoquímica y se tiñeron para la expresión de galectina-3, Ras y fosfo-ERK. como se ha descrito anteriormente.
El análisis estadístico
Los ensayos se presentan en gráficos como media ± desviación estándar y representan los resultados de al menos tres experimentos. Importancia de las diferencias entre los grupos se evaluó utilizando un Student de dos colas
t
prueba. Los resultados fueron considerados estadísticamente significativos si el
P
valor era. & Lt; 0,05
Resultados
Gal-3 es altamente regulados hasta en los tejidos tumorales pancreáticas humanas
perfiles de expresión génica estudios sugieren que Gal-3 es hasta reguladas en los tumores de páncreas en comparación con el control de los tejidos [18], [19]. Se realizó la tinción inmunohistoquímica de microarrays de tejidos pancreáticos humanos con anti-anticuerpo Gal3 (Figura 1A). Se encontró que el Gal-3 expresión aumenta progresivamente en la secuencia de progresión de la enfermedad normal (Figura 1A, a, b), pancreatitis (c, d) y el adenocarcinoma ductal pancreático (e, f). Gal-3 tinción se clasifica en dos grupos, Gal-3 Baja (score & lt; 3) y Gal-3-alto (puntuación & gt; 4), en base a la intensidad de la tinción y el porcentaje de tinción positiva como se describe en Materiales y Métodos. Se encontró que 83 de 125 (66,4%) de páncreas muestras de adenocarcinoma ductal mostraron altos niveles de Gal-3 expresión (Gal3-alta). Entre estos casos, los tejidos pancreáticos no neoplásicas pareadas estaban disponibles para la evaluación en 108 casos (72 muestras de la pancreatitis crónica y 36 normales muestras de tejido pancreático) y 32 (29,6%) fueron Gal3-alta. Gal-3 expresión fue significativamente mayor en el adenocarcinoma ductal pancreático que los pares de muestras no neoplásicas pancreáticas de tejidos (p & lt; 0,0001). 28 de 72 (38,9%) muestras con pancreatitis crónica eran Gal3-alta en comparación con 11,1% (4/36) de las muestras normales pancreáticos de tejido (P & lt; 0,001) (Figura 1B). Estos datos indican que Gal-3 es hasta reguladas durante la progresión de la enfermedad de páncreas humano normal, la pancreatitis y el adenocarcinoma ductal pancreático.
A, diapositivas de microarrays de tejidos que consta de 125 adenocarcinomas ductales pancreáticas y pareados muestras de tejido pancreático no neoplásicas fueron teñidas inmunohistoquímicamente usando un anticuerpo monoclonal Gal-3 como se describe en Materiales y Métodos. Gal-3 expresión se incrementó a lo largo de la secuencia normal de la enfermedad (Figura 1A, a, b), pancreatitis (c, d) y el adenocarcinoma ductal pancreático (e, f). B. Resumen de Gal-3 IHC de los microarrays de tejidos PDAC. Los tumores se clasificaron en Gal3-bajo (puntuaciones combinadas ≤3) y Gal3-alto (puntuación combinada ≥4), basado en el porcentaje de Gal-3 tinción en las células tumorales (0, sin tinción; 1, ≤10%; 2, 10 a 50% y 3, & gt;. 50%) y la intensidad de la tinción (0-negativo, 1-débil, 2-moderada y 3- fuerte)
Gal-3 es muy arriba regulado en los tejidos tumorales pancreáticas y células de un K-Ras mutante de ratón modelo
un modelo de ratón K-Ras mutante descrito recientemente recapitula la secuencia de la progresión del cáncer de páncreas humano de la inflamación a PanIN a PDAC [25]. Es de interés para determinar si este modelo de ratón también imitar los cambios en Gal-3 de expresión observados en muestras humanas. Como se muestra en la Figura 2A, Gal-3 era indetectable en los tejidos del páncreas de ratones normales (carriles 1-3), pero altamente regulados hasta en siete líneas de células tumorales (carriles 4-10) que se derivan de siete tumores de ratón diferentes.
A. Gal-3 expresión se analizó en células derivadas de páncreas normal y los tumores pancreáticos de K-Ras ratones mutantes por transferencia de Western como se describe en Materiales y Métodos. B. PCR en tiempo real cuantitativa de Gal-3 expresión de ARN utilizando cebadores de Gal-3-específicos después de la extracción de ARN total de páncreas normales, tejidos pancreatitis y los tumores de páncreas y de células aisladas de diferentes tumores que surgen en un modelo de ratón mutante K-Ras como se describe en Materiales y Métodos. Doble cambio de determinaciones realizadas por triplicado.
