Extracto
La respuesta de las células hipóxicas glicolítica es mediado principalmente por la hipoxia inducible factor alfa (HIF-1α), pero aun en la presencia de tumores de oxígeno abundantes típicamente muestran altas tasas de glucólisis. Los mayores niveles de HIF-1α en los tumores se asocian con un peor pronóstico y la regulación de los marcadores de la transición epitelio mesénquima (EMT) debido a las acciones de HIF-1α. Recientemente hemos demostrado que la EMT se produce dentro de la fracción CD44
células madre del cáncer de alto (CSC) y que epiteliales y células madre cancerosas EMT se distinguen por la expresión de alto y bajo de la ESA, respectivamente. Nosotros mostramos aquí que la hipoxia induce un marcado cambio de la fracción CSC hacia la EMT que conduce a la morfología celular alterada, una mayor proporción de CD44
alta /ESA
baja células, los patrones de expresión de genes típicos de la EMT, y una mayor esfera- formación de capacidad. El tamaño de las fracciones de EMT volvió a controlar los niveles en normoxia que indican un proceso reversible. Sorprendentemente, sin embargo, incluso en condiciones de normoxia una fracción de células madre cancerosas EMT estaba presente y mantiene altos niveles de HIF-1α, al parecer debido a las acciones de las citoquinas tales como TNF. Funcionalmente, esta fracción EMT CSC mostraron disminución de potencial de masa y de la membrana mitocondrial, consume mucho menos oxígeno por célula, y producidos marcadamente reducidos niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS). Estas diferencias en los patrones de metabolismo del oxígeno de sub-fracciones de células tumorales proporcionan una explicación para la resistencia terapéutica general de células madre cancerosas y para la mayor resistencia de EMT CSC. También identifican posibles mecanismos para la manipulación de células madre cancerosas
Visto:. Gammon L, Biddle A, Heywood HK, Johannessen AC, IC Mackenzie (2013) subconjuntos de células madre del cáncer diferencian intrínsecamente en sus patrones de metabolismo del oxígeno . PLoS ONE 8 (4): e62493. doi: 10.1371 /journal.pone.0062493
Editor: Yao Liang Tang, de la Universidad de Cincinnati, Estados Unidos de América
Recibido: 20 Octubre, 2012; Aceptado: March 22, 2013; Publicado: 30 de abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Gammon et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación de Investigación de la Anemia de Fanconi, NC3Rs, Barts y The London Caridad, y el Consejo de Investigación médica de Noruega. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los tumores son muy glicolítico incluso en la presencia de abundante oxígeno, el llamado "efecto de Warburg" [1], [2]. Factor inducible por hipoxia 1 alfa (HIF-1α) es el factor principal regulación de las respuestas hipóxicas celulares [3]. En niveles altos de oxígeno, HIF-1α se ubiquitinated y destinada a la degradación, mientras que en los niveles de oxígeno más bajos degradación se inhibe y HIF-1α se transloca al núcleo donde se dimeriza con la hipoxia inducible factor de 1 beta (HIF-1β) y se une a la respuesta a la hipoxia elementos (HREs) de genes diana que ayudan a la adaptación celular a la hipoxia [4]. La sobreexpresión de HIF-1α se produce en una amplia gama de cánceres primarios y metastásicos [5], y es responsable de una serie de propiedades relacionadas con el tumor, incluyendo una reducción de especies reactivas de oxígeno [6], el aumento de radio-resistencia [7] - [ ,,,0],9], y la protección de las células de la apoptosis inducida por drogas [10] y la senescencia [11]
.
tumor invasión y metástasis son cada vez más asociado con las células madre del cáncer (CSC), un subconjunto de células cancerosas que se es capaz de auto-renovación, tiene capacidad iniciadoras del tumor, y es resistente a la terapia [12], [13]. Tanto la invasión local del tumor y la metástasis a sitios distantes requieren capacidades migratorias adquieren a través de transición epitelial a mesenquimal (EMT) de células madre cancerosas [14] durante el cual se pierden las características epiteliales y las proteínas epiteliales tales como E-cadherina se redujeron reguladas y de las proteínas mesenquimales como vimentina y gire hasta reguladas [15]. La inducción de la EMT en líneas celulares de mama resultados en las células adquieren el fenotipo marcador típico de células madre cancerosas de mama, una mayor movilidad y resistencia a los agentes terapéuticos [16], [17].
