Extracto
Los microARNs, no codificante 20-22 nucleótidos de ARN de cadena simple, como resultado de la represión o la degradación de traslación y el silenciamiento de genes de sus genes diana, y contribuyen significativamente a la regulación de la expresión génica. En el presente estudio, mostramos que la expresión de miR-182 se reguló de manera significativa en los tejidos de cáncer de próstata y cuatro líneas celulares, en comparación con los tejidos hiperplasia prostática benigna prostática y del epitelio normal de las células (RWPE-1). sobreexpresión ectópica de miR-182 promueve significativamente la proliferación, aumenta la invasión, promueve la transición del ciclo celular G1 /S y reduce la apoptosis temprana de las células PC-3, mientras que la supresión de miR-182 disminuyó la proliferación e invasión, inhibe el G1 /S transición del ciclo celular y apoptosis aumento precoz de células PC-3. Además, hemos demostrado que el miR-182 podría regular negativamente la expresión de NDRG1 atacando directamente a la NDRG1 región 3 'no traducida. En conclusión, nuestros resultados sugieren que miR-182 juega un papel importante en la proliferación de células de cáncer de próstata humanos suprimiendo directamente la NDRG1 gen supresor de tumor. Hemos descubierto una nueva regulación epigenética de la NDRG1
Visto:. Liu R, Li J, Teng Z, Zhang Z, Y Xu (2013) sobreexpresa microARN-182 promueve la proliferación e invasión de próstata PC-3 células del cáncer de abajo de la regulación N-myc gen regulado en sentido descendente 1 (NDRG1). PLoS ONE 8 (7): e68982. doi: 10.1371 /journal.pone.0068982
Editor: Daotai Nie, Escuela de Medicina de la Universidad del Sur de Illinois, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 7, 2013; Aceptado: June 8, 2013; Publicado: July 16, 2013
Derechos de Autor © 2013 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (n: 30800226), Tianjin Ciencia y Tecnología de la Comisión Municipal (n: 12ZCDZSY17200) y el Segundo hospital de la Universidad médica de Tianjin (n: y1003). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) sigue siendo uno de los mayores problemas de salud para el envejecimiento masculino, con un estimado de 238,590 nuevos casos y 29.720 muertes relacionadas con el cáncer que se esperan en 2013 en los Estados Unidos solamente [1]. Aunque los hombres chinos pertenecen al grupo de bajo riesgo de tener un CaP, la incidencia y la mortalidad han aumentado significativamente debido al envejecimiento de la población, los cambios en los estilos de vida y otras causas. CaP se ha convertido en una de las neoplasias más frecuentes en los hombres en todo el mundo, con muy diferentes tasas de progresión del tumor y la respuesta al tratamiento. Si el tumor está confinado a la próstata, los pacientes pueden ser tratados por la extirpación quirúrgica del tumor o por la radiación, con una alta eficacia. Por el contrario, la terapia para los tumores no confinados todavía representa un problema importante. El tratamiento estándar para estos pacientes es antiandrógenos para lograr el bloqueo total de andrógenos [2]. Por desgracia, que los tumores de progreso y de este modo eludir el tratamiento es un evento muy frecuente y no existen tratamientos efectivos para la PCA (CRPC) pacientes resistentes a la castración, aunque urólogo están tratando de utilizar agentes quimioterapéuticos. Aunque los factores genéticos y ambientales son considerados como los principales factores, los mecanismos moleculares del desarrollo y la progresión del CaP permanecen en gran parte unknown.Therefore, una mejor comprensión de la patogénesis de la CP y la exploración de nuevas dianas de intervención para el CaP son urgentemente tareas exigentes.
