Abstract> Objetivo
La desregulación de FOXM1 se ha documentado en varios tipos de cáncer. El objetivo de este estudio fue evaluar el papel de FOXM1 en la tumorigénesis cáncer de ovario y la resistencia a paclitaxel.
Diseño Experimental
Expresión de FOXM1 se examinó en 119 muestras clínicas mediante técnicas de inmunohistoquímica y se correlacionan con parámetros clínico . También se estudiaron los efectos de FOXM1 caída en la migración de células de cáncer de ovario, la invasión y catástrofe mitótica. qPCR y chip-qPCR fueron utilizados para establecer KIF2C como un nuevo gen diana FOXM1 implicada en la quimio-resistencia.
Resultados
Alta expresión FOXM1 nuclear en muestras de pacientes con cáncer de ovario se asoció significativamente con estadios avanzados (
P = 0,035
), más corto en general (
P = 0,019
) y (
P = 0,014
) la supervivencia libre de enfermedad. El análisis multivariado confirmó la expresión FOXM1 como un factor pronóstico independiente para el cáncer de ovario. FOXM1 desmontables migración inhibió significativamente y la invasión de células de cáncer de ovario y el aumento de la muerte celular mediada por paclitaxel-y catástrofe mitótica de una manera independiente de p53. Bioinformática análisis sugirió una serie de posibles dianas de transcripción de FOXM1. Uno de los objetivos potenciales, KIF2C, exhibieron patrón de expresión similar a FOXM1 en las células sensibles a la quimioterapia y quimiorresistentes en respuesta al tratamiento paclitaxel. FOXM1 se pudo detectar en el promotor de KIF2C y FOXM1 silenciar KIF2C significativamente las reguladas.
Conclusión
Nuestros hallazgos sugieren que FOXM1 se asocia con un peor pronóstico del paciente y contribuye a la resistencia a paclitaxel mediante el bloqueo mitótico catástrofe. KIF2C es identificado como una nueva diana transcripcional FOXM1 que pueden estar implicados en la adquisición de la quimio-resistencia. FOXM1 debe investigarse más como un potencial marcador pronóstico y la diana terapéutica para el cáncer de ovario
Visto:. Zhao M, Siu MKY, Jiang L, Tam KF, Ngan HYS, Le XF, et al. (2014) sobreexpresión de la proteína forkhead caja M1 (FOXM1) en el cáncer de ovario se correlaciona con escasa supervivencia del paciente y contribuye a la resistencia paclitaxel. PLoS ONE 9 (11): e113478. doi: 10.1371 /journal.pone.0113478
Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Centro Médico Hospital Infantil de Cincinnati, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Febrero, 2014; Aceptado: 28 Octubre 2014; Publicado: noviembre 20, 2014
Derechos de Autor © 2014 Zhao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Fung Zhao es un beneficiario de una beca conjunta HKU-ICL. Ana Gomes es un post-doctorado apoyado por el Cancer Research UK. Laura Bella está apoyado por una beca de la Campaña de Cáncer de Mama. Pasarat Khongkow es apoyado por becas del Gobierno Real de Tailandia. El trabajo de Eric Lam es apoyado por becas de la campaña Cáncer de Mama y Cancer Research UK. El trabajo de Annie Cheung es apoyado por fondos del Consejo de Ayudas a la Investigación de la RAE. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es el cáncer ginecológico más letal en todo el mundo como la mayoría de los pacientes, cuando se diagnostica, se presentan con enfermedad avanzada [1]. A pesar de la mejora en la supervivencia media se ha observado en las últimas décadas, las tasas de recaída y mortalidad siguen siendo elevadas debido en parte a la adquisición de la quimio-resistencia [2]. Una combinación de paclitaxel y carboplatino ha sido ampliamente utilizado como la quimioterapia de primera línea para pacientes con cáncer de ovario. Paclitaxel actúa específicamente durante la fase G2-M del ciclo celular mediante la inducción de husillos anormales y la interrupción de la dinámica de los microtúbulos, bloqueando así la progresión del ciclo celular. A pesar de su eficacia inicial como un agente terapéutico del cáncer, en la mayoría de casos, los pacientes con el tiempo se vuelven insensibles a la quimioterapia y la recaída a base de paclitaxel. Por tanto, es vital para identificar nuevos marcadores de pronóstico y dianas terapéuticas, en particular los genes relacionados con la metástasis y la resistencia a los medicamentos.
