Extracto
Antecedentes
La radioterapia es una de las principales estrategias terapéuticas en el tratamiento del cáncer. La proteína de unión TPP1 telómero es un componente importante del complejo shelterina en los telómeros de mamíferos. Nuestros informes anteriores mostraron que la expresión TPP1 fue elevado en las células radioresistant, pero los efectos exactos y los mecanismos de TPP1 en radiosensibilidad no está claro.
Principales conclusiones
En este estudio, se encontró que la expresión elevada TPP1 correlacionó significativamente con radioresistance y ya la longitud del telómero en líneas celulares de cáncer colorrectal humano. Por otra parte, la sobreexpresión TPP1 mostró alarga la longitud del telómero y una disminución significativa de la radiosensibilidad a los rayos X. TPP1 radioresistance mediada se correlacionó con una disminución de la tasa de apoptosis después de la exposición IR. Por otra parte, la sobreexpresión TPP1 mostró G2 prolongada detención /M mediada por la vía de señalización de ATM /ATR-Chk1 después de la exposición IR. Por otra parte, la sobreexpresión TPP1 acelera la cinética de reparación de daños en el ADN total y la disfunción telomérica inducida por la radiación ionizante.
Conclusiones
Hemos demostrado que las expresiones elevadas de TPP1 en células humanas de cáncer colorrectal podrían proteger los telómeros de ADN dañar y confieren radioresistance. Estos resultados sugieren que TPP1 puede ser un objetivo potencial en la radioterapia del cáncer colorrectal
Visto:. Yang L, Wang W, Hu L, Yang X, Zhong J, Li Z, et al. (2013) telómero-Binding Protein TPP1 modula la homeostasis del telómero y confiere radioresistance de células de cáncer colorrectal humano. PLoS ONE 8 (11): e81034. doi: 10.1371 /journal.pone.0081034
Editor: Stephanie Filleur, Universidad Tecnológica de Texas Health Sciences Center, Estados Unidos de América
Recibido: 2 Julio, 2013; Aceptado: 8 Octubre 2013; Publicado: 19 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.81071825), el Fondo de Doctorado del Ministerio de Educación de China (No.20120141130010) y los Fondos de investigación Fundamental para las Universidades de Centroamérica. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR), con más de 1,2 millones de nuevos casos y 608,700 muertes en 2008, es una de las principales causas de muerte por cáncer en muchos países [1]. La radioterapia es una de las principales estrategias terapéuticas en el tratamiento del cáncer colorrectal con control local eficaz, la protección de tejidos normales y menos efectos sistémicos [2,3]. Sin embargo, muchos pacientes todavía experimentan recurrencia o metástasis después de la radioterapia. La principal causa del fracaso de la radioterapia es radioresistance celular. Por lo tanto la identificación de nuevos factores que predicen radioresistance es un área de intensa investigación y podría ser de gran valor en el tratamiento de cánceres.
Los telómeros son complejos ADN-proteína especializados en los extremos de los cromosomas eucarióticos compuestos por un número variable de secuencias repetidas en tándem TTAGGG y proteínas asociadas [4]. Los telómeros desempeñan un papel crucial para garantizar la estabilidad y la integridad [5-8] genómico. Por otra parte, los estudios han aclarado que la homeostasis del telómero sirve como una diana potencial en el tratamiento del cáncer, especialmente en la radioterapia [9-12]. Nuestra investigación previa también indica que había una correlación negativa significativa de la longitud del telómero y la radiosensibilidad y longitud de los telómeros puede utilizarse como una herramienta prometedora para predecir la radiosensibilidad de carcinomas humanos [13].
