Extracto
El aumento de glutatión (GSH) y tiorredoxina metabolismo (Trx) son mecanismos que son ampliamente implicado en la resistencia del cáncer las células a la quimioterapia. El objetivo fue determinar si la inhibición simultánea de GSH y el metabolismo mejorado Trx la muerte celular de las células de carcinoma de células escamosas del cuello (CECC) cabeza humana y por un mecanismo que implica el estrés oxidativo. La inhibición de GSH y el metabolismo Trx con butionina sulfoximina (BSO) y auranofina (AUR), respectivamente, inducidos disminuciones significativas en la supervivencia clonogénico en comparación con cualquiera de los fármacos solos en Fadu Cal-27 y SCC-25 CECC células
in vitro
y
in vivo Hoteles en Cal-27 xenoinjertos. BSO + AUR aumentó significativamente el glutatión y la oxidación tiorredoxina y suprimió la actividad peroxiredoxin
in vitro
. Pre-tratamiento con N-acetilcisteína revirtió completamente la muerte celular inducida por AUR BSO + en las células FaDu y Cal-27, mientras que la catalasa y la administración de suplementos de selenio solamente indujeron-AUR inhibido BSO + muerte celular en las células FaDu. BSO + AUR disminuyó la caspasa 3/7 actividad en las células HNSCC y redujo significativamente la viabilidad de ambos Bax /Bak doble knockout (DKO) y DKO-Bax reconstituido células hematopoyéticas que sugieren que la necrosis estaba involucrado. BSO + AUR también sensibiliza significativamente Fadu Cal-27, SCC-25 y células SQ20B a la muerte celular inducida por el inhibidor de EGFR erlotinib
in vitro
. Estos resultados apoyan la conclusión de que la inhibición simultánea de GSH y el metabolismo Trx vías induce el estrés oxidativo y la muerte clonogénico en HNSCCs y esta estrategia puede ser útil en la sensibilización de HNSCCs a los inhibidores de EGFR
Visto:. Sobhakumari A, Amor-L Homan , Fletcher EVM, Martin SM, Parsons AD, Spitz DR, et al. (2012) susceptibilidad de las células cabeza humana y el cáncer del cuello en Combinado La inhibición de glutation y la tiorredoxina Metabolismo. PLoS ONE 7 (10): e48175. doi: 10.1371 /journal.pone.0048175
Editor: Jinah Choi, Universidad de California en Merced, Estados Unidos de América
Recibido: 19 Junio, 2012; Aceptado 21 de septiembre de 2012; Publicado: 31 Octubre 2012
Derechos de Autor © 2012 Sobhakumari et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos nacionales de Salud Subvenciones K01CA134941 (ELA), R01CA133114 y P30CA086862 (DRS), así como los Departamentos de Patología y Oncología de Radiación de la Universidad de Iowa. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la resistencia adquirida a la quimioterapia es un obstáculo importante para la cabeza y el tratamiento exitoso del cuello carcinoma de células escamosas (HNSCC). pacientes HNSCC etapa temprana tienen un alto riesgo de desarrollar tumores secundarios incluso después de que el control local se logra [1] - [3]. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos moleculares asociados con la resistencia a la quimioterapia en las células del cáncer podría conducir a mejoras en la supervivencia del paciente
el aumento de glutatión (GSH) y tiorredoxina metabolismo (Trx) son mecanismos que han sido ampliamente implicados en la resistencia a la quimioterapia [4] - [7] y los dos de estas vías de metabolismo juegan un papel importante en las especies reactivas de oxígeno (ROS) desintoxicación [ ,,,0],8] - [11]. El sistema funciona de GSH a través de la glutatión peroxidasa (GPx) enzimas, que inactivan H
2O
2 y otros hidroperóxidos (incluyendo peróxidos de alquilo y de lípidos) por conversión de GSH a glutatión disulfuro (GSSG), que se convierte de nuevo a GSH por la glutatión reductasa (GR), utilizando NADPH ([12], Figura 1 a). El sistema Trx está implicado en la desintoxicación de H
2O
2 y hidroperóxidos a través de la acción de peroxirredoxinas (Prx). Durante este proceso, oxidado Trx (Trx [S
2]) se forma que después se reduce por la tiorredoxina reductasa (TR) también mediante reducción de los equivalentes de NADPH (Figura 1A [13])