caja forkhead (FOX) proteínas pertenecen a una superfamilia de factores de transcripción conservadas evolutivamente responsable de la multa espacio-temporal -tuning de un amplio repertorio de programas transcripcionales que son necesarios para la homeostasis normal y el desarrollo [3]. Entre los cuales, forkhead proteína cuadro de M1 (FOXM1) participa en una amplia gama de procesos biológicos incluyendo la proliferación celular, la progresión del ciclo celular, diferenciación celular, daño en el DNA de reparación, la homeostasis del tejido, la angiogénesis y la apoptosis [4], [5]. Por lo tanto, no es sorprendente que la desregulación de FOXM1 podría resultar en severas condiciones patológicas, incluyendo cáncer. De hecho, FOXM1 sobreexpresión se ha documentado en los cánceres de pulmón, mama, hígado, próstata y colon, etc. lo que sugiere que FOXM1 tiene un papel clave en la tumorigénesis [3], [6]. Recientemente, se ha demostrado que la expresión desregulada FOXM1 puede conferir resistencia a los fármacos quimioterapéuticos, tales como cisplatino y epirrubicina, mediante la protección de las células contra el daño de ADN inducido por la muerte celular, e interrumpiendo el puesto de control mitótico [7] - [9].
en este estudio, se investigó el patrón de expresión de FOXM1 en el cáncer de ovario. Los efectos de la expresión FOXM1 sobre la migración de células de cáncer, la invasión y la resistencia a paclitaxel también se han estudiado en un intento de evaluar FOXM1 como marcador pronóstico molecular potencial y objetivo terapéutico para el cáncer de ovario. Se llevaron a cabo análisis adicionales para identificar KIF2C como un objetivo transcripcional novela FOXM1 que podrían estar implicados en la adquisición de la quimio-resistencia.
Materiales y Métodos
Las muestras clínicas y líneas celulares
Archivo bloques de parafina de tejidos embebidos desde el año 1987 y 2004 se recuperaron del Departamento de Patología, hospital Queen Mary, de la Universidad de Hong Kong. Las muestras incluyeron 2 cistoadenomas benignos, 2 tumores borderline, 94 carcinomas primarios y 21 focos metastásicos de cáncer (al ligamento, el intestino, los ganglios linfáticos y la serosa uterina). Todos los pacientes con carcinoma sometieron a cirugía seguida de la quimioterapia de primera línea estándar, incluyendo platino /paclitaxel. El período de seguimiento varió desde 5 hasta 209 meses (mediana 63 meses). El uso de estas muestras fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de Ética. Cada muestra del paciente fue evaluada por los patólogos y aseguró que contienen más de 70% de células tumorales.
líneas celulares de cáncer de ovario Skov-3 y OVCAR-3 fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). células SKOV3-TR fueron un generoso regalo del Dr. Lawrence Le XF (División de Medicina del Cáncer de la Universidad de Texas, M. D. Anderson Cancer Center, Houston, Texas, EE.UU.) [10]. PEO1 y PEO1-TaxR son desarrollados recientemente líneas celulares y se han autenticado en las instalaciones de Investigación del Cáncer del Reino Unido. El uso de PEO1 y PEO1-TaxR en lugar de SKOV-3 y SKOV3-TR para algunos experimentos ofrece medios adicionales para asegurar que los mecanismos resistentes identificadas en SKOV-3 y SKOV3-TR son comunes a todas las células de cáncer de ovario resistentes a paclitaxel y no es exclusivo de SKOV-3 y SKOV3-TR. Es importante destacar que, tanto PEO1 y PEO1-TaxR se mantienen a los pasajes más bajos para evitar las derivas de la resistencia y la adquisición de mutaciones secundarias [10] [11]. OVCAR-3 se cultivó en 01:01 Medium 199 (Invitrogen, CA, EE.UU.): MCDB105 (Sigma, MO, EE.UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 100 unidades /ml de penicilina-estreptomicina (Invitrogen). SKOV3, SKOV3-TR, PEO1 y PEO1-TaxR se cultivaron en RPMI1640 (Sigma) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 100 unidades /ml de penicilina-estreptomicina (Invitrogen). PEO1-TaxR fue suplementado con 50 nM de paclitaxel. Todas las líneas celulares se mantuvieron a 37 ° C en una incubadora humidificada con 5% de CO
2. Medio de cultivo celular se cambió cada 3 a 5 días dependiendo de la densidad celular. Para el paso de rutina, cuando las células alcanzaron 85% a 90% de confluencia, que se dividieron en una relación de 01:04.