En CECC y varios otros carcinomas, sub- poblaciones de células madre cancerosas tienen alta expresión de CD44 [18] - [21]. Recientemente hemos demostrado que, en líneas celulares derivadas de carcinomas orales y de la piel, la EMT se produce dentro de la
elevada fracción CSC CD44 resulta en dos fenotipos CSC, uno que es epiteliales y muestra una alta expresión del antígeno específico epitelial (ESA), y otro que tiene las características de la EMT y baja expresión de la eSA [22]. Los CSC puede cambiar entre el epitelio y los fenotipos de la EMT y las dos fracciones de iniciar tumores después de
in vivo
trasplante de murino [22]. Ya que varios estudios han relación directa existente entre la hipoxia y la alta HIF-1α a EMT [23] - [26], que desea saber si existen diferencias metabólicas innatas relacionadas con la utilización de oxígeno entre el epitelio y fenotipos EMT CSC. Se demuestra que los niveles bajos de oxígeno de forma reversible aumentan el tamaño de las fracciones de EMT dentro de las líneas celulares CECC y que, en comparación con las células madre cancerosas epiteliales (Epi CSC), EMT células madre cancerosas tienen niveles más altos de la proteína de respuesta hipóxica HIF-1α, incluso en condiciones de normoxia. Hay también grandes diferencias en el metabolismo de esta subpoblación con los niveles más altos de expresión de HIF-1α en EMT células madre cancerosas se correlaciona con la regulación de genes glicolíticas, una marcada reducción en el consumo de oxígeno, la disminución de potencial de masa y de la membrana mitocondrial, y reducción de la producción de reactivos Las especies de oxígeno (ROS).
Materiales y Métodos
Cultivo celular y la inducción hipóxica
HNSCC líneas celulares se cultivaron como se ha descrito anteriormente [19]. Con la excepción de H357 [27], todas las líneas celulares (Ca1, LuC4, CaLH2, CaLH3) y queratinocitos orales normales (NOK2 & Amp; NOK3) se obtuvieron en nuestro laboratorio. El tejido se recoge con el consentimiento informado por escrito siguiendo un protocolo (cáncer oral, 04 /Q0601 /53) aprobada por el NE London & amp; El Comité de Ética de la Ciudad. la inducción hipóxica involucrado el cultivo de células en una cámara hipóxica InVivo1000 (Ruskinn Ciencias de la Vida, Gales, Reino Unido) en el 0,2% o 2% de O
2 con 5% de CO
2. estabilización de HIF-1α utiliza Dimethyloxalylglycine 1 mM (DMOG) (Sigma) y la inhibición 3- (5'-hidroximetil-2 '-furil) -1-benzylindazole (YC-1) (Sigma) a 10 mM o 50 mM. Para el ensayo de formación de esferas, placas se recubrieron con poliHEMA (Sigma) (12 mg /ml en 95% de etanol) para inhibir la unión de células cultivadas en placas a 1000 células /pocillo en medio FAD con la adición de 1% methlycellose (Sigma). células tratadas con TNF se cultivaron durante 6 ó 24 horas con 10 ng /ml de TNF recombinante (I + amp; D Systems Cat#210-TA-010).
Western Blot
Western Blot se realiza como descrito anteriormente [28]. La cuantificación de proteínas utiliza un ensayo de Bradford y los anticuerpos y las diluciones fueron los siguientes; HIF-1α - Ratón 1:1000 Cat#610958 BD, HIF-2α - Conejo -1:500 Cat#ab20654 Abcam, β-actina - Ratón 1:10,000 Cat#ab8226 Abcam, GAPDH - Conejo 1:10,000 Cat#ab9485 Abcam , PDK1- ratón 1:1000 Cat#ab110025 Abcam, SOD2- conejo 1:5000 Cat#ab13533 Abcam, BVS -. conejo -1:1000 Cat#ab28434 Abcam, y TNFR1- conejo -1:1000 Cat#ab19139
Tiempo real q-PCR
se extrajo el ARN como se describe anteriormente [22], transcripción inversa en ADNc realizó utilizando Superíndice III de la primera cadena supermix síntesis (Invitrogen). ADNc se normalizó contra el gen de referencia 28S-RNA. QPCR se llevó a cabo en un sistema de ABI7500 PCR en tiempo real utilizando SYBR Potencia mezcla verde (Applied Biosystems). Ver apoyar archivo de información (información de apoyo S1) para las condiciones y secuencias de cebadores completos.