Los microARN (miRNA) son un grupo de pequeños (aproximadamente 20-22 nucleótidos) ARNs no codificantes endógenas. miRNAs maduro regulan negativamente sus genes diana a través de imperfecta secuencia de emparejamiento complementario a la región no traducida 3 '(UTR) de genes diana que resultan ya sea en la degradación del ARNm o la represión de traducción. Numerosos estudios han demostrado que la expresión aberrante de miRNAs está estrechamente asociada con la proliferación, invasión, metástasis y el pronóstico de varios cánceres, incluyendo CaP, cáncer de pecho, glioma y cáncer de pulmón [3] - [6]. la progresión del CaP se asocia con alteraciones en la expresión de múltiples oncogenes y supresores de tumor, y miRNAs potencialmente pueden regular estos genes; sin embargo, la relación entre miRNAs y PCa sólo ha empezado a ser dilucidado en los últimos años [7]. Según informes, más de 50 miRNAs estar involucrado en el CP; Sin embargo, la mayoría de los datos actuales indican que sólo un pequeño número de ellas se refieren a la patogénesis de CaP [8]. . Más miRNAs deben ser seleccionados y estudiados con el fin de comprender mejor la progresión del CaP
Hasta la fecha, muchos artículos investigaron la expresión de los genes miARN en muestras de CaP, sin embargo, los resultados fueron muy inconsistentes [9] - [15]. No hay resultados de la detección de los genes miARN microarrays se registraron a partir de muestras de CaP chinos hasta ahora. En el presente estudio, se exhibió la primera miRNAs relacionados con CaP por microarrays miARN, y de acuerdo a los resultados preliminares, se encontró que los microARN-182 (miR-182) se sobreexpresa en los tejidos de CaP. Los estudios demostraron que el miR-182 podría promover la metástasis del melanoma mediante la represión de FOXO3 y factor de transcripción asociado con microftalmia [16], por su parte, el miR-183-96-182 grupo se sobreexpresa en el tejido de la próstata y podría regular la homeostasis del zinc en las células de la próstata [17]. MiR-182 fue pensado para ser un oncomiR importante. Sin embargo, el miR-182 podría suppresse tumorigénesis pulmonar a través de la regulación negativa de la expresión RGS17 in vitro [18]. Por otra parte, un estudio reciente mostró que el miR-182 y microARN-200a podían controlar alfa-13 (GNA13) expresión de la subunidad de la proteína G y la invasión de células de forma sinérgica en células de CaP [19]. Estos resultados contradictorios indican que la función de miR-182 es complejo y se necesitan más estudios. En este estudio, hemos demostrado que el miR-182 promueve el CP PC-3 células de proliferación e invasión atacando directamente a la 3'-UTR de N-myc gen regulado aguas abajo 1 (NDRG1, NM_006096.3) ARNm. Nuestros resultados sugieren que el miR-182 puede desempeñar un papel importante en el desarrollo y progresión del CaP.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
El estudio fue aprobado por la ética tablero del Segundo hospital de la Universidad médica de Tianjin. Todas las muestras fueron obtenidas de pacientes que firmaron el consentimiento informado que se aprueba el uso de sus tejidos con fines de investigación después de la operación.
Las muestras de tejido prostático
Cinco tejidos con CaP se recogieron después de la prostatectomía radical en el departamento de Urología del hospital entre enero de 2010 y diciembre de 2012. Ninguno de los pacientes había recibido terapia hormonal neoadyuvante antes de la operación. Tres tejidos hiperplasia benigna de próstata (HBP) se recogieron después de la enucleación suprapúbica de la próstata. tejidos de la próstata se tomaron muestras frescas directamente después de la extirpación quirúrgica de las muestras gland.These se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se utiliza para experimentos de microarrays miARN. A H & amp diagnóstico;. La sección E se preparó para verificar el contenido del tumor y sólo los casos con tejido tumoral más del 90% se consideraron para su posterior análisis
Mirna análisis de microarrays
MiRNA kits de aislamiento (Ambion) eran se utiliza para aislar el ARN total con miRNAs enriquecido a partir de muestras de tejido de la próstata. microarrays de ensayo se realizó con un proveedor de servicios (LC Ciencias, Houston, TX, http://www.lcsciences.com) como se describe anteriormente [20]. Las personas con doble cambio & gt; 2 o & lt; -2 y los valores & lt P; 0,05 (prueba t) fueron considerados como miRNAs expresados diferencialmente. Real-time RT-PCR se utilizó para la confirmación de algunos miRNAs expresados diferencialmente.
Cell Cultura y
líneas celulares de CaP humano LNCaP, DU145, 22Rv1 y normal de las células epiteliales de próstata línea de PC-3 RWPE-1 se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.) y se mantuvo en nuestro laboratorio. Las células fueron cultivadas en medio RPMI-1640 (Gibco) suplementado con 10% fetal de la pantorrilla de suero y penicilina (100 U /ml). Los cultivos se mantuvieron en una atmósfera que contiene 5% de CO
2.