Inmunohistoquímica
La inmunohistoquímica se realizó como se describió anteriormente [12], [13 ]. Brevemente, las secciones de parafina fijadas con formalina se incubaron con anticuerpo anti-FOXM1 (NBP1-30961, 1:40, Novus Productos Biológicos, CO, EE.UU.) a temperatura ambiente durante la noche y se tiñeron usando Envision Sistema Dual Link + (K4061, Dako, CA, EE.UU.) . La recuperación del antígeno se llevó a cabo usando tampón de EDTA, pH 8,0, en una olla a presión durante 30 min. Todas las secciones fueron evaluados por dos investigadores independientes. La inmunorreactividad del anticuerpo FOXM1, la intensidad de las células teñidas y sus porcentajes se mide en términos de intensidad y las puntuaciones porcentuales, respectivamente. La puntuación porcentaje varió de 0 a 4: 0 = & lt; 5% de células teñidas positivamente, 1 = 5 a 25% de células teñidas positivamente, 2 = 26-60% de las células positivamente teñidas, 3 = 61 a 85% de positivamente las células teñidas, y 4 = 86-100% de células teñidas positivamente. Inmunohistoquímica (IHC) puntuación (de 0 a 16) se calculó multiplicando la puntuación de intensidad (0-4) y el porcentaje de puntuación (0-4), con una puntuación máxima de 16 [12], [13]. FoxM1 inmunorreactividades nucleares y citoplásmicas se puntuaron por separado.
Western blot
Se recogieron las células con tampón de lisis [0,125 m Tris, pH 6,8 a 22 ° C que contiene 1% NP-40 (v /v ), 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 2 mM de N-etilmaleimida, 2 mM de fluoruro de phenylmethanesulphonyl (PMSF), ortovanadato de sodio 1 mM y 0,1 micras okadate de sodio] y se centrifugó a 4 ° C durante 10 min. La concentración de proteína se determinó por (DC) de ensayo de proteínas compatible con detergente (Bio-Rad). Veinte microgramos de proteína se separaron mediante electroforesis en dodecil sulfato de sodio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), se transfirió a una membrana de difluoruro de polivinilideno y se hibridó con los siguientes anticuerpos: anti-FOXM1 (sc-502, Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.) , anti-caspasa 9 (9502, Cell Signaling Technology, MA, EE.UU.), anti-KIF2C (WH0011004M1, Sigma), anti-caspasa 7 (9492, Cell Signaling) y anti-β-tubulina (sc-9104, Santa Cruz Biotechnology ).
cuantitativa en tiempo real PCR
cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) se realizó utilizando la energía SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) y se analizó mediante sistema de detección de secuencias ABI7900 (Applied Biosystems ). L19 (RPL19), un gen de mantenimiento no regulado ribosomal se utilizó como un control interno para la normalización utilizando el método de Ct delta-delta. Se utilizaron los siguientes cebadores:
KIF2C Delantero 5 'a 3': CATGATTGCCACGATCTCAC
KIF2C Reverse 5 'a 3': CGTTAGAGCAGGCTTCCATC
L19 Delantero 5 'a 3': GCGGAAGGGTACAGCCAAT
L19 inverso 5 'a 3': GCAGCCGGCGCAAA
caída transitoria de FOXM1
En-Blanco Plus humano FOXM1 siRNA y no la orientación siRNAs control (Thermo Scientific, CO , EE.UU.) se utilizó para el silenciamiento transitoria de FOXM1 usando el reactivo de transfección Oligofectamine (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante.
in vitro
migración y la invasión ensayos
en Vitro
ensayos de migración e invasión se realizaron como se describe anteriormente [12], [13]. En pocas palabras, 1,25 × 10
5 células se sembraron en el compartimiento superior de una cámara Transwell (Corning Life Sciences, MA, USA). Para los ensayos de migración, se les permitió células para migrar a través de una membrana recubierta con gelatina. Para ensayos de invasión, se permitió a las células para invadir a través de una membrana de matrigel recubierto. Después de 24 h, las células en el lado superior de la membrana se retiraron y se fijaron las células migradas o invadidas, se tiñeron y se contaron.
fin de etiquetado dUTP nick TdT-mediada (TUNEL) de ensayo y la evaluación del índice de la catástrofe mitótica
tras FOXM1 caída durante 48 h y tratamiento con paclitaxel (50 nM) durante 24 h, ensayo de TUNEL se realizó utilizando Kit para la detección in situ de la muerte (Roche bioquímicos, IN, EE.UU.) siguiendo el protocolo del fabricante [14]. Apoptótica y las cifras de catástrofe mitótica se evaluaron bajo microscopía de fluorescencia. cifras de catástrofe mitótica se observaron cambios morfológicos en los núcleos (DAPI) [10]. Más de 1000 células viables en cada experimento se examinaron y el índice de la catástrofe mitótica se evaluó como porcentaje de las células contadas. Cada ensayo se realizó por triplicado.