Citometría de Flujo
Las células se analizaron en un Becton Dickenson (BD) LSR II y células activadas por fluorescencia (FACS ) se realizó en un BD Facs Aria. Las células cultivadas se despegaron usando Accutase (PAA), se resuspendieron en PBS a 1 × 10
6 células /ml y se incubaron con los anticuerpos contra CD44 (clon G44-26, biociencias BD) y ESA (clon HEA-125, Miltenyi Biotec) en 1:100 durante 15 minutos. Las células se lavaron una vez antes de volver a suspender en PBS fresco con DAPI (Sigma) a 200 ng /ml para excluir las células muertas.
oxígeno y mediciones de ROS
El consumo de oxígeno de las fracciones línea celular se medido en placas de biosensores de oxígeno de 96 pocillos (BD Biosciences, Oxford, Reino Unido Cat#353830) utilizando el protocolo adaptado por Heywood et al [29], para mediciones cuantitativas. ROS tinción se llevó a cabo en fracciones de células vivas ordena con CellROX ™ (Invitrogen) a 5 mM junto con Hoechst 33342 a 20 mg /ml durante 30 minutos según las instrucciones del fabricante. La cuantificación se obtuvo mediante análisis de citometría de flujo de células teñidas triples para la ESA, CD44 y CellROX ™.
lactato y glucosa Ensayos
El lactato se determinó como se informó anteriormente, con 1 × 10
5 las células se resuspendieron en 100 l de medio (sin rojo fenol) y se incubaron durante 8 horas. El lactato se calculó por comparación con una curva estándar para el lactato (Sigma L1750), que van desde 0 hasta 10 mM. Las concentraciones de glucosa se determinaron usando un kit de ensayo colorimétrico de la glucosa (Abcam, ab65333). fracción de fermentación de lactato se calculó por comparación del lactato expulsado con el máximo teórico calculado para la glucosa utilizada.
mitocondriales Ensayos
masa mitocondrial se evaluó mediante MitoTracker Green ™ (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Los cultivos se cultivan a partir de la densidad clonal, separada de la antena. y se incubaron durante 15 minutos a 37 ° C con 50 nM MitoTracker (verde) antes de lavar y el análisis. Para la membrana mitocondrial interna suspensiones celulares potencial (IMMP) se cargaron con Dil
1C (40 nM) (Invitrogen) y se incubaron a 37 ° C durante 15 minutos antes de lavar una vez y volver a suspender en PBS fresco. Los valores medios de las fracciones de la EMT y no EMT CSC se expresaron como fracciones de los valores de las poblaciones parentales correspondientes.
Análisis del ciclo celular
Para los análisis del ciclo celular, las suspensiones de células fueron fijadas en 70 % de etanol, se lavó una vez en PBS y se incubaron en DAPI (1 ug /ml) (Sigma) durante 20 minutos junto con anticuerpos contra CD44 y la ESA.
Análisis estadístico
Todos los experimentos se repitieron una mínimo de 3 veces y las comparaciones entre los valores se realizaron usando una prueba t pareada de dos colas a menos que se indique lo contrario. Las barras de error son reportados como ± SEM.