Con el fin de determinar si Gal-3 mRNA fue también hasta reguladas en los tejidos tumorales de ratón en comparación con los tejidos normales y pancreatitis, tejidos de ratones individuales que eran normales, tenido pancreatitis o aquellos con tumores fueron extraídos y PCR en tiempo real se realizó a través de ratón específica Gal-3 cebadores (Mm00802901_m1, Ambion, EE.UU.) (Figura 2B). Hemos observado que Gal-3 expresión fue baja en tejidos pancreáticos normales (carriles 1-3), pero se aumentó desde 10 hasta 27 veces en la pancreatitis crónica (carriles 4-9) y el aumento 45-215 veces en los tejidos tumorales de ratón mutante K-RAS (carriles 10-12). los niveles de mRNA Gal-3 fueron aún mayores (62 veces a 831 veces), cuando se mide en las células tumorales aisladas (carriles 13-24).
Generación de Gal-3 superiores e inferiores a las células que expresan PDAC
con el fin de manipular los niveles de Gal-3 en las células PADC, primero se determinó el nivel de Gal-3 en una variedad de líneas celulares PADC (Figura 3A, panel superior). MPanc96, MIAPaCa-2 y Panc-1 células tenían expresión Gal-3 basal alta (Figura 3A) y se transfectó de forma estable con sólo (células GN10) Gal-3 lentivirus (células A3) shRNA o vector. Galectina 3-niveles se redujeron con éxito en células Mpan96 90%, 95% y 92% respectivamente (Figura 3A, panel central) MiaPaCa-2, Panc-1 y. Con el fin de estudiar los efectos de la sobre regulación de la galectina-3, Gal-3 cDNA lentivirus se transfectaron en células PDAC con Gal-3 niveles basales más bajos (Figura 3A, panel inferior). Estas variantes fueron designados como L-Gal3 y V (control de vector) como se muestra en la Figura 3A, panel inferior. Estas células se usaron PDAC para determinar aún más la función de Gal-3 en la patogénesis de cáncer de páncreas.
A. expresión Gal-3 en diferentes líneas celulares PDAC como se determina por transferencia (panel superior) Western. Desmontables Gal-3 por lentivirus shRNA de Gal3 (A3) o vector de control (GN10) en Gal-3 de células de alta líneas- Mpanc96, MiaPaCa-2 y Panc-1 se determinó mediante inmunotransferencias (Figura 3A, panel central). La sobreexpresión células Gal-3 en BxPC-3 y L3.6pl inferior Gal3 expresaron las células por infección lentivirus de Gal3 cDNA (L-Gal3) o el control de vectores (v) se confirmó mediante inmunotransferencias (Figura 3A, panel inferior. B. Efectos de Gal -3 sobre la proliferación celular. proliferación de MiaPaCa-2, y Mpanc96 células en las que Gal-3 se había reducido regulado por las células shRNA o BxPC-3 y L3.6pl en el que se determinó sobre-expresada por Gal-3 ADNc mediante el uso de la CellTiter Aqueous One Solution kit ensayo de proliferación celular como se describe en Materiales y Métodos. C. Efecto de Gal-3 sobre la invasión de células de cáncer en las células PDAC. campos representativos se muestran células PDAC (1 × 10
5) en la que Gal-3 expresión fue derribado por shRNA (A3) y células de control de vector transfectadas (GN10) fueron sembradas en cámaras de invasión recubiertas con Matrigel; 24 horas después, las células invadidas que se adhirieron en la superficie inferior de la membrana se fijaron, se tiñeron con diff Quick set y contar como se describe en Materiales y Métodos gráfico D. Bar para ciento de la invasión en las células Mpanc96 y MiaPaCa-2 con Gal3 desmontables (A3) o control (GN10) representa la media de tres experimentos independientes realizados por triplicado.; bares, los errores estándar, p. & lt; 0,001
Gal-3 regula la proliferación celular, la invasión y la formación de colonias de células in vitro PADC
Con el fin de determinar si Gal-3 desempeña una papel funcional en el comportamiento de las células tumorales de páncreas in vitro, que utiliza líneas celulares alterados genéticamente para expresar diferentes Gal 3-niveles como se muestra en la figura 3A para determinar los efectos de Gal-3 sobre el crecimiento de células tumorales (ensayo de MTS), la invasión (ensayo de invasión Matrigel ) y en la tumorigenicidad in vitro (ensayo de formación de colonias en agar blando). Golpear abajo de Gal-3 en células MIAPaCa-2 y Mpanc96 disminuyó significativamente el crecimiento de células a las 72 horas (Figura 3B, panel superior). En un experimento complementario, la sobre expresión de Gal-3 en L3.6PL y BxPC 3-células (L3.6PL-L-Gal3 y BxPC-3-L-Gal3) aumento de la proliferación celular en comparación con células de control L3.6PL-V y BxPC-3-V (Figura 3B, panel inferior). Para investigar si Gal-3 afecta a la capacidad invasiva de las células PDAC, se realizaron ensayos de invasión de Matrigel. Regulación a la baja de Gal-3 (A3) en MPanc96 y MiaPaCa-2 células disminuyó la invasión de células por 95% y 90% respectivamente, en comparación con las células control (Figura 3C y 3D). Por el contrario, Gal3 cDNA expresado células BxPC-3-L Gal3 mayor capacidad de invasión de células (datos no presentados). Estos resultados indican que Gal-3 también juega un papel importante en la invasión de células de PDC.