Análisis del ciclo celular
El análisis del ciclo celular se realizó mediante tinción con yoduro de propidio como se describe anteriormente [15]. En resumen, se recogieron las células tanto adherentes y en suspensión y se tiñeron con yoduro de propidio (1 mg /ml) en presencia de RNasa libre de DNasa para el análisis de citometría de flujo. perfil del ciclo celular se analizó utilizando el software de la diva de la célula (Becton Dickinson UK Ltd.).
Inmunoprecipitación de cromatina
40 l de Dynabeads Proteína A (10002D, Invitrogen), se lavó con 200 l de TSE I buffer de tres veces y se diluye con 40 l de TSE I buffer. Anti-FOXM1 (SC502, Santa Cruz Biotechnology) (4 g) y el control de IgG de conejo (X0903, Dako) (4 g) fueron primero diluye por separado en tampón D, se mezcla con Dynabeads diluido y luego girar O /N a 4 ° C. células PEO1 y PEO1-TaxR en 90% de confluencia en placa de cultivo de 100 mm se reticularon con 1% de formaldehído durante 10 min, se enjuaga con PBS enfriado en hielo y se incubaron con 2,5 M de glicina por 5 min. Las células se recogieron a continuación con 2 ml de tampón de desguace. Después de un lavado secuencial con PBS, tampón I y Buffer II, sedimento celular se resuspendió en 300 l de tampón de lisis y se sometió a sonicación en condiciones optimizado (20 min con 30 s sobre y 30 s OFF). a continuación, el sobrenadante se diluyó en 300 l de tampón D a partir de los cuales 100 l se tomó como control de entrada. 200 l de lisado de células se mezclaron con Dynabeads preparados y girar O /N a 4 ° C. Después de un lavado secuencial con TSE I, TSE II, tampón III y tampón TE, se añadieron 100 l de tampón de elución a las Dynabeads y la mezcla se rotó a temperatura ambiente durante 1 h. muestra eluida se recogió en eppendorf y las Dynabeads se volvió a eluyó con otros 100 l de tampón de elución. 200 l de muestra fue de-reticularse mediante la incubación a 65 ° C O /N. a continuación, se utilizó PCR Purification Kit (Qiagen) para purificar ADN. Cuantitativa en tiempo real PCR se realizó con los siguientes cebadores: KIF2C (adelante 5 'a 3': GCCAAGTCTCCAACTTGCTC; inverso 5 'a 3': TTCCCAACCATCTTCCTACG)
chip-qPCR datos se normalizó con el control de IgG y se representa. como entrada por ciento. Composición de los tampones se enumeran en la Tabla 1.
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó mediante el paquete estadístico para Ciencias Sociales versión 19.0 para Windows (IBM). La comparación entre dos grupos de datos no paramétricos, se llevó a cabo por Mann-Whitney
T-test
. La probabilidad de supervivencia se analizó mediante el método de Kaplan-Meier. El análisis multivariado de factores pronósticos se realizó utilizando el modelo de regresión de Cox.