Resultados
A largo plazo hipoxia promueve un fenotipo EMT y aumenta una subpoblación caracteriza por una disminución de la ESA
Para evaluar las respuestas celulares a la hipoxia rebajado las concentraciones de oxígeno, líneas celulares 3 HNSSC (Ca1, H357 y LuC4) se cultivaron en cualquiera de normoxia (~ 20% o
2) o hipoxia (2% o 0,2%) los niveles de oxígeno antes de la preparación de lisados de proteínas para evaluar HIF-1α estabilización. Todas las líneas celulares respondieron a la hipoxia con el aumento de la proteína HIF-1α (Fig. 1). Para determinar los efectos de la hipoxia en el tamaño de EMT subpoblaciones [22], las células se cultivaron en condiciones de hipoxia para un máximo de 21 días y se examinaron para cambios morfológicos. cultivos a largo plazo (14-21 días) mostraron una marcada disminución en el número de células formadoras de colonias cohesivos y un aumento en el número de células similares a fibroblastos (Fig. 2A). Para establecer si este cambio morfológico representado el desarrollo de una población de EMT, las células fueron analizadas por citometría de flujo para el CD44
alta /ESA
EMT fenotipo bajo identificada previamente [22]. Para todas las líneas celulares, la hipoxia a largo plazo dio lugar a un gran aumento de CD44
alta /ESA
fracciones celulares bajas (Fig. 2B, Fig. 2C). El aumento de la EMT eran menos en el 2% que en 0,2% de oxígeno. El inhibidor de la prolilhidroxilasa, DMOG, dio como resultado la estabilización de HIF-1α, y también una cierta estabilización de HIF-2α (Fig. 2D). Esto se asoció con un aumento de células con un EMT-como, la apariencia y el CD44
alta /ESA
baja fenotipo (Fig. 2D). Para determinar la reversibilidad de EMT después de la retirada de la hipoxia, las células cultivadas en 0,2% de oxígeno durante 21 días fueron devueltos a las condiciones de normoxia y evaluados por citometría de flujo a intervalos de 7 días. En todas las líneas, el tamaño de la
alta /ESA
fracción de bajo EMT CD44 disminuyó con el tiempo y por 21 días había vuelto de nuevo a los niveles de los cultivos de control (Fig. 2E).
Western blot de lisados de proteínas de líneas de células CA1 H357 y LuC4 después de cultivo bajo normoxia (N), el 2% y el 0,2% de oxígeno
A.; imágenes de contraste de fase CA1, H357 y células LuC4 cultivan en condiciones de cultivo de normoxia e hipoxia 0,2% durante 21 días (insertados: un aumento mayor de las células EMT-like). SEGUNDO; citometría de análisis que indica un cambio en la tinción para CD44 (eje y) y la ESA (eje x) de las células resultantes de la hipoxia. DO; análisis de los aumentos de la EMT resultantes de la hipoxia. RE; el crecimiento de la línea celular Ca1 durante 21 días con 1 DMOG mM como resultado cambios morfológicos (arriba), los cambios en CD44 y tinción de la ESA (centro), estabilización de HIF-1α, pero poco cambio en HIF-2α correspondiente (parte inferior izquierda), y una aumento de la fracción de EMT (abajo a la derecha). MI; disminución dependiente del tiempo en el tamaño de las fracciones EMT hipoxia inducida después de la vuelta a las condiciones de normoxia.
La hipoxia induce una población de células con patrones de expresión de genes relacionados con el aumento de la EMT y Esfera Formación de Capacidad
para determinar si el agrandamiento de CD44
alta /ESA
baja fracción inducida por la hipoxia tenía patrones de expresión genética típica de la EMT, las subpoblaciones de células FACS Ca1 fueron ordenados antes de la extracción de RNA. En comparación con el SEC
alta /CD44
fracción de alto (Epi CSC), CD44
alta /ESA
bajas (EMT) fracciones mostraron, como se informó anteriormente [22], una mayor expresión de la EMT- genes relacionados torcer y vimentina y disminución de la expresión de e-cadherina (Fig. 3A). ensayos de formación de esfera, que han sido utilizados como sustitutos para ensayos de células madre cancerosas [30], se llevaron a cabo para determinar si el aumento de EMT inducida por hipoxia aumentó el número de células con este rasgo de células madre. Para todas las líneas celulares, las poblaciones no fraccionados de células mantenidas en condiciones de hipoxia durante 21 días forman un mayor número de esferas que las células cultivadas en condiciones de normoxia (Fig 3B & amp;. 3C). El inhibidor de HIF-1α YC-1 reduce los niveles basales de HIF-1α en condiciones de normoxia (figura 3D.) Y la disminución de la capacidad de formar esfera (figura 3E).
A.; doble cambio en la expresión de genes marcadores de EMT para CD44
/ESA
células bajos en relación con CD44
/ESA
células alta alta alta. SEGUNDO; muestras representativas de las culturas que forman la esfera después de 21 días de crecimiento en condiciones de normoxia e hipoxia. DO; aumento en la formación esfera después del cultivo hipóxico. RE; disminución de los niveles basales de HIF-1α en cultivos de normoxia H357 después de la adición de YC-1. MI; disminución de la formación de esferas de normoxia tras la adición de YC-1 (izquierda) y microscopía de fase (derecha) de control y YC-1 (10 mM) los cultivos tratados esfera.