A.: NADPH es una fuente de equivalentes de reducción para el sistema de glutatión que consiste en glutatión reducido (GSH), glutatión disulfuro (GSSG), glutatión peroxidasa (GPx) y la glutatión reductasa (GR) y el sistema de tiorredoxina que consiste en la reducción de tiorredoxina [Trx (SH)
2], tiorredoxina disulfuro [Trx (S
2)], peroxiredoxin (Prx), y la tiorredoxina reductasa (TR). BSO inhibe γ-glutamilcisteína de la ligasa (GCL), que cataliza la reacción entre la cisteína y L-glutamato para formar γ-glutamil-cisteína. El glutatión sintetasa (GS) convierte γ-GCS sobre el GSH. AUR inhibe la actividad de TR. FaDu, Cal-27 y SCC-25 células se trataron con 0,5 mM AUR y /o BSO 1 mM durante 24 h y se analizó para GSH total de (B) y la actividad TR (C). Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM) de N = 3 experimentos *, p & lt;. 0.05 versus control
Numerosos estudios en los últimos años han explorado estrategias para inhibir individualmente GSH o el metabolismo Trx en Además de los agentes quimioterapéuticos convencionales, pero han dado resultados variables [14] - [16], probablemente debido a las funciones de protección redundantes de estos sistemas [17] - [20]. Dado que ambos sistemas desintoxicar H
2O
2 y utilizar NADPH como equivalentes reductores, es lógico que los dos sistemas de GSH y Trx tienen funciones superpuestas y redundantes en la detoxificación de ROS. Para superar la redundancia en estas vías en que se refieren a la resistencia a la terapia en HNSCC, el presente estudio determinó el efecto de forma simultánea la inhibición tanto de la GSH y Trx metabolismo utilizando sulfoximina butionina (BSO; un inhibidor de la síntesis de GSH), y auranofina (AUR; un inhibidor de la actividad TR
in vitro
y
in vivo
. se constató que esta estrategia sea muy eficaz en la mejora de la destrucción de células tumorales estrés oxidativo mediado y mejorar la sensibilidad a la quimioterapia Erlotinib.
Materiales y Métodos
células y condiciones de cultivo
Fadu se obtuvieron células Cal-27 y SCC-25 humanos carcinoma de cabeza y cuello (CECC escamosas) de la American Type Culture Collection ( ATCC, Manassas, VA). SQ20B células HNSCC [21] fueron un regalo del doctor Anjali Gupta (Departamento de Oncología de Radiación de la Universidad de Iowa). Todas las líneas celulares fueron CECC p53 mutante. se obtuvieron células HNEpC de PromoCell (Heidelberg, Alemania). Todas las líneas celulares fueron autenticadas por la ATCC para la viabilidad (antes de la congelación y después de la descongelación), el crecimiento, la morfología y isoenzymology. Las células se almacenan de acuerdo con las instrucciones del proveedor y utilizados en un curso de no más de 3 meses después de la reanimación de alícuotas congeladas. Bax /Bak-doble knockout (DKO) y DKO-Bax reconstituyen las células hematopoyéticas de ratón fueron un generoso regalo del Dr. Craig Thompson (Universidad de Pennsylvania, Philadelphia, PA). FaDu, cal-27 y SQ20B células se mantuvieron en medio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) que contiene 4 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 1,5 g /bicarbonato de sodio L y 4,5 g /l de glucosa con suero bovino fetal al 10% (FBS ; Hyclone, Logan, UT). se mantuvieron SCC-25 células en una mezcla 01:01 de medio de Eagle modificado de Dulbecco y medio F12 de Ham que contiene bicarbonato /L de sodio 1,2 g, 2,5 mM L-glutamina, HEPES 15 mM, piruvato de sodio 0,5 mM, 4,5 g /l de glucosa, y 400 ng /ml de hidrocortisona con suero bovino fetal 10%. células DKO y DKO-Bax se mantuvieron en RPMI 1640 suplementado con 10% FBS, 2 mM L-glutamina, penicilina 100 U /ml, 100 g /ml de estreptomicina y 50 mM 2-mercaptoetanol. células HNEpC se mantuvieron en la vía aérea epitelial Medio de Crecimiento (PromoCell) que contiene 4 l /ml de extracto de pituitaria bovina, 10 ng /ml de factor de crecimiento epidérmico, 5 mg /ml de insulina, 0,5 mg /ml de hidrocortisona, 0,5 mg /ml de epinefrina, 6,7 ng /ml triyodo-L-tironina y ácido retinoico 0,1 ng /mL. Los cultivos se mantuvieron en 5% de CO
2 y humidificado en una incubadora a 37 °.