telómeros homeostasis se ve afectada por múltiples elementos, y uno de los principales reguladores es shelterina. El complejo se compone de seis shelterina proteínas telómeros asociada: TRF1, TRF2, RAP1, TIN2, TPP1 y POT1 [8]. La interrupción en el shelterina daría lugar a una disfunción de los telómeros y, potencialmente, la inestabilidad cromosómica [14]. TPP1 (también conocido como TINT1 /PTOP /PIP1) es un miembro crítico de shelterin y se asocia con otras proteínas de unión a telómeros para formar el núcleo shelterin [8]. TPP1 heterodimeriza con POT1 y mejora su afinidad con los telómeros ssDNA [15,16]. El complejo POT1-TPP1 es capaz de reclutar y estimular la actividad de la telomerasa, con lo que regula la longitud del telómero a través TPP1-telomerasa interacción [17-19]. Investigaciones anteriores demostraron que TPP1 caída activa una respuesta al daño del ADN cajero automático que dependen caracterizada por la formación de focos inducida por la disfunción de los telómeros (TIF) en los telómeros [20]. Por otra parte, se observó que la expresión TPP1 fue elevado en las células radioresistant y TPP1 puede implicar en radioresistance cáncer [21]. Sin embargo, los efectos exactos y el mecanismo de TPP1 en radiosensibilidad no está claro.
Para aclarar aún más las funciones de TPP1, se investigó el papel de TPP1 sobreexpresión de radiosensibilidad y la homeostasis del telómero en células de cáncer colorrectal humano en este estudio.
Materiales y Métodos
Cultivo celular y tratamiento
líneas celulares de cáncer colorrectal humano (HCT116, SW480, LoVo, HT29 y DLD-1) fueron adquiridos de la célula Banco de la Academia de Ciencias de china, Shanghai, china. Todas las células utilizadas en este estudio se cultivaron en 1640 suplementado con suero bovino fetal 10%. HCT116 células fueron transfectadas con pcDNA6-bandera-hTPP1 (una especie de regalo del Dr. Joachim Lingner) [19] o pcDNA6 vector vacío (Invitrogen) utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Se seleccionaron las células que sobreexpresan TPP1 con 5 ug /ml de blasticidina (Sigma) durante 4 semanas. Las líneas celulares estables de transfección fueron nombrados como HCT116-TPP1 y HCT116-Mock, respectivamente.
Los rayos X de irradiación se realizó con un generador de rayos X (Primus-Alta Energía de Siemens), que emite a una tasa de dosis fija de 2 Gy /min, la energía de los rayos X utilizados para irradiar las células es 0 -10 Gy.
Ensayo clonogénico
Las células se sembraron en frascos de 6 pocillos de placas de cultivo. Después de 24 h, las células se irradiaron con dosis graduadas (0, 2, 4, 6, 8, 10 Gy) utilizando generador de rayos X (Primus-High Energy Siemens) a una tasa de dosis de 2 Gy /min. Las células fueron cultivadas en una incubadora que contenía 5% de CO2 a 37 ° C durante 14 días. Se llevaron a cabo los pasos y el cálculo de la fracción superviviente subsiguientes como se describe anteriormente [13] .Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces.
Flujo Análisis de citometría de Ciclo Celular
resumen, las células fueron expuestas a 6 Gy IR y después se incubó durante los tiempos indicados (0, 6, 12, 18, 24, 30, 36 y 42 h), a continuación del ciclo celular análisis se realizaron como se describe anteriormente [21]. histogramas de ADN fueron analizados utilizando el software Modifit. Los experimentos se realizaron por triplicado.
Flow Análisis de Citometría de Apoptosis
ensayo
La apoptosis se realizó utilizando un kit de detección de apoptosis AnnexinV-FITC (Beyotime, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se midió la fluorescencia usando un citómetro de flujo (Beckman Coulter, Brea, CA) y los datos se analizaron con la célula software Quest. Todas las muestras se analizaron por triplicado.
Los anticuerpos y Western blot
Western blot se realizó como se informó anteriormente [21]. Siguientes anticuerpos se utilizan en este estudio: TPP1 (Abcam), ATR, fosfo-Ser345-Chk1 /Chk1 y ATM (Cell Signaling Technology). Un anticuerpo β-actina (Santa Cruz) se utilizó para normalizar las diferencias de carga entre las muestras.
Ensayo de actividad de la telomerasa
La medición de la actividad de la telomerasa se llevó a cabo usando el TRAP PCR ELISA kit (Roche) según las instrucciones del fabricante. El método detallado se realizó como se describe anteriormente [22] .sample absorbancia se midió con un lector de microplacas (Bio-Rad) a la longitud de onda de 450/690 nm.