EMT subfracciones han aumentado HIF -1α y sobre regulación de los genes del metabolismo anaeróbico
en condiciones de normoxia, líneas celulares de cáncer, como los tumores de origen, por lo general muestran una mayor proporción de la energía derivada de los procesos de glucolíticas, junto con mayores niveles de HIF-1α [ ,,,0],5]. cultivos de líneas celulares de normoxia HNSCC mostraron mayores niveles basales de HIF-1α de NOK (Fig. 4A). El aumento adicional en las células EMT inducida por hipoxia sugiere que la expresión de HIF-1α puede diferir entre CSC subfracciones. Por lo tanto, las fracciones de la EMT y Epi CSC fueron ordenados de las líneas celulares Ca1 y LuC4 para la comparación con sus poblaciones no fraccionadas. En comparación con Epi CSC o de las poblaciones parentales, las células EMT mostraron mayores niveles de HIF-1α mientras que HIF-2α fue mayor en la fracción Epi CSC (Fig. 4B). A medida que los niveles más altos de HIF-1α en fracciones EMT podrían ser producidos por cualquiera de degradación reducida o aumento de la producción de la proteína, se evaluó la proteína de Von Hippel-Lindau (pVHL) que se dirige a HIF-1α para la degradación proteasomal. Sin embargo, no se encontraron diferencias entre las fracciones de los niveles de proteína pVHL (Fig 4C). El examen de la producción de HIF-1α dentro de la fracción EMT, se encontró que el mensaje para HIF-1α fue elevada (Fig. 4D) lo que sugiere que el aumento de la producción en lugar de disminuir la degradación conduce a los elevados niveles observados en células EMT. Producción de HIF-1α en condiciones de normoxia se incrementa en respuesta a la TNF de citoquinas inflamatorias, [31] y esta citocina es también un potente inductor de EMT [32]. Para evaluar los efectos de TNF sobre la HIF-1α dentro de nuestras líneas celulares de líneas en condiciones de normoxia, las células se cultivaron con TNFa durante 6 o 24 horas. En ambos puntos de tiempo, y en las dos líneas ensayadas, se observaron niveles elevados de HIF-1α (Fig. 4E). a continuación, se investigó si las sub-fracciones Epi y EMT respondieron diferencialmente a TNFa y encontraron que los altos niveles basales de HIF-1α presente en las fracciones de la EMT se elevaron aún más por TNFa (figura 4F). No tiene efecto sobre la subpoblación Epi CSC se vio que indica un efecto selectiva de la fracción EMT, tal vez debido a las mayores cantidades del receptor de TNF 1 (TNFR1) expresado por estas células
A.; la comparación por el Western Blot de la expresión de normoxia de HIF-1α en líneas celulares de NOK y HNSCC. SEGUNDO; HIF-1α y la expresión de HIF-2α en ordenadas los padres, fracciones EMT CSC CSC y Epi de las líneas celulares Ca1 y LuC4 bajo normoxia. DO; western blot para los niveles pVHL en fracciones clasificadas de la línea celular Ca1. RE; Evaluación PCR de HIF-1α expresó como niveles de EMT CSC relativos a los niveles de Epi CSC para la línea celular Ca1. MI; respuesta de los niveles de HIF-1α de líneas Ca1 y LuC4 al tratamiento con 10 ng /ml TNF de 6 o 24 horas bajo condiciones de normoxia. F; transferencias Western para de HIF-1α y TNFR1 en subfracciones de la línea celular Ca1 después del tratamiento TNFa. GRAMO; Evaluación de PCR de dianas génicas glicolíticas expresa como niveles de EMT CSC relación a los niveles de Epi CSC dentro de la línea celular Ca1. MARIDO; imágenes de fase representativa microscópicas de Epi y células EMT (izquierda) y la comparación de dispersión frontal para las fracciones de la EMT y Epi CSC (derecha).