Tratamiento de Drogas
pegilado catalasa (CAT), estaurosporina (STS), ionomicina (ION) y L-buthionine- [S, R] -sulfoximine (BSO) se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Auranofina (AUR) se obtuvo de ICN Biochemicals (Aurora, OH). Erlotinib (ERL) comercializado como Tarceva y N-acetilcisteína (NAC) comercializado como Acetadote (Cumberland Pharmaceuticals, Nashville TN), se obtuvieron de la farmacia para pacientes hospitalizados en la Universidad de Iowa Hospitales y Clínicas. Todos los fármacos se usaron sin purificación adicional. Los fármacos se añadieron a las células a concentraciones finales de 1 mM BSO, 0,5 M AUR, NAC 20 mM, 1.000 U /ml CAT, 10 mM ERL, 10 M STS y 100 mM de iones. BSO, CAT, y SEL se disolvieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS). AUR, STS, ERL e ION se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO). Se añadió el volumen requerido de cada fármaco a los medios de cultivo celular en las células para conseguir las concentraciones finales deseadas. vehículos de control se incluyen con cada experimento.
ensayo de glutatión
El glutatión reducido (GSH) y glutatión disulfuro (GSSG) se determinaron utilizando un kit de ensayo de glutatión comercial (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) . Todas las determinaciones de glutatión se normalizaron a las proteínas de los homogeneizados de enteros utilizando el método de Bradford.
tiorredoxina reductasa Ensayo
actividad
tiorredoxina reductasa (TR) se determinó espectrofotométricamente usando un kit de ensayo de la tiorredoxina reductasa comercial (Cayman química, Ann Arbor, MI). Las concentraciones de proteínas se determinaron por el método de Bradford.
Viabilidad de las células
La viabilidad celular se midió utilizando el reactivo viabilidad celular Prestoblue ™ (Invitrogen, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
experimentos de supervivencia celular clonigénicas
se determinó la supervivencia clonogénico como se describe anteriormente [21]. ensayos individuales se realizaron con diluciones múltiples con al menos cuatro platos de clonación por punto de datos, repetidos en al menos 3 experimentos separados.
siRNA transfección
tiorredoxina reductasa (TR) y de control de siRNA se adquirieron de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA). células HNSCC fueron transfectadas con 20 nM de ARNsi en 80% de confluencia en de Eagle reducido de suero medio esencial mínimo (EMEM, Santa Cruz, CA) durante 24 h. Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) se utilizó para las transfecciones siguientes protocolos proporcionados por el fabricante. Los análisis bioquímicos se realizaron 48-72 h después de la transfección.
caspasa 3/7 3/7 Actividad
actividad
La caspasa se evaluó mediante el ensayo Triplex ™ ApoTox-Glo (Promega Corporation, Madison, WI) .
Tiorredoxina redox transferencias Western
Las transferencias Western Tiorredoxina se realizaron como se describe anteriormente [22] - [25]. Las células se incubaron con 2 mM DL-ditiotreitol (DTT) o 2 mM H
2O
2 para 10 min a temperatura ambiente, antes de la incubación con IAA 50 mM para ser utilizado como controles para ayudar en la identificación de tiorredoxina bandas del estado redox.
el glutatión reductasa (GR) Ensayo
GR actividad se midió según el método descrito por Mavis y Stellwagen [26]. Los datos se normalizaron por mg de proteína como se determina por el ensayo de proteína Lowry.
se midió glutatión peroxidasa (GPx) La actividad
selenio dependiente de la actividad de GPx como se describe anteriormente [27]. Los datos se normalizaron por mg de proteína como se determina por el ensayo de proteína Lowry.
peroxiredoxina Ensayo de actividad
actividad
2-Cys-peroxiredoxina se midió como se describe [28]. En resumen, la velocidad inicial de la oxidación de NADPH se monitorizó espectrofotométricamente a 340 nm a 30 ° C en una mezcla de reacción (150 l) que contiene 50 mM Hepes-NaOH (pH 7,0), NADPH 0,25 mM, 46 nM TR, Trx 2,4 mM y 0,13 mm de H
2O
2. La reacción se inició mediante la adición de H
2O
2 y monitoreados durante 10 min.
Ensayo de actividad de catalasa
La actividad CAT se midió en los homogeneizados celulares mediante el control de la desaparición de 10 mmol /LH
2O
2 en 50 mmol /L de fosfato de potasio (pH = 7,0) por espectrofotometría a 240 nm. Las actividades se expresan en unidades MK /mg de proteína como se describe [29].