Además, la baja regulación de Gal-3 por shRNA en las células MPanc96 (A3) MPanc96 disminuido drásticamente el número de colonias en suave agar comparación con los controles transfectados con vector (Figura 4A, 4B paneles superiores), mientras que la regulación de Gal-3 en células BxPC-3 aumentó significativamente el número de colonias en comparación con los controles (Figura 4A, 4B paneles inferiores). Estos datos indican que Gal-3 niveles influyen en la proliferación celular PDAC, invasión y crecimiento independiente de anclaje.
A. ensayos de formación de colonias se realizaron en células de control MPanc96 GN10 y Gal-3 shRNA derriban las células A3 (panel superior) o 3 BxPC-V células de control y BxPC-3 Gal3 ADNc sobreexpresa células (panel inferior) L-Gal3 como se describe en Materiales y métodos. células MPanc96-A3 formaron colonias más pequeñas y menos en comparación con las células transfectadas de control del vector (GN10). En contraste, las células BxPC-3 L-Gal3 formaron más grande y un mayor número de colonias que las células de control v. B. gráfico Bar en el panel de la derecha muestra el número medio de colonias después de la siembra o bien células de control MPanc96 GN10 y shRNA derribar las células A3 (arriba) o BxPC-3 y V BxPC-3 L-Gal3 (inferior); p & lt; 0,001. C. Representante imágenes de bioluminiscencia de ratones atímicos 3 semanas después de la implantación ortotópico de cáncer de páncreas células GN10 y A3 ortotópica en el páncreas de los ratones sin timo. D. Medidas de fotones /s /cm
2 /steridian que representa el área de la bioluminiscencia en el margen máximo del 10% (media ± DE) en la semana 3 usando Xenogen IVIS como se describe en Materiales y Métodos (
n =
5
). E. pesos de los tumores de los ratones de control (GN10, n = 5) y Gal3 grupo desmontables (A3, n = 5) fueron ponderados después los ratones fueron sacrificio en la semana cuatro. F. tejidos tumorales de ratón de control (GN10) y Gal-3 Grupo de caída (A3) se tiñeron inmunohistoquímicamente utilizando anticuerpos fosfo-ERK Gal-3, Ras y como se describe en Materiales y Métodos.
Regulación a la baja de Gal-3 inhibe el crecimiento tumoral en un modelo in vivo ortotópico
Para investigar la influencia de Gal 3-niveles en el crecimiento in vivo de PDAC, las células transfectadas de manera estable con MPanc96 Gal-3 shRNA o un control de shRNA vector eran marcado con luciferasa de luciérnaga para permitir imágenes de bioluminiscencia en tiempo real para controlar el volumen del tumor y la propagación en vivo. Estas células fueron inyectadas de forma ortotópica en el cuerpo del páncreas de ratones desnudos, y el crecimiento tumoral se controló mediante formación de imágenes no invasiva una vez por semana. Las diferencias en el crecimiento de los tumores se observaron dentro de 3 semanas (imágenes representativas como se muestra en la Figura 4C). La evaluación cuantitativa de la carga tumoral indica que los tumores fueron significativamente mayores en el grupo de control en comparación con el Gal-3 derribar grupo (Figura 4D) (p & lt; 0,05). Además, pesos de los tumores primarios fueron significativamente menor en el Gal3 derribar grupo que el grupo control como se demuestra en la Figura 4 E; La tinción inmunohistoquímica de Gal-3, Ras y fosfo-ERK en estos tejidos ratones tumorales (Figura 4F) confirmó además que la expresión de Gal-3, Ras y el de aguas abajo efector fosfo-ERK se redujo en el Gal-3 tumbar grupo en comparación con el grupo control. micrometástasis regionales se observaron en los animales inyectados con células de control (5/5 animales), pero no en los animales inyectados con células en las que la galectina-3 había sido derribado por transfección estable de galectina-3 shRNA (0/5 animales) (Figura S1 ).