Total La extracción de RNA y en tiempo real RT-PCR
El ARN total fue extraído utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, CA, EE.UU. ). cDNA se sintetizó usando M-MLV MicroARN Reverse Transcription Kit (Promega, EE.UU.). Real-time RT-PCR se realizó con SYBR Premezcla Ex Taq ™ (Takara, Biotech Co., Ltd, Dalian, China). RT imprimación para miR-182 era 5'GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACAGTGTGA -3 ', cebador de PCR para el miR-182 fue 5'-TGCGGTTTGGCAATGGTAGAAC-3' (hacia adelante), 5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3 '(hacia atrás). El nivel de expresión se normalizaron a U6. RT imprimación para U6 fue 5'GTCGTATCCA GTGCAGGGTCCGAGG TGCACTGGATACGACAAAAT ATGG -3 ', cebador de PCR para la U6 fue 5'TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC -3' (adelante), 5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT -3 '(inverso). PCR se realizó en las siguientes condiciones: 94 ° C durante 4 min, seguido de 40 ciclos a 94 ° C durante 30 s, 50 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 40 s. Cada muestra se realizó por triplicado.
Western Blot
Western Blot se realizó para determinar NDRG-1 expresión de la proteína. Todas las proteínas se resolvieron en un gel de poliacrilamida desnaturalizado-SDS 8% y luego se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron con tampón de bloqueo durante 90 min a temperatura ambiente y después se incubaron con un anticuerpo contra NDRG-1 o beta-tubulina con Blotto durante la noche a 4 ° C. Las membranas se lavaron y se incubaron con una peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado con anticuerpo secundario. La expresión de proteínas se evaluó mediante quimioluminiscencia aumentada y exposición a una película quimioluminiscente. La adquisición y análisis de imágenes de software LabWorks (UVP, LLC) se utilizó para cuantificar las intensidades de banda. Todos los anticuerpos fueron adquiridos de Saier Biotecnología (Tianjin, China).
Cell La transfección
Las transfecciones se realizaron utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, las células PC-3 se sembraron en placas de seis pocillos y se dejaron crecer sin antibióticos a 60-80% de confluencia. Cada pocillo recibió 10 l de reactivo de lipofectamina y 50 pmol de miR-182 sintéticos imita (GenePharma Co., Ltd, Shanghai, China), miRNAs sintéticos negativos de control (miR-182 imita-NC), secuencia de miR-182-inhibidor sintético o sintético miR-182-inhibidor de control negativo (miR-182 inhibidor-NC). Las secuencias de miR-182 imita, se demostró que el miR-182 imita-NC, miR-182 y miR-inhibidor-182-NC inhibidor en la tabla 1. Todos los imitadores y los inhibidores fueron etiquetados con FAM (carboxifluoresceína). Se observaron seis horas después de la transfección, las células PC-3 usando el microscopio de fluorescencia y medio libre de suero se cambió a medio completo.
Ensayo MTT
PC-3 células transfectadas con cualquiera de miR 182 imita o miR-182 imita-NC, o miR-182 y miR-inhibidor-182 inhibidor-NC se sembraron en placas de 96 pocillos a 1 × 10
4 células /pocillo. Se midieron las células viables 1, 2, 3, 4, y 5 días después de la siembra. Después de la incubación con ácido 3- (4, 5 dimetiltiazol-2) -2, bromuro de 5-difeniltetrazolio (MTT), las células se lisaron en 150 ml de 100% de dimetilsulfóxido (DMSO) y la absorbancia UV-visible se leyó a 490 nm usando el lector de placas de 96 pocillos. Cada muestra se realizó por triplicado.