Tumor implantación de células
Femenino 4-5 semanas de edad sin timo-nu /nu ratones desnudos fueron adquiridos de Harlan Laboratories (Indianápolis , IN). Los animales fueron alojados en una habitación barrera libre de patógenos en el Centro de Cuidado de Animales de la Universidad de Iowa y manejados usando procedimientos asépticos. Todos los procedimientos fueron aprobados por el comité CICUAL de la Universidad de Iowa y se ajustaban a las directrices establecidas por el NIH. Los ratones se les permitió por lo menos 3 días para aclimatarse antes de comenzar la experimentación, y la comida y el agua se pusieron a disposición. Las células tumorales se inocularon en ratones desnudos por inyección subcutánea de 0,1 ml de alícuotas de solución salina que contiene 4 × 10
6 Cal de 27 células en el flanco derecho con agujas de calibre 26.
medidas de los tumores
en los
in vivo
experimentos ratones comenzó el tratamiento farmacológico 1 semana después de la inoculación del tumor con un volumen medio de los tumores de 0,025 cm
3. se evaluaron diariamente los ratones y las medidas del tumor tomadas tres veces por semana utilizando calibradores Vernier. Los volúmenes tumorales se calcularon usando la fórmula: volumen del tumor = (longitud x anchura
2) /2, donde la longitud era de la dimensión más larga, y la anchura era la dimensión perpendicular a la longitud
in vivo.
administración drogas
Los ratones se dividieron en 4 grupos (n = 6-10 ratones /grupo). grupo BSO: BSO se disolvió en solución salina y se administró 400 mg /kg i.p. cada día durante 2 semanas. grupo AUR: AUR solución madre se diluyó con solución salina y se administró por vía intraperitoneal 1 mg /kg cada día durante 2 semanas. BSO + AUR grupo: se administraron los ratones 400 mg /kg BSO más 1 mg /kg i.p. AUR cada dos días durante 2 semanas. Grupo control: los ratones se les administró una solución salina cada día i.p. Los ratones fueron sacrificados mediante asfixia CO
2 de gas o sobredosis letal de pentobarbital sódico (100 mg /kg) cuando el diámetro del tumor superó 1,5 cm en cualquier dimensión.
Análisis estadístico
El análisis estadístico fue hecho utilizando GraphPad Prism versión 5 para Windows (GraphPad Software, San Diego, CA). Las diferencias entre los 3 o más medios se determinaron mediante ANOVA de una vía con el post-test de Tukey. Los modelos de regresión de efectos mixtos lineales fueron utilizados para estimar y comparar el cambio específico de grupo en las curvas de crecimiento tumoral. Todo el análisis estadístico se llevó a cabo en la pág. & Lt; 0,05 nivel de significación
Resultados
BSO y AUR disminución de la actividad de síntesis de GSH y TR
BSO y AUR son inhibidores de la ampliamente conocidos la síntesis de GSH celular y la actividad TR respectivamente como se ilustra en el esquema simplificado en la figura 1A. Para confirmar estos efectos de la BSO y AUR en células HNSCC, crecimiento exponencial FaDu, Cal-27 y SCC-25 células fueron tratadas con BSO mM 1 y /o AUR 0,5 M durante 24 h y luego analizadas con respecto a los niveles totales de GSH y la actividad de TR. la producción de GSH se agota de manera significativa tanto en BSO y BSO + AUR trataron células en todas las líneas celulares 3, lo que sugiere que BSO fue de hecho capaz de inhibir la síntesis de GSH (Figura 1B). BSO también aumentó significativamente la actividad TR en FaDu y SCC-25 células y mostró una tendencia hacia un aumento de la actividad TR en Cal-27 células (Figura 1C). Además, la actividad de TR se inhibió en AUR y BSO + AUR células que confirman el mecanismo de acción de AUR (Figura 1C) tratada. AUR también aumentó la producción de GSH en las 3 líneas celulares (Figura 1B). Estos resultados sugieren que la BSO y AUR inhiben la producción de GSH y la actividad TR tratamiento, respectivamente, a las 24 h en las células HNSCC
in vitro
.