Para evaluar si los más altos niveles de HIF-1α presentes dentro de las células EMT menores condiciones de normoxia correlacionados con el aumento de la expresión de HIF-1 genes aguas abajo, se examinaron 3 objetivos glucolíticas. Hexoquinasa II (HEX2), piruvato deshidrogenasa quinasa 1 (PDK1) y lactato deshidrogenasa A (LDHA), todas resultaron ser aumentado en la fracción de EMT en comparación con la fracción Epi CSC (Fig. 4G). Como se informó PDK1 para influir en la proporción de glucosa utilizado para la fermentación a lactato se investigó si los aumentos observados en HIF-1α y sus genes diana glucolíticas se correlacionan con cambios en el metabolismo de la glucosa y la producción de lactato. (Fig. S1A) No se observaron diferencias en los niveles de proteína PDK1 entre fracciones y examen de consumo de glucosa y producción de lactato reveló una proporción similar de glucosa anaeróbicamente metaboliza para cada fracción, independientemente de la expresión de HIF-1α (Fig S1B & amp;. C). Sin embargo la demanda total de energía puede estar relacionado con el tamaño celular y EMT células madre cancerosas se encontró que eran más pequeñas que las CSC Epi, una observación confirmada por análisis de dispersión hacia adelante (Fig. 4H).
El consumo de oxígeno se reduce en gran medida en las células Normóxico EMT y se asocia con el ciclo celular alterada, la reducción de ROS, y los cambios mitocondriales
hipóxico regulación de PDK1 por HIF1 afecta a la función mitocondrial, el metabolismo del oxígeno y la producción de ROS [6], [33]. Para evaluar si el aumento de los niveles de HIF-1α presentes en fracciones de EMT de normoxia se correlacionan con las funciones de HIF-1α en fracciones hipóxicas, ordenadas sub-fracciones de las culturas de normoxia se analizaron para determinar el consumo de oxígeno. Durante la primera hora, y persiste durante la duración del ensayo (Fig. 5A), el consumo de oxígeno por las fracciones de EMT de ambas líneas celulares Ca1 y LuC4 fue de aproximadamente 25% menos que cualquiera de las fracciones Epi CSC o poblaciones parentales.
A; el consumo de oxígeno relativa de fracciones EMT y Epi CSC comparación con la de la línea parental para la primera hora (paneles superiores) y para Ca1 más de 2 horas (a continuación). SEGUNDO; imágenes de inmunofluorescencia que comparan los niveles de ROS en células madre cancerosas EMT y Epi contrastados con Hoechst. DO; citometría de flujo análisis de los niveles medios de ROS de la EMT y Epi células madre cancerosas en relación con las células parentales. RE; PCR veces diferencias de SOD2 entre EMT y Epi células madre cancerosas. MI; transferencias Western de HIF-1α y SOD2 para los 3 sub-fracciones de línea celular Ca1. F; significa la masa mitocondrial de la EMT y Epi células madre cancerosas en relación con las células parentales. GRAMO; comparación de IMMP de la EMT y Epi células madre cancerosas en relación con las células parentales. MARIDO; perfiles del ciclo celular para EMT y Epi CSC fracciones de las líneas celulares.
3
Para establecer si se reduce el consumo de oxígeno en correlación con la reducción de los niveles de ROS de células EMT, EMT en vivo y células Epi CSC se compararon mediante la ROS marcador CellRox ™ Reactivo de color rojo oscuro. Mucho menos tinción para este marcador fue visto por células EMT (Fig. 5B) y la cuantificación por citometría de ROS en las células triples teñidas para la ESA, CD44 y CellRox ™ confirmaron menos ROS en la población de EMT CSC (Fig. 5C). QPCR (Fig. 5D). Western Blot (Figura 5E) mostraron el eliminador de ROS superóxido dismutasa 2 (SOD2) para ser altamente expresado en células madre cancerosas EMT.