Análisis de Ciclo Celular
PC-3 células transfectadas con cualquiera de miR-182 imita o miR-182 imita-NC, o miR-182-inhibidor y miR 182 inhibidor-NC se cosecharon 72 h después de la transfección, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato fría (PBS), y se fija en 1 ml de 70% de etanol. Después de la incubación durante la noche a 4 ° C en etanol, las células se lavaron en PBS y se suspendieron en 500 ml propidine yoduro (PI) 30 min antes de citometría de flujo. Las poblaciones en G0-G1, S, G2 y la fase-M se midieron mediante citometría de flujo (BD Biosciences, EE.UU.) y se analizaron los datos mediante el uso de Ciclo Celular multiciclo-DNA Analizados medición software.The se realizó por triplicado.
detección Temprana de la célula apoptosis
PC-3 células transfectadas con cualquiera de miR-182 imita o miR-182 imita-NC, o miR-182 y miR-inhibidor-182 inhibidor-NC 70% de etanol para la detección de apoptosis temprana. La tinción de las células se realizó de acuerdo con las instrucciones del kit de detección de apoptosis de las células con anexina V-R-PE (SouthernBiotech, EE.UU.). La citometría de flujo (BD Biosciences, EE.UU.) se utilizó para detectar el porcentaje de apoptosis temprana. La medición se realizó por triplicado.
Transwell invasión celular Ensayo
PC-3 células transfectadas con cualquiera de miR-182 imita o miR-182 imita-NC, o miR-182 y miR-inhibidor -182 inhibidor-NC se recogieron. 5 × 10
4 células PC-3 fueron colocados en la cámara superior de cada inserto revestido con 50 l de 2 mg /ml de Matrigel (factor reducido matriz BD MatrigelTM crecimiento), y 600μl de RPMI 1640 con se añadió FBS al 20% la parte inferior de la cámara. Después de incubar durante 24 horas, las cámaras se desmontaron, y las membranas se tiñeron con una solución de cristal violeta 2% durante 15 min y se colocan en un portaobjetos de vidrio. Luego, las células que habían migrado a través de la membrana se contaron en cinco campos visuales aleatorios usando un microscopio de luz. Todos los ensayos se realizaron tres veces independientes por triplicado.
miARN Objetivos Predicción
Los objetivos miARN putativo se prevé utilizar el TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_50/), miRBase (http://www.mirbase.org/index.shtml), y PicTar (http: //pictar.mdc - berlin.de/). algoritmos
Construcción de plásmidos
PmirGLO- vector informador Dual-luciferasa (7350 pb, Promega, Madison, WI, EE.UU.) se utilizó para confirmar la función del sitio de unión putativo miR-182 en el NDRG1 3'-UTR. De acuerdo con el potencial secuencia de unión de miR-182 de NDRG1 3'-UTR, una doble - hebra secuencia se obtuvo mediante el apareamiento usando dos de un solo hebras NDRG1-Top, (NheI) 5'-CTAGCTAGCGGCCGCTAGT CCTC AGAGAC ACCAAACTGCCAAAAG- 3 '; NDRG1-Bot (SalI) 5'-TCGACTTTTGGCA GTTTGGTGTC TCTGAGG ACTAGCGGCCGCTAG- 3 ', y luego se clonó en los sitios NheI /SalI del vector indicador pmirGLO-Dual-luciferasa. El recocido se realizó como: 95 ° C durante 5 min y a temperatura ambiente durante 2 h. El plásmido reconstruido fue confirmada por digestión con endonucleasas de restricción y secuenciación, y fue nombrado pmirGLO /NDRG1-UTR.