BSO y AUR disminución de la viabilidad celular y la supervivencia clonogénico
Para investigar los efectos citotóxicos de la BSO y AUR sobre las células HNSCC, la viabilidad celular y la supervivencia clonogénico se ensayaron después de BSO y tratamiento AUR en Fadu Cal-27 y SCC-25 células en crecimiento exponencial. BSO y AUR como agentes únicos no indujo ninguna reducción significativa en la viabilidad celular metabólica aunque se observó un aumento de la viabilidad con el tratamiento BSO (en Cal-27 y SCC-25 células) y con el tratamiento AUR (en las células FaDu, Figura 2A). En contraste, la combinación de BSO y AUR redujo significativamente la viabilidad celular en todas las líneas celulares 3 comparado con los otros grupos de tratamiento (Figura 2A). Del mismo modo, se observó la muerte de células clonogénicas significativo con la combinación de BSO y AUR en todas las líneas celulares 3 en comparación con cualquier agente solo lo que sugiere que BSO y AUR deben utilizarse al mismo tiempo con el fin de inducir la muerte celular en las células HNSCC (Figura 2B) . Cuando la viabilidad celular en respuesta a la BSO + AUR se puso a prueba durante un periodo de 24 h, se consideró que las reducciones significativas en la viabilidad celular no se observaron hasta 16 h (Cal-27 y SCC-25) y 24 h (FaDu) tras el tratamiento (figura 2C). Por el contrario, la reducción significativa de la supervivencia clonogénico en respuesta a la BSO + AUR comenzó a aparecer tan pronto como 1 hora después del tratamiento en las células SCC-25 y 4 h después del tratamiento en las células FaDu (Figura 2D). Estos resultados demuestran claramente que vigilar los cambios en la viabilidad celular como una función del tiempo no reflejan necesariamente la muerte celular inducida por fármacos tal como se mide por la capacidad de formación de colonias. Estamos, además, observamos que la citotoxicidad inducida por AUR BSO + medido por ensayo clonogénico, fue significativamente menor en las células confluentes HNSCC en comparación con creciente exponencialmente las células cancerosas (Figura 3A) lo que sugiere que BSO + AUR fue más eficaz en células de crecimiento exponencial. Además, las células FaDu fueron significativamente más sensibles que las células epiteliales humanas normales (HNEpCs) a BSO + AUR después de 24 h, lo que sugiere que BSO + AUR era tóxico para las células preferentemente HNSCC comparación con las células no transformadas normales "" (Figura 3B). En conjunto, los resultados, tanto en la viabilidad y experimentos sugieren que la clonigénicas BSO + AUR parece inducir más que aditivo en la destrucción de células Fadu Cal-27 y las células SCC-25
in vitro
.
FaDu, Cal-27 y SCC-25 células se trataron con 0,5 mM AUR y /o BSO 1 mM durante 24 h y se analizaron para la viabilidad celular (a) y la supervivencia de células clonogénicas (B). Las células se trataron como se mencionó anteriormente y la viabilidad (C) y la supervivencia de células clonogénicas (D) se midieron en un período de 8 h (supervivencia clonogénico, [D]) o 24 h (viabilidad, [C]). Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM) de N = 3 experimentos. *, P & lt; 0,05 versus control; ¥, p & lt; 0,05 frente a BSO o AUR
A:. Crecimiento exponencial y confluente Fadu Cal-27 y SCC-25 células fueron tratadas con 0,5 M RAO y /o BSO 1 mM durante 24 h y se analizó la supervivencia clonogénico. los datos de supervivencia de células clonogénicas se normalizaron a la creciente exponencialmente y control de las células confluentes (no mostrado). B: células FaDu y HNEpC fueron tratadas con BSO + AUR y se contó el número de células unidas viables después de 24 h. El número de células tratadas con BSO AUR + viables se normalizaron a sus respectivos controles (CON). Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM) de N = 3 experimentos. *, P & lt; 0,05 frente a EXP; ¥, p. & Lt; 0,05 frente CON
tiorredoxina reductasa (TR) desmontables células FaDu sensibilizados a BSO
Para confirmar que los cambios inducidos por el AUR en la citotoxicidad se debieron a la supresión de la actividad TR , la expresión de TR fue derribado con siRNA dirigidos a TR en las células FaDu y se trató con o sin BSO durante 24 h. TR caída dio lugar a una supresión significativa de la actividad TR (Tabla 1) y sensibiliza las células FaDu a BSO como se determina por ensayo clonogénico (Figura 4). Estos resultados proporcionan apoyo adicional a la hipótesis de que la inhibición del metabolismo de Trx sensibiliza a las células HNSCC de muerte celular en presencia de inhibidores del metabolismo del GSH.