P-valores de
& lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos
Resultados
sobreexpresión FOXM1 se correlaciona con la supervivencia de los pobres
La expresión de FOXM1 nuclear. en los tumores benignos y borderline de ovario, así como los cánceres invasivos se evaluó por inmunohistoquímica. los cánceres de ovario muestran fuerte tinción nuclear FOXM1 que los tumores benignos y borderline. Sin embargo, no hubo diferencia significativa en la expresión entre FOXM1 carcinomas primarios y sus focos metastásicos (
P
= 0,6). FOXM1 expresión nuclear más alta se asoció significativamente con estadios avanzados de cáncer de ovario (
P = 0,035
) (fig. 1A). A pesar de no alcanzar significación estadística, FOXM1 sobreexpresión muestra una tendencia relacionada con el tipo histológico seroso (
P = 0,142
), cánceres de alto grado (diferenciación) pobre (
P = 0,235
) y quimio-resistencia (
P
= 0,282) (Tabla 2). Con el fin de estudiar la asociación de la expresión FOXM1 con el resultado de los pacientes, los pacientes se clasificaron en dos grupos utilizando el punto de puntuación de IHC & gt corte; 0. Como se muestra en el gráfico de la supervivencia global de Kaplan-Meier (fig. 1B), los pacientes con tinción negativa FOXM1 tenían un global significativamente mayor (
P = 0,019
) y la supervivencia libre de enfermedad (
P
= 0,014) que aquellos con expresión FOXM1 positivo. El análisis multivariado mostró la progresión de la alta expresión de FOXM1, etapas avanzadas de cáncer y pobre diferenciación histológica (alto grado) resultaron ser factores pronósticos independientes para la supervivencia a corto general (IC del 95%, 0,906-5,754, HR 2,283,
P
= 0,08; IC del 95%, 0,953-5,963, HR 2,384,
P
= 0,06; IC del 95%, 2,137 a 40,638, HR 9,318,
P = 0,003
, respectivamente) y disease- supervivencia libre (IC del 95%, 1,025-6,631, HR 2,607,
P
= 0,04; IC del 95%, 1,039-6,555, HR 2,61,
P
= 0,04; IC del 95%, 1.821 -35.091, HR 7,993,
P = 0,006
, respectivamente). Curiosamente, la tinción citoplásmica de FOXM1 también se detectó en Además de la expresión nuclear, pero no se observó correlación significativa con clinicopathological parámetros (datos no mostrados).
A, Imágenes representativas de inmunorreactividad de FOXM1 nuclear en (I) benigna cistoadenoma, (II) tumor dudoso, (III) en estadio I cáncer invasivo, (IV) en estadio II cáncer invasivo, (V) fase III de cáncer invasivo y cáncer invasivo (VI) en estadio IV. Aumentos X400. Inserciones: Las regiones con mayores aumentos de tinción nuclear FOXM1. B, acumulativos parcelas en general y supervivencia libre de enfermedad utilizando el método de Kaplan-Meier.
caída transitoria de FOXM1 inhibe-3 SKOV la migración celular y la invasión
A continuación estudió el papel de FOXM1 en la progresión del cáncer de ovario.
In Vitro
se emplearon Transwell ensayos para estudiar los efectos de silenciamiento transitorio de FOXM1 en la motilidad celular y la invasión del cáncer ovárico. De manera significativa disminución de la migración y la invasión (
P
& lt; 0,05) se observó en células SKOV-3 transfectadas con en-blanco Plus humano FOXM1 siRNA (siFOXM1) en comparación con las células transfectadas con ARNsi de control (siCONTROL), indicando que desmontables de FOXM1 era capaz de inhibir la migración y la invasión de las células SKOV3 (Fig. 2).
A. Imágenes representativas que muestran las células migraron (membrana recubierta con gelatina) o (membrana de Matrigel recubierto de) invadido después de 24 h. B. Análisis de transferencia Western Representante demostrar la eficacia de FOXM1 caída transitoria en SKOV-3. C. Representación gráfica de la migración (panel izquierdo) y la invasión (panel derecho) resultados como factor de cambio de las células migradas y invadido con respecto al control, respectivamente, en cinco campos de pozos por triplicado a partir de tres experimentos independientes; * P & lt; 0,05, significativo; Mann-Whitney
T-test
.
tratamiento con paclitaxel regula a la baja la expresión de FOXM1 en Skov-3, pero no en el paclitaxel resistente SKOV3-TR
vista de la tinción muestra IHC que la expresión elevada FOXM1 se asocia con un mal pronóstico y por lo tanto la quimiorresistencia, un par de línea celular de cáncer de ovario establecido sensibles y resistentes a paclitaxel, a saber, SKOV-3 y SKOV3-TR respectivamente, se utiliza para estudiar el efecto de tratamiento con paclitaxel sobre la expresión de FOXM1. Las células se trataron con paclitaxel (100 nM) y se recogieron en varios puntos a 0, 8, 16, 24, 48 y 72 h de tiempo. Curiosamente, inmunotransferencia mostró expresión FOXM1 ser disminuida a las 48 h y 72 h en Skov-3. Sin embargo, la expresión FOXM1 se mantuvo relativamente constante a altos niveles en SKOV3-TR por tratamiento paclitaxel (Fig. 3), lo que sugiere un papel de FOXM1 en la mediación de la resistencia a paclitaxel en células de cáncer de ovario. En particular, hay también parecía ser sólo aumentos marginales de la expresión de la caspasa-9 escindido y la caspasa-7 tanto en SKOV-3 y SKOV3-TR tras el tratamiento paclitaxel, lo que sugiere que la apoptosis puede no ser el mecanismo predominante de inducir la muerte celular en estos células de carcinoma de ovario.