Dual Luciferase gen reportero de ensayo
PC-3 células se dividieron en cinco grupos de acuerdo a diferentes contenidos de transfección: a: (en blanco) pmirGLO /NDRG1-UTR; b: pmirGLO /NDRG1-UTR + miR-182 inhibidor-NC; c: pmirGLO /NDRG1-UTR + miR-182-inhibidor; d: pmirGLO /NDRG1-UTR + miR-182 imita-NC; e: pmirGLO /NDRG1-UTR + miR-182 imita. PC-3 células fueron sembradas por triplicado en placas de 96 pocillos, se deja reposar durante 24 horas y después se co-transfectadas con diferentes contenidos utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, EE.UU.). Luciferasa y la actividad de Renilla se midieron 48 h después de la transfección usando el kit Dual LuciferaseReporter de ensayo (Promega) según las instrucciones del fabricante. Tres experimentos independientes se realizaron y los datos se presentan como la media ± desviación estándar. los valores de actividad luciferasa se normalizaron a la actividad de Renilla como unidad de luz relativa (RLU)
Análisis estadístico
Se utilizó la prueba t de Student de dos colas para evaluar la significación de las diferencias entre los dos grupos.;
P
valores. & Lt; 0,05 se consideró significativo
Resultados
miR-182 se reguló en el CaP tejidos
Tras el análisis de microarrays miARN primaria, en los tejidos de CaP , cinco miRNAs (miR-345, miR-145, miR-221, miR-27b y miR-378) se redujeron reguladas y veintidós miRNAs fueron hasta reguladas (Figura 1). MiR-182 fue hasta reguladas con factor de cambio de 6.14 y confirmada por tiempo real de RT-PCR con factor de cambio de 5,70. Como el más significativo miARN expresados diferencialmente entre los tejidos de CaP y BPH, miR-182 fue elegido para el estudio adicional. Todos los miRNAs expresados diferencialmente fueron vistos en la Tabla S1.
En los tejidos de CaP, cinco miRNAs se redujeron regulado y veintidós miRNAs fueron reguladas. miRNA-182 fue hasta reguladas con factor de cambio de 3.07 y confirmada por tiempo real de RT-PCR con factor de cambio de 2,85.
miR-182 se reguló en el CaP líneas celulares
en tiempo real el análisis RT-PCR reveló que la expresión de miR-182 se incrementó notablemente en cuatro líneas comunes CaP celulares ensayadas (PC-3, DU145, 22Rv1 y LNCaP), en comparación con epitelio prostático normal-1 RWPE celular, lo que indica que el miR -182 es upregulated en líneas celulares de CaP y PC-3 tiene el más alto nivel de expresión (Figura 2). A continuación, se eligieron las células PC-3 para un estudio más
.
En tiempo real RT-PCR muestran que el nivel de expresión relativa de las células PC-3 es el más alto en cuatro líneas celulares de cáncer de próstata y RWPE-1 tiene la más baja nivel de expresión. Los valores representan las medias de tres experimentos separados y las barras de error representan la desviación estándar.
miR-182 nivel de expresión cambia significativamente después de la transfección con Imita o inhibidores
Se detectó miR-182 nivel de expresión por tiempo real de RT-PCR después de la transfección con imita o inhibidores en células PC-3. Los resultados mostraron que imita o inhibidores fueron transfectadas de manera eficiente (Figura 3) y el nivel de expresión es mayor en el miR-182 imita grupo y la más baja en el miR-182 grupo de inhibidor (Figura 4). Estos resultados indican que estos miméticos o inhibidores pueden imitar o inhibir miR-182 con eficacia.
Los resultados muestran que la tasa de transfección es más de 80%. se muestran imágenes representativas y campos seleccionados al azar.
presentes en blanco blanco de control. Los resultados muestran que el nivel de expresión es mayor en el miR-182 imita grupo y la más baja en el miR-182 inhibidor de grupo. Los valores representan las medias de tres experimentos separados y las barras de error representan la desviación estándar.
La sobreexpresión de miR-182 promueve la proliferación de las células PC-3
Con el fin de investigar la función de miR 182 en el CaP, transfectadas de miR-182 imita o inhibitros en células de CaP PC-3 y la proliferación celular medido. El uso de ensayos de MTT, se observó que la tasa de crecimiento de las células que sobreexpresan el miR-182 se incrementó drásticamente, en comparación con el miR-182 imita células-NC-transfectadas (
P Hotel & lt; 0,05). Por el contrario, después de la regulación a la baja de miR-182 por un inhiobitor, la tasa de crecimiento de las células PC-3 fue drásticamente disminuido en comparación con las células de miR-182 inhibidor-NC-transfectadas (
P Hotel & lt; 0,05) (Figura 5). Estos resultados demostraron que la regulación al alza de miR-182 promueve la proliferación de células PC-3.
presentes en blanco blanco de control. absorbancia de UV-visible se midió a 490 nm. La absorbancia relativa fue significativamente diferente de 3 días después de la transfección (
P Hotel & lt; 0,05). Los valores representan las medias de tres experimentos independientes.