expresión TR fue derribado en células FaDu utilizando siRNA dirigidos a TR y analizadas con respecto a supervivencia clonogénico con y sin tratamiento 1 mM BSO durante 24 h. Los datos de supervivencia clonogénico se normalizó para el control (CON). Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM) de N = 3 experimentos. *, P & lt; 0,05 versus control; ¥, p. & Lt; 0,05 frente a BSO o Sitr
BSO + AUR inducida por la muerte celular necrótica
La respuesta citotóxica de BSO + AUR se pudo detectar morfológicamente mediante microscopía de contraste de fase . células Cal-27 tratadas con BSO y /o AUR por sólo 6 h fueron rodeados y separados de las placas de cultivo de tejidos en comparación con BSO o células tratadas con AUR que estaban conectados y parecía intacta (Figura 5A). Las mismas observaciones se observaron en FaDu y SCC-25 células (datos no presentados). Para determinar si la apoptosis o necrosis estaba involucrado en la muerte celular inducida por AUR BSO +, analizamos la caspasa 3/7 actividad en respuesta a BSO y /o AUR durante 24 h en FaDu y Cal-27 células. Las células tratadas con estaurosporina (STS, 10 m, 6 h) y ionomicina (ION, 100 m, 6 h) se utilizaron como controles positivos para la apoptosis y necrosis, respectivamente. Se encontró que AUR aumentado significativamente la actividad de la caspasa 3/7 en comparación con las células control tratadas solo en Cal-27 células (Figura 5B). Sin embargo, BSO + AUR disminuyó significativamente la actividad de la caspasa 3/7 en FaDu y células Cal-27, que fue comparable a la ionomicina células tratadas (Figura 5B), lo que sugiere que la necrosis y la apoptosis no estuvo involucrado en el mecanismo de muerte celular. En apoyo de estos resultados, que, además, investigó el efecto de la BSO + AUR en Bax
- /- Bak
- /- doble knock out células hematopoyéticas (DKO) de ratón. La ruta apoptótica se suprime en las células DKO por la eliminación genética de los factores pro-apoptóticos, Bax y Bak representación estas células que dependen de la necrosis cuando se expone a insultos letales [30]. También usamos células DKO que se reconstituyeron con Bax (DKO-Bax) por transfección con un vector que contiene Bax (pCDNA3 /Bax) como se describe anteriormente [30]. Reconstitución de Bax en células DKO se ha demostrado para restaurar su sensibilidad a los estímulos de apoptosis [30], [31]. Hemos observado que la BSO solo no afectó a la viabilidad de las células, ya sea DKO-Bax (Figura 5C) DKO o. Sin embargo, las células DKO DKO-Bax pero no eran altamente sensibles al tratamiento AUR (Figura 5C) que soporta los informes anteriores que AUR induce una respuesta apoptótica [32]. Tanto las células DKO y DKO-Bax fueron altamente sensibles a la BSO + AUR lo que sugiere que la necrosis fue la vía de muerte celular que participa en la respuesta a la BSO + AUR (Figura 5C). Estos resultados sugieren que BSO + AUR a las dosis y tiempos de tratamiento utilizados en estos estudios indujo la muerte celular necrótica
A:. Contraste de fase imágenes de células Cal-27 fueron tomadas después de 6 h de tratamiento con 0,5 M y AUR /o 1 BSO mM. B: FaDu y Cal-27 células se trataron con 0,5 mM AUR y /o BSO 1 mM durante 24 h, después se analizó la actividad de la caspasa 3/7 usando un ensayo de luminiscencia. tratamiento de la célula con estaurosporina (STS) y ionomicina (ION) para 6 h se utilizaron como controles positivos para la apoptosis y necrosis, respectivamente. Todos los tratamientos se normalizaron a controlar. *, P & lt; 0,05 versus control; ¥, p & lt; 0,05 frente a BSO o AUR. C: Bax /Bak doble knockout (DKO) las células y las células DKO con reconstituida Bax (DKO-Bax) fueron tratadas con BSO mM 0,05 y 2 AUR mu M durante 24 h después se analizaron para la viabilidad celular. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM) de N = 3 experimentos. *, P & lt; 0,05 versus control; ¥, p & lt; 0,05 frente a BSO o AUR; £, p. & Lt; 0,05 frente a las células DKO
BSO + AUR indujo la oxidación de GSH y Trx
Debido a un aumento de GSSG oxidada (GSSG%) se cree para significar un cambio hacia una más altamente entorno intracelular oxidante indicativo de estrés oxidativo [12], se investigó los cambios en% GSSG en respuesta a BSO y AUR. BSO + AUR indujo un aumento significativo en% en comparación con GSSG BSO y AUR solo en células FaDu, mientras que tanto BSO y BSO + AUR tratados grupos indujeron un aumento significativo en% GSSG comparación con el control en Cal-27 células (Figura 6A). Análisis de tiorredoxina-1 (Trx-1) redox experimentos de Western blot mostraron que el tratamiento con BSO + AUR en las células FaDu resultó en un aumento de la oxidada Trx-1 (TRX1 [S