El paclitaxel sensible SKOV-3 y las células de cáncer de ovario SKOV3-TR resistentes fueron tratados con 100 nM de paclitaxel y se cosecha en los tiempos indicados para análisis de transferencia Western. tratamiento con paclitaxel redujo reguladas expresión FOXM1 en puntos de tiempo de 48 h y 72 h en Skov-3 pero no en SKOV3-TR como se muestra por inmunotransferencia. Tampoco hubo cambios marcados en la expresión de caspasa-9 y caspasa-7 escindido.
silenciamiento transitorio de FOXM1 mejora significativamente paclitaxel mediada por la catástrofe mitótica
que anteriormente mostró que el paclitaxel mata células de cáncer de ovario predominantemente mediante la inducción de la catástrofe mitótica en lugar de la apoptosis en las células [10]. Para elucidar el papel potencial de FOXM1 en la quimiorresistencia cáncer de ovario, líneas celulares de cáncer de ovario Skov-3 y OVCAR3 fueron tratados con paclitaxel durante 24 h después de FOXM1 agotamiento de siRNA, teñidas con DAPI y examinadas por microscopía fluorescente. El resultado mostró que había un mayor número de células multinucleadas (flecha) en las células de cáncer de ovario, con la eliminación FOXM1 (
P = 0,03
y 0,01, respectivamente) (Fig. 4), lo que sugiere el agotamiento FOXM1 mejorado significativamente paclitaxel catástrofe mitótica mediada tanto en Skov-3 y OVCAR3. Es notable que la apoptosis era apenas detectable en estas células tratados con paclitaxel. Esto se debe probablemente al hecho de que tanto SKOV-3 y OVCAR3 albergan p53 disfuncional, y se requiere p53 funcional para la apoptosis inducida por paclitaxel en células de cáncer de ovario.
células Skov-3 y OVCAR3 transfectadas con cualquiera de piscinas siRNA contra FOXM1 o piscinas siRNA de control fueron tratados con paclitaxel (100 nM) y se tiñeron con DAPI. A. resultados de la tinción representativos se muestran mostrando que FOXM1 transitoria desmontables mejorado significativamente la catástrofe mitótica inducida por paclitaxel (flecha) en las células SKOV-3 y OVCAR3 respectivamente (panel superior). B. gráficos representan los resultados de tres experimentos independientes, mostrando el porcentaje de las células sometidas a la catástrofe mitótica, * P & lt; 0,05, significativo; Mann-Whitney
T-test
.
caída FOXM1 induce aumentos modestos en la acumulación de G2 /M y las células muertas tras el tratamiento con paclitaxel en la línea celular SKOV3-TR resistente
análisis del ciclo celular para dilucidar el papel de FOXM1 en la muerte celular paclitaxel mediada. Con este fin, las células SKOV-3 y SKOV3-TR fueron transfectadas transitoriamente con el control y FOXM1 siRNA durante 48 h y se cultivaron en la presencia o ausencia de tratamiento con paclitaxel (100 nM) durante 48 h. Se recogieron las células resultantes, se tiñeron con yoduro de propidio y se sometieron a análisis de citometría de flujo. Los resultados mostraron que el paclitaxel induce niveles significativos de muerte celular (población sub-G1) en células SKOV-3 transfectadas con cualquiera de FOXM1 o controlar piscina siRNA (Fig. 5A, panel superior). Aumento del número de células acumuladas con contenidos de sub-G1 ADN en SKOV3-TR con FOXM1 desmontables (8,1%) (Fig. 5A, panel superior) en comparación con SKOV3-TR transfectadas con ARNsi de control (4.2%) (Fig. 5A, panel superior ), lo que sugiere FOXM1 contribuye a la resistencia paclitaxel en células de cáncer de ovario y de que el silenciamiento FOXM1 puede mejorar la muerte celular paclitaxel mediada. Tras el tratamiento paclitaxel, un modesto aumento de las células bloqueadas en fase G2 /M también se observó en SKOV3-TR tratados con siRNA contra FOXM1 en comparación con el control, lo que sugiere silenciamiento FOXM1 podría aumentar la muerte celular paclitaxel mediada a través de la catástrofe mitótica (Fig. 5A, panel inferior; Fig. 5B). El agotamiento de FOXM1 en las células sensibles SKOV-3 no tiene efecto aditivo de tratamiento con paclitaxel. Esto es probablemente debido al hecho de que las funciones de paclitaxel a través de la regulación negativa de la expresión FOXM1 según lo revelado por el análisis de transferencia Western (véase Fig. 3).