A medida que se produce la fosforilación oxidativa dentro de la mitocondria, se prevé que el consumo de oxígeno alterado podría estar relacionado con mitocondrial alterada estados dentro de CSC subpoblaciones. Por lo tanto, las diferencias en la masa mitocondrial total entre celulares subpoblaciones fueron evaluados por triple tinción para la ESA, CD44 y MitoTracker Green ™. Para todas las líneas celulares, fracciones EMT mostraron significativamente menos masa mitocondrial (~ 10%) que la población de los padres y una sorprendente reducción del 40% en comparación con la población Epi CSC (Fig. 5F). Como marcador de functon, potencial de la membrana mitocondrial interna (IMMP) se evaluó por las células de carga con Dil
1C (5). Esto mostró una IMMP inferior (~ 10%) para las fracciones de la EMT que las poblaciones parentales y un nivel aún más bajo en comparación con Epi células madre cancerosas (Fig. 5G). La evaluación de las diferencias del ciclo celular entre fracciones de células indicó que Epi CSC tendía a acumularse en G2, como se muestra anteriormente [18], mientras que la mayoría de las células EMT estaban presentes en G1 (Fig. 5H).
Discusión
recientemente hemos descrito la heterogeneidad dentro de la CSC subpoblación [22] y que, si bien la mayoría de las células madre cancerosas tienen un CD44
alto alto de células fenotipo de superficie /eSA
y expresan marcadores epiteliales, una fracción de tamaño variable de los CAC se ha sometido a la EMT. poblaciones tanto de la Epi y EMT CSC son auto-renovación de
in vitro Opiniones y son tumores iniciar si se transplantan
in vivo gratis (25). Sin embargo, EMT células madre cancerosas son resistentes a la anoikis y tienen una mayor capacidad para crecer en suspensión como esferas tumorales, una propiedad que proporciona un ensayo sustituto para esta población. Evaluó morfológicamente o como CD44
alta /ESA
células bajas, la pequeña fracción de EMT típicamente presente en líneas celulares bajo condiciones de normoxia aumenta en gran medida en respuesta a la hipoxia o después de la estabilización de la proteína HIF-1α, cambia en consonancia con los informes anteriores [23] - [26]. Esta población ampliada, se muestra un perfil de expresión de genes típicos de EMT y ha mejorado la capacidad de formación de esferas. Después de la degradación acelerada de HIF-1α hay una reducción en la formación de esfera. Tomados en conjunto, estos hallazgos indican que HIF-1α tiene un papel funcional en la inducción y el mantenimiento del fenotipo CSC EMT.
HIF-1α es reconocido para conducir las células hacia un fenotipo metabólico con la disminución del metabolismo oxidativo y el aumento de la producción de lactato, mediada en parte por la sobre regulación de PDK-1 [6], [33]. En condiciones de normoxia, nos encontramos con una tasa de aproximadamente un 50% mayor de la síntesis de HIF-1α dentro de la fracción de EMT y que esta correlacionada con los niveles más altos de proteína. niveles similares de proteína pVHL sugirieron ningún cambio en la tasa de degradación y por lo tanto, llegamos a la conclusión de que el mayor nivel de HIF-1α dentro de la EMT se mantiene gracias a una mayor producción. Se ha informado de EMT ser inducida por TGF-β1, interleuquinas y citoquinas inflamatorias tales como TNF, que también ha sido reportado para aumentar la producción de HIF-1α [31]. Hemos confirmado respuestas similares de nuestras líneas celulares y también muestran que las células EMT responden selectivamente a TNFa mediante el aumento de su nivel de HIF-1α. Esta importante implica a efectos de la microenviroment tumor en el cambio y el mantenimiento del fenotipo EMT y por lo tanto la progresión y la invasión de tumores.
HIF-1α producción también se ha sugerido debido a un bucle de alimentación hacia adelante con PDK-1 [ ,,,0],34]. Sin embargo, aunque se halló una mayor mensaje para PDK-1 dentro de la subpoblación de EMT CSC encontramos ningún cambio en los niveles de proteína. También se encontraron diferencias entre las fracciones epiteliales y EMT en la proporción de glucosa metabolizada a lactato, que era alrededor del 60% para todas las subpoblaciones, un porcentaje similar a la reportada por Warburg hace más de 80 años [1]. Sin embargo, proporcional al tamaño de EMT CSC, la cantidad de uso de la glucosa sería mayor y esto se toma junto con la marcada reducción en el consumo de oxígeno, sugiere una menor dependencia de la fosforilación oxidativa de ser menos activa metabólicamente que Epi CSC células EMT. Los cambios en el ciclo celular se encuentran también son indicativos de un fenotipo más quiescente EMT como se ha demostrado previamente para células EMT en líneas HNSCC [35].