2] y TRX1 [S
2 ]
2) expresión como se ve por el aumento de la expresión de las 2 bandas superior en la Figura 6B en comparación con los otros grupos de tratamiento. Un efecto similar se observó en Cal-27 células en respuesta al tratamiento BSO + AUR, aunque la cantidad total de Trx (reducido + oxida) parecía ser menos que los otros grupos de tratamiento (Figura 6B). los informes anteriores han indicado que la reducción en la expresión total de Trx puede ser debido a la formación de grandes complejos de proteína disulfuro mixtos de tiorredoxina que no pueden entrar en el gel durante la electroforesis [23]. Se confirmó esta incubando lisados tratados con AUR + BSO con DTT para reducir los disulfuros mixtos de proteína antes del análisis por reducido y oxidado TRX1. Se encontró que la TDT tuvo éxito en la reducción de la TRX1 oxidado formado por BSO + RAO y la restauración de los niveles de disminución en TRX1 a los niveles de control próximo a nivel de FaDu y 27 Cal-células (Figura 6B), sugiriendo que se estaban formando disulfuros de proteínas mezcladas en respuesta a BSO + AUR. Finalmente, los cambios en la actividad de otras enzimas relacionadas GSH y Trx tales como la glutatión reductasa (GR), glutatión peroxidasa (GPx) y peroxiredoxin (Prx) en respuesta a BSO y AUR fueron examinados en FaDu y Cal-27 células. No hubo cambios significativos en GR (Figura 7A) o GPx (Figura 7B) en respuesta a la BSO + AUR en cualquiera de las líneas de células en comparación con el control. PRX actividad fue significativamente mayor en BSO tratados con Cal-27 células, pero se suprimió significativamente en RAO y FaDu tratado con AUR + BSO y Cal-27 células (Figura 7C). Estos resultados sugieren que BSO + AUR estrés oxidativo inducido a través de aumento de GSH y la oxidación en las células Trx HNSCC
A, B:. Células FaDu y Cal-27 fueron tratadas con 0,5 M AUR y /o BSO 1 mM durante 24 h, luego se analizó para el disulfuro de glutatión porcentaje (% GSSG, (a)) y el estado redox de tiorredoxina (B). Dithiotrietol (DTT, 2 mM) o 2 mM H
2O se añadió
2 para 15 min para controlar lisados como controles positivos para reducido y oxidado tiorredoxina respectivamente (B). *, P & lt; 0,05 frente al control (CON); ¥, p & lt; 0,05 frente a BSO o AUR
A-C:. FaDu y células Cal-27 fueron tratadas con 0,5 M AUR y /o BSO 1 mM durante 24 h, luego se analizaron para la glutatión reductasa (GR) actividad (A), glutatión peroxidasa (GPx) La actividad (B), y la actividad peroxiredoxin (C). Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM) de N = 3 experimentos. *, P. & Lt; 0,05 frente al control
citotoxicidad inducida por AUR BSO + es inhibida por antioxidantes
A fin de analizar el papel del estrés oxidativo en la muerte celular inducida por AUR + BSO, células FaDu y Cal-27 se trataron previamente con NAC 20 mM (un antioxidante tiol) durante 1 h antes y durante el tratamiento BSO + AUR, luego se analizó para la supervivencia clonogénico. NAC fue capaz de revertir completamente la citotoxicidad inducida por la BSO + AUR en FaDu y Cal-27 células que sugieren que la inhibición de la BSO + AUR induce estrés oxidativo a través de alteraciones en el metabolismo de tiol (Figura 8A). Para confirmar que H
2O
2 estuvo involucrado en la citotoxicidad inducida por AUR BSO + Fadu y Cal-27 células fueron pretratadas durante 1 h con 1000 U /ml pegilado catalasa (CAT) antes del tratamiento con la BSO + AUR. CAT invierte significativamente la citotoxicidad inducida por AUR BSO + en las células FaDu pero no Cal-27 células (Figura 8A). Análisis de la actividad CAT en BSO + AUR frente a las células tratadas con AUR BSO + CAT + reveló que el tratamiento con CAT no aumentó la actividad de CAT en las células Cal-27 en comparación con las células FaDu (Figura 8B), lo que sugiere que el gato puede no se ha introducido adecuadamente las celdas. Además, Cal-27 células poseían un nivel significativamente más alto de actividad CAT en comparación con las células FaDu (Figura 8B). En conjunto, los resultados en las figuras 6, 7 y 8 apoyan la hipótesis de que H
2O
2 inducida disrutions en el metabolismo del tiol que conduce a estrés oxidativo están implicados en la muerte celular inducida por la BSO + AUR en las células humanas HNSCC.