A. Análisis de citometría de flujo se realizó siguiendo propidio tinción de yoduro en las células tratadas con paclitaxel (100 nM) o permaneció sin tratar después de la transfección con piscinas siRNA contra FOXM1 o controlar piscinas siRNA SKOV-3 y SKOV-TR-3. Los datos representativos se muestran indicando que FOXM1 silenciamiento es capaz de aumentar el número de células muertas y células bloqueadas en fase del ciclo celular G2 /M en SKOV-3-TR en comparación con las células tratadas con el control de siRNA. B. gráficos de barras de las diferentes fases del ciclo celular en Skov-3 y SKOV3-TR tratados con paclitaxel después de la transfección con el control o siRNA contra FOXM1. Los resultados representan los datos de dos experimentos independientes.
KIF2C se identifica como una novela FOXM1 objetivo transcripcional que pueden estar implicados en la adquisición de la quimio-resistencia
Bioinformática análisis reveló KIF2C, un miembro de la KIF superfamilia de proteínas, como un potencial objetivo de genes de FOXM1 con forkhead consenso sitios localizados aguas arriba del sitio de inicio de transcripción (Fig. 6D) de unión. Con un par de paclitaxel-sensible (PEO1) y resistentes a (PEO1-TaxR) línea celular de cáncer de ovario, el tratamiento con paclitaxel redujo regulado la expresión de KIF2C a las 48 hy 72 h en PEO1. Sin embargo, la expresión KIF2C se mantuvo relativamente constante en PEO1-TaxR al tratamiento con paclitaxel (Fig. 6A), lo que sugiere un papel de KIF2C en la mediación de la resistencia a paclitaxel en células de cáncer de ovario. Curiosamente, las expresiones de FOXM1 cambiaron en un patrón similar (Fig. 6A). A continuación se utilizó cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) para estudiar el efecto de silenciamiento transitorio de FOXM1 en el nivel de transcripción de KIF2C. FOXM1 caída dio lugar a expresiones significativamente las reguladas de mRNA de KIF2C en ambas líneas celulares (P & lt; 0,05) (Figura 6B.). Inmunoprecipitación de la cromatina-qPCR (chip-qPCR) mostró además FOXM1 era capaz de unirse a la región promotora del KIF2C (P & lt; 0,05). (Fig. 6C), lo que implica KIF2C podría servir como una nueva diana transcripcional FOXM1
Un tratamiento de paclitaxel (50 nM) las reguladas FoxM1 y KIF2C expresiones a las 48 hy 72 h en PEO1 pero no en PEO1-TaxR. B, FOXM1 caída redujo significativamente el nivel de transcripción de KIF2C en PEO1 y PEO1-TaxR. Los datos representan por triplicado a partir de tres experimentos. * P = 0,04, *** P = 0,0003. siCONTROL: el control no específica. siFOXM1: caída FOXM1. C, chip-qPCR mostró FOXM1 tire hacia abajo de manera significativa en la región promotora KIF2C PEO1 y PEO1-TaxR en comparación con el control negativo de IgG. Los datos representan por triplicado a partir de tres experimentos. * P = 0,04, *** P = 0,0001. D, Esquema lugares de forkhead elemento de respuesta (FHRE) y el sitio de unión de los cebadores utilizados en el chip-qPCR aguas arriba del sitio de inicio de transcripción de KIF2C que representa.
Discusión
este estudio, mostramos que la expresión de alto FOXM1 nuclear se correlaciona significativamente con el estadio, menor supervivencia global y la supervivencia libre de enfermedad de los pacientes con cáncer de ovario. El análisis multivariado indica que la expresión FOXM1 podría servir como un factor pronóstico independiente. Además, el agotamiento de FOXM1 transitoria es capaz de inhibir la migración de células de cáncer de ovario. Estos hallazgos sugieren que FOXM1 puede tener un papel crucial en la carcinogénesis y la progresión de ovario y puede predecir el resultado de los pacientes
.