Medición de la longitud del telómero por Southern Blotting
determinación de los fragmentos de restricción terminal se realizó utilizando el kit de ensayo de longitud de los telómeros TeloTAGGG (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se determinó la longitud media de los telómeros (restricción terminal de media longitud de fragmentos, TRF) utilizando el software de análisis de imágenes (Bio-Rad).
inmunofluorescencia
Después de tratamiento indicado, las células se fijaron con 4% de formaldehído durante 15 min y se permeabilizaron con 0,2% Triton X-100 en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después se bloquearon con solución de bloqueo, las células se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C y luego se lavó y se incubó con el anticuerpo secundario. Los núcleos se tiñeron con DAPI (Sigma) durante 5 min a temperatura ambiente. Las señales de fluorescencia fueron tomadas usando un microscopio confocal (Zeiss LSM710 Carl).
telómeros chip de ensayo y análisis de transferencia puntual
Se llevaron a cabo los telómeros chip de ensayo y análisis de transferencia puntual como se informó anteriormente [19]. Después de la precipitación con el anticuerpo TRF2, el ADN se purificó a partir de la cromatina inmunoprecipitada y se transfirió a una membrana Hybond-N (Amersham), y las secuencias de telómero de repetición se detectaron con un kit de ensayo de la longitud de los telómeros TeloTAGGG (Roche Diagnostics). Una sonda no específica (Alu) fue utilizado como control. Las señales se midieron usando software de análisis de imágenes (Bio-Rad).
Análisis estadístico
Todos los datos se expresan como media ± SEM. Se utilizó la prueba t de Student para valorar la significación estadística. P & lt; 0,05 se consideraron significativos. GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, California) el software fue utilizado como una herramienta de análisis estadístico.
Resultados
Correlación entre la expresión de la proteína TPP1, la longitud de los telómeros y la intrínseca Radiosensibilidad
En primer lugar, examinado TPP1 de expresión de proteínas y telómero longitudes en cinco células de cáncer colorrectal (Figura 1A y B). Como se muestra en la Figura 1D, la expresión de proteínas TPP1 se correlacionó significativamente con la longitud de los telómeros (R = 0,9783, P & lt; 0,05). A continuación, la supervivencia celular se midió mediante un ensayo clonogénico y SF2 se utilizó como un índice de radiosensibilidad intrínseca (Figura 1C). TPP1 expresión se correlaciona negativamente con la radiosensibilidad intrínseca (R = 0,9792, P & lt; 0,05, Figura 1E). En resumen, las células radiorresistentes tienen telómeros más largos y mayor producción de TPP1 de que en las células radiosensibles. Estos resultados indicaron que había una correlación significativa entre la expresión TPP1, longitud de los telómeros y la radiosensibilidad celular intrínseca.
(A) la producción TPP1 se detectó por Western Blot ..
longitud (B) de los telómeros era examinado por análisis de transferencia Southern.
(C) la producción TPP1 relativa, radiosensibilidad (SF2) y la longitud de los telómeros (TRF) en líneas celulares de cáncer colorrectal humano.
(D) La correlación entre la producción y TPP1 radiosensibilidad (SF2) en colorrectal se examinaron las células cancerosas.
(e) Correlación entre la producción y la longitud TPP1 TRF en las células de cáncer colorrectal se examinó.
TPP1 sobreexpresión disminuye la sensibilidad de las células HCT116 a la radiación
Para examinar la influencia de TPP1 sobreexpresión de radiosensibilidad celular, HCT116-TPP1 y las células HCT116-Mock se establecieron (Figura 2A) y la supervivencia celular se midió mediante un ensayo clonogénico. células HCT116-TPP1 mostraron significativamente radioresistance comparación con las células HCT116-Mock después de la exposición IR (Figura 2B).
(A) Verificación de TPP1 sobreexpresión de Western Blot.
(B) Células HCT116-Mock y TPP1 fueron irradiados con rayos X y la supervivencia a continuación, las células se determinó mediante ensayo clonogénico.
células HCT116-Mock y TPP1 (C) se irradiaron con 6 Gy de rayos X y se recuperaron durante los tiempos indicados. ciclo celular se analizó mediante FACS.
(D) La población de células en G2 /M fases en el tiempo en HCT116- Mock y -TPP1 células.