Gal-3 se une a Ras y aumenta la actividad de Ras en células PDAC
previamente se ha informado de que Gal-3 se asocia con gen K-Ras y promueve la fuerte activación de Raf- 1 y PI3-K pero que atenúa la activación de la señalización de ERK en células COS [21]. Por lo tanto, la hipótesis de que Gal-3 se uniría con Ras y mediar en la actividad de Ras en células PDAC que se caracterizan por la frecuente aparición de mutaciones Ras. El uso de una matriz de anticuerpos (Hypromatrix, Worcester, MA), se detectó la interacción entre Ras y Gal-3 usando HA marcado Gal3 transfectadas BxPC-3 lisado (datos no mostrados). Ras se confirmó que era una de las parejas de unión de Gal-3 sobre la base de datos de la matriz de anticuerpos. Para confirmar aún más que Ras interactúa con Gal-3, se utilizó ensayos de co-immunoprocipitation. Los lisados de Panc-1 y MPanc96 con o sin derribar de Gal-3 fueron sometidos a inmunoprecipitación con anticuerpo monoclonal de rata Gal3 o un anticuerpo monoclonal anti-Ras pan seguido de inmunotransferencia con anticuerpos Gal3 hormiga anti-Ras o. Los resultados demostraron que Gal-3 co-inmunoprecipitó con Ras, mientras que los lisados con IgG normal produjo ninguna banda visible (Figura 5A).
A. Co-inmunoprecipitación se realizó en Panc-1 y MPanc96 con derribo Gal-3 utilizando anti-Ras o anticuerpo anti-Gal-3 como se describe en Materiales y Métodos. B. cantidades iguales de proteína a partir de células de control Panc-1 y Mpanc96 gn10 o células shRNA A3 se incubaron con perlas de agarosa recubiertas con Raf1-RBD, y se detectó activa Ras-GTP, como se describe en Materiales y Métodos. Se determinó la actividad de Ras C. GTP activa en BxPC-3 células L-Gal3 y células de control (V) como se describe en Materiales y Métodos. D. membrana plasmática de la célula y las fracciones citoplasmáticas de células GN10 y A3 tanto de Panc-1 y MPan96 se sometieron a SDS-PAGE y luego a inmunotransferencia con anticuerpo anti-Ras. E. La inmunofluorescencia indirecta se realizó en 3 BxPC células L-Gal3 BxPC-3-V y el uso-Gal-3 anticuerpo anti (TIB166 1:100, rojo) y anti-Ras anticuerpo (1:100, verde), seguido de contratinción DAPI (azul). También se muestra la fusión de Gal-3 (rojo) y Ras (verde) con DAPI (azul).
A fin de determinar si la interacción entre Ras y Gal-3 afecta a la actividad de Ras, se analizó la efectos de la manipulación de Gal-3 expresión en la actividad Ras. Como se muestra en la Figura 5B, la baja regulación de Gal-3 en células MPan96 Panc-1 y (A3) disminución de la actividad Ras usando el ensayo de Ras-GTP, mientras que la sobreexpresión de Gal3 en BxPC-3 células aumentó la actividad de Ras GTP (Figura 5C) . Con el fin de aclarar aún más cómo Gal-3 media la actividad de Ras, membrana celular y se aislaron proteínas citosólicas [26] de Panc-1 y células de control MPanc96 (GN10) y derribar células (A3) y la proteína Ras se detectó utilizando inmunotransferencia. Menos proteína Ras se detectó en las membranas plasmáticas de 1-Panc A3 células y células Mpanc96 A3 en comparación con las células control gn10 (Figura 5D). En el contrato, no se observó más proteína RAS en el citosol de las células Panc-1 y Mpanc96 A3 en comparación con las células control GN10. Estos datos sugieren que Gal-3 puede gobernar Ras localización subcelular. inmunofluorescencia confocal confirmó que la regulación de Gal-3 en BxPC-3 células está asociada con un aumento de Ras en la membrana plasmática (Figura 5E) .Este sugiere que Gal-3 se une Ras y es responsable de Ras de unión a la membrana plasmática de la célula, la mediación de este modo su actividad.
Gal-3 media la señalización corriente abajo de Ras en células PDAC
ras activada (estado unido a GTP) activa los efectores incluyendo la Raf /proteína activada por mitógenos (MAP) /Alabama. Alabama.