La sobreexpresión de miR-182 promueve la transición G1 /S del ciclo celular en células PC-3
Además, investigó el efecto de miR-182 sobre la proliferación usando citometría de flujo. PC 3-células miR-182 que sobreexpresan tenían un porcentaje significativamente menor de células en la fase G0 /G1 y el aumento de porcentaje de células en la fase S, en comparación con miR-182 células transfectadas imita-NC-. Por el contrario, después de la regulación por disminución de miR-182 por un inhiobitor, células PC-3 tenían un porcentaje significativamente mayor de células en la fase G0 /G1 y la disminución de porcentaje de células en la fase S, en comparación con miR-182 inhibidor-NC- células transfectadas (Figura 6). Estos datos indicaron que la sobreexpresión de miR-182 podría promover la transición del ciclo G1 /S de células, y por lo tanto, puede aumentar la proliferación de células PC-3.
presentes en blanco blanco de control. Los valores representan las medias de tres experimentos independientes y las barras de error representan la SD. (*
P Hotel & lt; 0,05).
La sobreexpresión de miR-182 reduce la apoptosis temprana de células PC-3
Para investigar la posible implicación reguladora de MIR -182, principios de la apoptosis de las células PC-3 fueron detectados después de la transfección. Los resultados mostraron que la tasa de apoptosis temprana de las células que sobreexpresan miR-182 se redujo drásticamente, en comparación con miR-182 células transfectadas NC-imita. Por el contrario, después de la regulación a la baja de miR-182 por un inhiobitor, la tasa de apoptosis temprana de células PC-3 se incrementó drásticamente en comparación con el miR-182 células transfectadas NC-inhibidor (Figura 7). Estos resultados demostraron que la regulación al alza de miR-182 reduce la temprana apoptosis de las células PC-3.
presentes en blanco blanco de control. Los resultados muestran que la tasa de apoptosis temprana es más bajo en el miR-182 imita grupo y la más alta en el miR-182 inhibidor de grupo (*
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01) . Imágenes representativas se muestran y células apoptosis temprana se indicaron en el área de Q4 (LR).
La sobreexpresión de miR-182 Aumenta la invasión en células PC-3
La sobreexpresión de miR-182 de manera significativa aumentado el potencial invasivo de las células PC-3 cuando transfectadas con miR-182 imita en comparación con células de control en el ensayo Transwell con Matrigel, y las células transfectadas con un inhibidor de miR-182 dio lugar a una significativa se redujo en promedio potencial invasivo (Figura 8). Estos datos sugieren que el miR-182 aumenta la invasión en células PC-3
in vitro
.
Invasión ensayos se realizaron con células PC-3 transfectadas con el miR-182 imita o inhibidores. Blank presenta control en blanco. Imágenes representativas y campos seleccionados al azar se muestran (*
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01).
Identificación de miR-182 Encuadernación sitios en NDRG1 3'-UTR Región
Después de la predicción con la línea miARN Objetivos herramientas, se predijeron muchos genes putativos. Se seleccionaron los genes relacionados con la proliferación celular, apoptosis, invasión y metástasis, incluyendo NDRG1. Además, hemos encontrado que NDRG1 era un gen supresor de metástasis [21] - gen [25] o supresor de tumor [26], y NDRG1 era necesario para p53 dependiente de la apoptosis [27]. Nuestro estudio también mostró que NDRG1 se downregulated en los tejidos de CaP y células PC-3 en comparación con los tejidos de BPH y células RWPE-1 (datos no presentados). Por último, NDRG1 fue seleccionado para su posterior estudio. A continuación, hemos encontrado que la región 3'-UTR NDRG1 tiene un solo sitios de unión de miR-182 altamente conservadas (Figura 9).