TPP1 sobreexpresión en cáncer HCT116 células causa G2 prolongada /M detención después de la exposición IR
Como se muestra en la Figura 2C, TPP1 sobreexpresión no tuvo efecto significativo en las distribuciones del ciclo celular en ausencia de daño en el ADN. Después de exposición a la radiación, se observó que la detención en G2 /M llegó a un pico a las 18 h después de la exposición IR en tanto HCT116-Mock y -TPP1 células. Más importante aún, la cinética de la respuesta de las líneas celulares fue diferente. En las células HCT116-Mock, la G2 /M pico disminuye gradualmente desde 18 h después de la radiación ionizante y volvió a niveles normales en alrededor de 42 h. Sin embargo, la G2 /M pico en las células HCT116-TPP1 no disminuyó pero aún se mantiene en un nivel alto hasta 30-36 h después de IR. Estos resultados sugieren que la sobreexpresión TPP1 G2 en las células HCT116 prolongada /M detención después de la exposición IR.
G2 inducida por TPP1 /M Prolongación de detención está mediada por ATM /ATR-Chk1 Camino
Para identificar el los mecanismos moleculares de G2 prolongada /M detención después de la exposición IR en las células que sobreexpresan TPP1, que mide la producción de ATM, ATR y Chk1. Se encontró que las expresiones de ATM y ATR ambos fueron elevados en las células HCT116-TPP1 (Figura 3A). A continuación, se investigó las activaciones de Chk1, un importante sustrato de ATR y ATM. Se encontró que los niveles de fosforilación de Chk1 en Ser345 eran más altas hasta las 36 h después de la exposición IR en las células HCT116-TPP1. En contraste, los niveles en las células HCT116-Mock habían regresado a los niveles normales a aproximadamente 30h después de la exposición IR (Figura 3B). Estos resultados indican que G2 prolongada /M detención por TPP1 sobreexpresión es probablemente debido a ATM /ATR-Chk1 vía de señalización.
(A) análisis de transferencia Western reveló que TPP1 sobreexpresión aumentó la expresión de ATM y ATR.
(B) las células HCT116-Mock y TPP1 se irradiaron con 6 Gy de rayos X y se incubaron durante los tiempos indicados. Las transferencias Western fueron preformados para detectar la expresión de Chk1 y p-Ser
345-Chk1.
TPP1 sobreexpresión inhibe la apoptosis inducida por la radiación ionizante
Se evaluaron los efectos de TPP1 sobre la apoptosis inducida por radiación utilizando el análisis de citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 4, se encontró que no había diferencia significativa entre las células HCT116-TPP1 (5,72 ± 0,15% a 5,55 ± 0,12%, p & gt; 0,05) HCT116-Mock y, pero TPP1 sobreexpresión podría atenuar la radiación (5Gy) indujo los niveles de apoptosis, desde 26,89% ± 0,75 en las células control a 17,47 ± 0,45% en las células HCT116-TPP1 (p & lt; 0,05). Estos datos indicaron que el aumento de radioresistance por TPP1 sobreexpresión puede ser debido a una disminución en la apoptosis inducida por radiación.
células HCT116-Mock y-TPP1 se irradiaron con 5 Gy de rayos X y se incubaron durante 24 h. El porcentaje de células apoptóticas se midió por citometría de flujo.
(A) Los resultados representativos de grupos diffrerent se muestran.
(B) Los datos mostrados son medias ± SEM de tres experimentos independientes.
*, P & lt; 0.05.
TPP1 sobreexpresión Aumenta la longitud del telómero en células HCT116
Para investigar más a fondo el papel de TPP1 en el control de longitud de los telómeros, las células HCT116-TPP1 y -Mock se cultivaron durante 20 PD y longitud de los telómeros se midió mediante transferencia Southern. Nos muestra y que la longitud media de los telómeros de las células HCT116-TPP1 se alarga gradualmente que la de las células control (Figura 5A). Estos resultados sugieren que la sobreexpresión TPP1 podría aumentar la longitud del telómero en células HCT116.
(A) Mean TRF longitudes en diferentes PD fueron detectados por transferencia de Southern. PD, duplicación de la población. La posición de MW (kb) se indica a la izquierda.
(B) TRAP ensayo de PCR ELISA se utilizó en el análisis de la actividad telomerasa en diferentes PDs.
(C) Análisis de transferencia Western puesto de manifiesto que la sobreexpresión TPP1 no tuvo influencia significativa en la expresión de hTERT.