En la hipoxia, HIF1 actuando a través de PDK1 [6] conduce a una reducción en la mitocondria el consumo de oxígeno [33] y la reducción de la producción de ROS. La sobreexpresión de la PDK1 también se correlaciona con mal pronóstico [36]. Se encontraron altos niveles de expresión de HIF-1α y PDK1 dentro de la población de normoxia CSC EMT acompañada de una reducción en el consumo de oxígeno y bajos niveles de ROS, cambios similares a los reportados para las células en condiciones hipóxicas. Los altos niveles de SOD2 en EMT CSC también funcionarían para inactivar tales ROS como podría ser producido. Papandreou y compañeros de trabajo [33], el examen de las poblaciones de tumores no fraccionados, detectaron cambios estructurales en las mitocondrias. Sin embargo, el análisis de diferencias entre CSC sub-fracciones mostraron una reducción de la masa mitocondrial en células madre cancerosas EMT junto con un IMMP relativa inferior que apunta a la reducción de la función mitocondrial. Zhang et al [37] han informado de las acciones represivas de HIF1 en la biogénesis mitocondrial a través de la represión de la transcripción por C-Myc [38], [39] y hemos informado anteriormente de baja regulación de c-myc en la EMT de normoxia subpoblación [ ,,,0],22]. análisis de PCR (datos no mostrados) indican también en la regulación de c-Myc dentro de las fracciones hipóxicas EMT agrandados.
Los CCC tienen varias propiedades únicas que los distinguen de la mayor parte de la población de células de diferenciación [12], [18 ], [30] y publicaciones recientes han asociado adquisición de propiedades de células madre con la EMT. Por ejemplo, la inducción de la EMT en una línea de células de mama no tumorigénicos por el tratamiento con TGF-β1 conduce a la adquisición de la CD44
alta /CD24
fenotipo de la superficie celular baja típica de células madre cancerosas de mama que tienen tumores iniciadoras y el tumor -sphere habilidades forman [16]. La radioterapia se utiliza ampliamente para el tratamiento de HNSCC y bajos niveles de oxígeno y ROS celular, junto con los niveles más altos de antioxidantes, son mediadores críticos de la muerte celular reducida por irradiación [12]. Los bajos niveles de oxígeno están asociados con el fracaso de la radioterapia [40] y por lo tanto de especial interés clínico que la inducción hipóxica de células madre cancerosas en el fenotipo EMT aún aumentaría aún más la resistencia general a diversas modalidades terapéuticas mostrada por los CAC [17] es. Los datos actuales se extiende estos resultados, en primer lugar mediante el apoyo a la presencia, como se informó anteriormente [22], de los dos fenotipos de células madre y, en segundo lugar, al mostrar varias propiedades adicionales del fenotipo EMT CSC que son susceptibles de ser asociados con la resistencia terapéutica mejorada. Las propiedades metabólicas de la fracción EMT CSC, y su aumento de tamaño en la hipoxia, por lo tanto, son propensos a actuar para mejorar la resistencia a la radiación. Además, el ciclo celular más lenta y la reducción mitocondrial en células madre cancerosas EMT también pueden tener implicaciones para las respuestas apoptóticas a las drogas, tanto la radiación y anti-cáncer. Parece que la eliminación terapéutica de la población EMT menos metabólicamente activos requerirán tratamiento específico y que los modelos de inducción de la EMT, tanto a través de la hipoxia y citoquinas puede proporcionar una plataforma fundamental para el desarrollo de este tipo de terapias.
Apoyo a la Información
Figura S1.
utilización de la glucosa fracción Sub. UN; transferencias Western de los niveles de PDK1 fracciones sub. SEGUNDO; el uso de glucosa (izquierda), lactato expulsado (centro) y el porcentaje de la glucosa se metaboliza para formar lactato de (a la derecha) en la línea celular Ca1 y C; en la línea celular LuC4
doi:. 10.1371 /journal.pone.0062493.s001 gratis (TIF)
información de apoyo S1.
QPCR Condiciones y cebadores
doi: 10.1371. /journal.pone.0062493.s002 gratis (DOC)
Reconocimientos
Agradecemos al Dr. Gary Warnes por su asistencia técnica y el Dr. Daniela Elena Costea por su aportación fundamental en el diseño del estudio.