NDRG1 región 3'-UTR tiene un solo sitios de unión de miR-182 altamente conservadas después bioinformático el análisis.
miR-182 directamente a las metas de la metástasis Supresor de gene NDRG1 en células PC-3
resultados de Western Blot mostró que la sobreexpresión de miR-182 en células PC-3 disminuyó significativamente la los niveles de expresión de proteínas de NDRG1 después de la transfección con el miR-182 imita, en comparación con el miR-182 imita células -NC-transfectadas. Por el contrario, después de la regulación a la baja de miR-182 por un inhiobitor, los niveles de expresión de proteínas de NDRG1was aumentaron drásticamente en comparación con el miR-182 células transfectadas-NC inhibidor (Figura 10), lo que indica que NDRG1 es un gen diana potencial de miR-182.
presentes en blanco control en blanco. La sobreexpresión de miR-182 redujo significativamente los niveles de expresión de proteínas de NDRG1 y regulación a la baja de miR-182 aumentó drásticamente los niveles de expresión de proteínas de NDRG1 (*
P Hotel & lt; 0,05, **
P & lt
; 0,01). Los valores representan las medias de tres experimentos separados y las barras de error representan la desviación estándar
Para confirmar la función del sitio de unión de miR-182 en el supuesto NDRG1 3'-UTR, se sintetizó el doble -. Secuencia de hebra que incluía el sitio de unión de miR-182 y se clonó en el plásmido indicador de luciferasa. La actividad de luciferasa de la pmirGLO /NDRG1-UTR se inhibió drásticamente por la sobreexpresión de miR-182 con la co-transfección con miR-182 imita y significativamente aumentado por regulación a la baja de miR-182 con la co-transfección con inhibidores de miR-182 en las células PC-3, en comparación con el plásmidos de control (Figura 11), lo que sugiere que el miR-182 se dirige específicamente a la NDRG1 3'-UTR.
la actividad de luciferasa de la pmirGLO /NDRG1-UTR se inhibió de forma espectacular en el miR-182 imita grupo y significativamente aumentada en el miR -182 grupo de los inhibidores, en comparación con los grupos de control (*
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01).
Discusión
en los últimos años, cientos de miRNAs han demostrado que desempeñan papeles importantes en la regulación de la expresión génica a través de la degradación de mRNA o la represión de la traducción en una variedad de sistemas modelo [28] - [29]. La evidencia sugiere que miRNAs pueden funcionar como una nueva clase de ambos genes tumorigénicas y supresores de tumores [30]. En este estudio, se prepara en primer lugar diez muestras de CaP y diez muestras de HPB, sin embargo, sólo cinco muestras de CaP y tres muestras de HPB cumplen el estándar de proyección de prueba de microarrays. Tras el análisis de microarrays miARN y en tiempo real la confirmación RT-PCR, hemos demostrado que el miR-182 es aumentada en los tejidos con CaP chinos, en comparación con los tejidos de la HBP. El resultado regulación al alza de miR-182 fue consistente con el estudio realizado por Schaefer A et al [14]. A continuación, que reveló que la expresión de miR-182 se incrementó notablemente en cuatro líneas comunes CaP celulares ensayadas (PC-3, DU145, 22Rv1 y LNCaP), en comparación con epitelio prostático normal-1 RWPE celular, lo que indica que miR-182 es upregulated en células CaP líneas y PC-3 tiene el más alto nivel de expresión. A continuación, se eligieron las células PC-3 para su posterior estudio. A continuación demostramos que el miR-182 se dirige específicamente a la NDRG1 3'-UTR en células PC-3.
Estudios previos revelaron que NDRG1 era un gen supresor de la metástasis tumoral o gen supresor del CP [21], [24] , [25]. Nuestro estudio también mostró que NDRG1 se downregulated en los tejidos de CaP y células PC-3 en comparación con los tejidos de BPH y células RWPE-1 (datos no presentados). Además experimento funcional mostró que la regulación por disminución de NDRG1 podría aumentar la proliferación y la invasión de las células PC-3, y la regulación positiva de NDRG1 podría disminuir la proliferación y la invasión de células PC-3 (datos no mostrados). Los estudios demostraron que la regulación molecular de NDRG1 invovles PTEN [21], [26], P21 [22], Wnt-β-catenina [23], el factor activador de la transcripción 3 [24], ATF3-NF kappaB complejos [25] y p53 [27]. Sin embargo, no se informó sobre NDRG1 regulada por microARN en el CaP para promover la proliferación de forma clara y directa todavía. Es la primera vez para nosotros para descubrir la nueva relación de regulación de NDRG1 y microARN en el CaP. Hemos observado que el miR-182 se sobreexpresa significativamente en líneas celulares de CaP, en comparación con RWPE-1. Por otra parte, la sobreexpresión ectópica de miR-182 promueve significativamente la proliferación, aumenta la invasión, promueve la transición del ciclo celular G1 /S y reduce la apoptosis temprana de las células PC-3, mientras que la supresión de miR-182 disminuyó la proliferación e invasión, inhibe el G1 /transición del ciclo celular S y aumento apoptosis temprana de células PC-3. Con el fin de explorar el mecanismo de miR-182, se identificaron NDRG1 como un putativo de miR-182 gen diana mediante el análisis bioinformático, y confirmamos que NDRG1 es un objetivo directo de miR-182 mediante el ensayo de gen indicador de luciferasa dual. Estos resultados mostraron que el miR-182 aumenta la proliferación e invasión de células de CaP PC-3 atacando directamente a la NDRG1 3'-UTR regular a la baja NDRG1
.