(D) los ensayos de los telómeros-chip se realizaron utilizando un anticuerpo TRF2 para examinar el ADN telomérico unido a por TRF2. De entrada, el sobrenadante antes de la inmunoprecipitación; ppt, complejo inmunoprecipitado proteína-ADN. Se utilizaron específica (telomérica) y sondas inespecíficos (ALU).
ADN telomérico en chip (%) = señales de ADN telomérico de señales de ADN ppt /Teloméricas de la entrada * 100%.
TPP1 sobreexpresión no afecta la actividad de la telomerasa
Para investigar si los telómeros en las células alargadas HCT116-TPP1 fueron el resultado de una mayor actividad de la telomerasa, los niveles de actividad de la telomerasa y la proteína hTERT en células HCT116-TPP1 se compararon con HCT116-Mock Células. No hubo un aumento detectable en los niveles de proteína de hTERT o en la actividad de la telomerasa en las células HCT116-TPP1 comparación con las células simuladas o células parentales (Figura 5B y C). Este resultado indica que los telómeros alargamiento por TPP1 no se debe a un aumento general de la actividad de telomerasa.
TPP1 sobreexpresión acelerado la cinética de reparación de daño al ADN inducido por IR
Se utilizó el ensayo TIF para establecer si la cinética TPP1 sobreexpresión de impacto de reparación de daños en el ADN en los telómeros. ensayo de telómero-chip puesto de manifiesto que la sobreexpresión TPP1 no tuvo ningún impacto sobre la asociación entre TRF2 y telómeros (Figura 5D), por lo TIF fueron controlados por la co-localización de TRF2 y γ-H2AX en este estudio (Figura 6A). Hemos observado frecuencias significativamente más bajos de TIF espontáneas en las células HCT116-TPP1 en comparación con las células de control (p & lt; 0,05) las células (Figura 6B) .A continuación, HCT116-TPP1 y -Mock fueron expuestas a 1 Gy IR y se tiñeron para identificar el TIF focos a las 0,5, 6 y 12 h después de la exposición IR. Nuestra investigación implicaba que las células de sobreexpresión TPP1 fueron capaces de reparar TIF más eficientemente que las células de control. Por ejemplo, las frecuencias de TIF inducido IR fueron similares en HCT116-TPP1 y células HCT116-Mock 0,5 h después de IR, lo que indica que TPP1 no redujo el número de TIF inducido por IR. A continuación, las células de sobreexpresión TPP1 tenía aproximadamente 0,53 TIF /célula 12 h después de IR, mientras que las células simuladas tenían 1,04 TIF /célula 12 h después de IR (Figura 6C). Así, las células HCT116-TPP1 mostraron una mayor capacidad para reparar los daños en los telómeros. El ensayo TIF identificado γ-H2AX focos en los telómeros, así como focos total de γ-H2AX en el núcleo. A continuación, su cuantificación total de la formación de focos de γ-H2AX, un marcador de DSB, para investigar más a fondo el mecanismo subyacente para radioresistance. Similar con los resultados del ensayo de TIF, la tasa de reparación de ADN total ruptura de la doble cadena se vio acelerado por la sobreexpresión TPP1. Estos datos indican que la sobreexpresión TPP1 podría acelerar la tasa de reparación de ADN tras la exposición a la radiación
.
HCT116-Mock y -TPP1 fueron expuestas a 1 Gy IR y se incubaron a puntos de tiempo indicados .. Los resultados se basan en tres experimentos independientes con un promedio de 100 núcleos de las células analizadas por experimento por punto. Las barras representan la media ± SEM de 3 experimentos independientes.
(A) Imágenes representativas de TIF se muestran.
(B) Las frecuencias de focos positivos γ-H2AX espontánea y TIF en HCT116-Mock y -TPP1 células.
(C) la cinética de reparación de TIF inducido por IR en HCT116-Mock y -TPP1 células colorrectales. Se cuantificaron TIF promedio por célula en diferentes puntos de tiempo después de la exposición IR.
(D) la cinética de reparación de daño en el ADN inducido por IR en HCT116-Mock y -TPP1 células colorrectales. Averageγ-H2AX focos positivos por célula en diferentes puntos de tiempo después de la exposición IR se cuantificaron.