A pesar de que la asociación de FOXM1 con carcinomas de ovario de alto grado se ha comunicado [16], ya sea FOXM1 participa en la adquisición de resistencia paclitaxel permanece indefinido. De hecho, la expresión desregulada FOXM1 se ha demostrado que confieren resistencia a fármacos quimioterapéuticos tales como cisplatino y epirubicina [8], [9]. En vista de la conclusión que sugiere la asociación entre la inmunohistoquímica FOXM1 y quimio-resistencia, un par de líneas celulares establecidas de paclitaxel-sensibles y resistentes, Skov-3 y SKOV3-TR [10], fueron empleados para estudiar el efecto de paclitaxel sobre FOXM1. Curiosamente, el tratamiento con paclitaxel dio lugar a baja regulación de FOXM1 en Skov-3, pero no en la línea celular resistente a SKOV3-TR, lo que implica un papel de FOXM1 en la mediación de la resistencia a paclitaxel en células de cáncer de ovario. estudio de inmunofluorescencia mostró además transitoria knockdown FOXM1 podría aumentar la muerte celular mediada por paclitaxel-en dos líneas celulares de cáncer de ovario, SKOV-3 (p53 suprimido) [17] y OVCAR3 (p53 mutante) [18]. No es sorprendente que las células apoptóticas estaban apenas detectable como ambas líneas celulares albergan p53 disfuncional. Recientemente, se sugirió que la inducción de apoptosis independiente de p53 se lleva a cabo a través de la activación de la caspasa-9 [19]. Sin embargo, la inmunotransferencia reveló la caspasa-9 no se ha activado por tratamiento paclitaxel en células-TR Skov-3 Skov-3 y, lo que indica que tanto el paclitaxel y FOXM1 silenciar la muerte celular efecto principalmente a través de la mejora de la catástrofe mitótica en lugar de la apoptosis en células de cáncer de ovario, que comúnmente tienen vía p53 disfuncional. Esto es consistente con los hallazgos anteriores en paclitaxel en el cáncer de mama [20].
catástrofe mitótica puede ser considerado como un tipo de muerte celular que se produce durante la mitosis o como resultado de la insuficiencia mitótico [21]. Dos mecanismos han sido sugeridos como crucial para la catástrofe mitótica, a saber, la G2 /M y los puntos de control del huso mitótico [22]. Para el G2 /M puesto de control, la inactivación de los genes, como
p53
,
p21
ADN Cip1
y
14-3-3Sigma
se ha informado que inducen los daños provocados por la catástrofe mitótica [23], [24]. Análisis de citometría de flujo realizado en nuestro estudio sugiere caída FOXM1 en el quimioresistente línea celular de cáncer de ovario SKOV3-TR podría inducir la muerte celular. tratamiento con paclitaxel y el análisis de inmunofluorescencia sugirieron además silenciamiento FOXM1 podría mejorar paclitaxel mediada por catástrofe mitótica de una manera independiente de p53 y la caspasa-9-independiente. Delineación del mecanismo subyacente por el cual FOXM1 media la resistencia paclitaxel arrojará luz sobre nuevos enfoques de tratamiento.
Kinesin proteínas de la superfamilia (kifs) juegan un papel fundamental en el transporte intracelular de orgánulos y mantenimiento de ensamblaje del huso durante la mitosis y la meiosis [ ,,,0],25]. Al ser el miembro fundador y mejor caracterizado de la familia Kinesin-13, KIF2C /MCAK es crucial para garantizar la segregación fiel de cromosomas en mitosis y para salvaguardar la estabilidad cromosómica [26]. No es de extrañar, arriba-regulaciones de KIF2C se han documentado en varios cánceres humanos y KIF2C se ha sugerido que desempeñar un papel importante en la carcinogénesis [27], [28]. En el estudio actual, el análisis de inmunotransferencia mostró expresión en KIF2C PEO1 alterado en un patrón similar a la expresión FOXM1 mostrando una regulación a la baja a las 48 hy 72 h tras el tratamiento con paclitaxel. En cambio, la expresión KIF2C se mantuvo relativamente constante en PEO1-TaxR, implicando KIF2C podría estar involucrado en el desarrollo de la resistencia a paclitaxel en el cáncer de ovario. Este hallazgo es consistente con un informe reciente que demuestra la pérdida de KIF2C podría aumentar la sensibilidad de ovario de hámster chino (CHO) a paclitaxel [29]. Además, KIF2C fue identificado como un objetivo transcripcional novela FOXM1 que podrían desempeñar un papel fundamental en la mediación de la resistencia a paclitaxel en células de cáncer de ovario.
En conclusión, se encontró que la sobreexpresión de FOXM1 que se correlaciona con la supervivencia de los pacientes y para pobres paclitaxel mediada por catástrofe mitótica en células de cáncer de ovario.