a: FaDu y Cal-27 células fueron tratadas con NAC mM 20 o 1000 u /ml pegilado catalasa (CAT) durante 1 hora antes de y durante 24 h de tratamiento con 0,5 M AUR y /o BSO 1 mM. Se midieron las células tratadas con fármaco para la viabilidad celular. Todos los tratamientos se normalizaron a controlar. Se analizaron BSO + AUR y CAT + FaDu tratado con AUR + BSO y Cal-27 células para la actividad CAT: B. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM) de N = 3 experimentos. *, P & lt; 0,05 versus control; ¥, p & lt; 0,05 frente a BSO + AUR; **, P. & Lt; 0,05 frente al tratamiento respectivo en las células FaDu
BSO + AUR suprimida Cal-27 el crecimiento del tumor
El
in vivo
actividad de BSO y AUR en Cal-27 de tumor en ratones lampiños atímicos fue examinado. Los resultados mostraron que los ratones tratados con 400 mg /kg BSO en combinación con 1 mg /kg i.p. AUR al día durante 10 días, mostró una supresión del crecimiento del tumor en comparación con el control y los tumores tratados con BSO (Figura 9A) sin ningún efecto adverso sobre el peso corporal (Figura 9B) que confirma los resultados observados
in vitro
. ratones atímicos (nu /nu) que llevan: A pesar de que los tumores tratados con AUR BSO + mostraron una tendencia hacia un crecimiento más lento en comparación con los tumores tratados con AUR, esta diferencia no alcanzó significación (Figura 9A)
A, B. Cal-27 xenoinjertos de tumores fueron tratados a partir de las un volumen medio de los tumores de 0,025 cm
3 con 450 mg /kg ip BSO y /o 1 mg /kg i.p. AUR al día durante 10 días. Los ratones de control recibieron 10% de etanol en solución salina i.p. al día durante 10 días. El volumen del tumor (A) y el peso corporal (B) se midió en el día 1, 3, 5, 8, 10 y 12 de tratamiento. Los puntos de datos representan los valores promedio para 10 ratones. B: Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM) de N = 3 experimentos. *, P. & Lt; 0,05 frente CON
BSO + AUR sensibiliza las células HNSCC a Erlotinib
Dado que la resistencia a los agentes quimioterapéuticos, tales como inhibidores de EGFR, es una limitación importante en el tratamiento del CECC [33], a fin de determinar si BSO + AUR sería sensibilizar a las células confluentes HNSCC al inhibidor de EGFR erlotinib. Se encontró que BSO y AUR cuando se utiliza solo no fueron capaces de sensibilizar a las células para Erlotinib (10 M, 24 h (Figura 10)). Sin embargo, BSO + AUR sensibilizado significativamente todas las líneas celulares ensayadas a Erlotinib (Figura 10) que sugieren que la BSO + AUR debe ser utilizado en combinación con inhibidores de EGFR para lograr máxima quimio-sensibilización.
confluentes FaDu, Cal-27, células SCC-25 y SQ20B fueron tratadas con BSO 1 mM y 0,5 o AUR mu M en combinación con 10 mM Erlotinib (ERL) durante 24 h. los datos de supervivencia de células clonogénicas se normalizaron para controlar las células (CON). Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM) de N = 3 experimentos. *, P & lt; 0,05 frente a CON; ¥, p & lt; 0,05 frente a CON, BSO y AUR; £, p & lt; 0,05 frente a ERL; §, p. & Lt; 0,05 frente a todos los otros grupos de tratamiento
Discusión
El aumento de GSH y el metabolismo Trx se conocen desde hace años que se correlaciona con una alta agresividad del tumor y la resistencia a la quimioterapia [4 ] - [7]. Como resultado de este conocimiento, la inhibición de GSH o Trx junto con la quimioterapia ha sido ampliamente explorada pero es altamente línea celular específica y ha dado resultados decepcionantes que puede ser debido a la superposición de funciones y redundantes antioxidantes de la GSH y sistemas de Trx [17 ] - [20]. De hecho, nuestros estudios previos han demostrado que la capacidad de BSO o AUR para sensibilizar a las células HNSCC a los inhibidores de Akt fue altamente línea celular específica [16].