En los últimos años, NDRG1 ha sido descrito como un supresor tumoral potencial gen en diversos cánceres humanos, y puede estar asociada con la agresividad del tumor y la metástasis [31] - [34]. Sin embargo, el silenciamiento de machanism NDRG1 todavía no está claro. Una forma en la que las células de cáncer de silenciar la expresión de gen supresor de tumores son alteraciones epigenéticas, que incluyen la hipermetilación del ADN de las islas CpG promotoras y /o cambios en modificaciones de las histonas post-traduccionales asociadas que conducen a la represión transcripcional [35]. El promotor de NDRG1 contiene una gran isla CpG, aumentando la posibilidad de que podría ser silenciado por la hipermetilación del ADN en el cáncer. Por lo tanto, los investigadores comienzan a estudiar la regulación epigenética de NDRG1 recientemente. Angustia et al [36] estudio mostró que la expresión NDRG1 puede ser regulada por la inhibición farmacológica de la metilación del ADN y la desacetilación de histonas en células de cáncer pancreático. Sin embargo, no se encontró ninguna metilación de la isla CpG del promotor NDRG1 en células de cáncer pancreático, lo que sugiere un mecanismo indirecto para NDRG1 de-represión por estos tratamientos. Li y Chen estudio [37] mostraron que el silenciamiento de NDRG1 en líneas celulares de cáncer de colon SW620 y SW480 se debió a modificaciones de las histonas, que no sean la hipermetilación del promotor. Sin embargo, Chang et al estudio [38] mostró que la disminución de expresión de NDRG1 mRNA y proteína en líneas celulares de cáncer gástrico y los tejidos fue debido a la metilación del promotor de gen NDRG1. Estos estudios sugieren que la regulación epigenética de la NDRG1 es diferente en diferentes tipos de células cancerosas. En este estudio, mostramos que NDRG1 podría ser dirigido directamente por el miR-182 y descubrieron una nueva regulación epigenética de la NDRG1, lo que sugiere que la regulación al alza de miR-182 puede proporcionar un mecanismo alternativo para la reducción de la expresión de la proteína supresora de tumores NDRG1 en células de CaP .
la investigación adicional sigue siendo necesaria para examinar si otros miRNAs o vías de señalización puede regular NDRG1 en el CaP, porque no podíamos excluir que podría haber otras microARN, que no se encuentran, sin embargo, que desempeñan un papel importante en la regulación NDRG1 en el CP, y si el miR-182 puede dirigirse a otros miembros de la familia NDRG1. Por ejemplo, sería interesante saber si otras vías participan en el efecto antiproliferativo de NDRG1 e investigar lo que otros componentes del fenotipo maligno se determina por NDRG1 y miRNAs en células de CaP, y estos temas son actualmente bajo investigación en nuestro de laboratorio.
Conclusiones
En resumen, la principal conclusión de este estudio es que el miR-182 puede aumentar la proliferación de líneas celulares de CaP por la orientación NDRG1. Estos datos indican que el miR-182 juega un papel esencial en la regulación de la proliferación celular y el CP puede funcionar como un onco-miARN. MiR-182 puede cortar como una nueva diana terapéutica para el tratamiento del CaP.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
diferencialmente expresado miRNAs entre los tejidos de CaP y HPB. miRs negrita fueron regulados a la baja MIR en los tejidos con CaP
doi:. 10.1371 /journal.pone.0068982.s001 gratis (DOC)