Discusión
Hemos demostrado por primera vez, a nuestro conocimiento, que TPP1 sobreexpresión se asocia con radioresistance en células de cáncer colorrectal en este trabajo.
TPP1 juega un papel crucial en la regulación de la longitud de los telómeros y la respuesta al daño del ADN. En este estudio, hemos demostrado que la expresión TPP1 estaba estrechamente correlacionada con la longitud de los telómeros y la radiosensibilidad en células de cáncer colorrectal. Además, se encontró que la sobreexpresión ectópica de TPP1 llevó a radioresistance y el alargamiento de los telómeros en las células HCT116. Anteriores investigaciones comprobaron que había una correlación negativa significativa entre la longitud de los telómeros y la radiosensibilidad [10,11,13]. Nuestro estudio indica que TPP1 involucrado en radioresistance a través de la regulación de la longitud de los telómeros. Los telómeros desempeñan un papel clave en el mantenimiento de la integridad cromosómica y la estabilidad, y la longitud del telómero acortado se asocia con un mayor riesgo de cáncer [23]. los niveles de proteína POT1 están asociados con la longitud del telómero en el cáncer gástrico [24,25]. TPP1 heterodimeriza con POT1 pero no hay resultados acerca de la correlación entre los niveles de TPP1 y longitud de los telómeros en las muestras de cáncer. Creemos que la correlación entre los niveles de TPP1 y longitud de los telómeros en muestras de cáncer colorrectal es de gran importancia. De hecho, en nuestro estudio, hemos tratado de hacer este trabajo utilizando los bloques de parafina, pero encontramos que los tejidos de cáncer frescas son más adecuadas para el experimento de transferencia de Southern. En nuestro siguiente estudio, vamos a recoger más muestras de tejido de cáncer fresca y verificar la relación entre la longitud de los telómeros y TPP1 en el cáncer colorrectal utilizando tejidos de cáncer frescas.
Se encontró que la sobreexpresión TPP1 prolongada G2 inducido por la radiación /M detención después de exposición IR. Las células detenidas en la fase G2 /M permiten más tiempo para reparar el daño consiguiente otorgar radioresistance. La activación de puntos de control regula la detención del ciclo celular en respuesta al daño del ADN. La ataxia telangiectasia (AT) mutada (ATM) y ATM y ATR) (proteínas quinasas relacionadas rad3-son importantes puesto de control aguas arriba quinasas de respuesta al daño del ADN [26]. Hemos puesto de manifiesto que la sobreexpresión TPP1 elevó las manifestaciones tanto de ATM y la proteína ATR. estudio anterior mostró que el aumento de los niveles de proteína ATM correlacionados con radioresistance intrínseca en los tumores GBM [27]. Kim y sus colegas encontraron que la sobreexpresión ATR condujo a la detención prolongada G2 /M y radioresistance en las células HCT116 [28]. Muchos estudios también demostraron que la inhibición de la actividad de ATM o ATR podría resultar en un aumento de la radiosensibilidad [29,30]. Chk1 es un importante sustrato de ATM y ATR. Por otra parte, Chk1 es una diana eficaz para radiosensibilización en células humanas de cáncer [31,32]. La fosforilación de Chk1 en S345 es considerado como un indicador de la activación de Chk1. En este trabajo, se encontró que la fosforilación de Chk1 fue elevado y sostenido hasta los puntos más tarde después de la exposición IR en las células que sobreexpresan TPP1 en comparación con las células simuladas. Nuestro estudio puede indicar que la detención G2 prolongada por TPP1 es probablemente debido a niveles más altos de la vía de señalización ATM /ATR-Chk1.
Muchos estudios han demostrado que la homeostasis del telómero sirve como una diana potencial en el tratamiento del cáncer, especialmente en la radioterapia . homeostasis del telómero puede ser mantenida por la telomerasa, así como sus proteínas asociadas (denominado como shelterin). longitud de los telómeros, la actividad de la telomerasa y la disfunción telomérica son los principales marcadores de la homeostasis del telómero. En primer lugar, el análisis de la longitud del telómero mostró significativo alargamiento de los telómeros en las células HCT116-TPP1 comparación con las células de control, lo que indica que TPP1 puede actuar como un regulador positivo de la longitud de los telómeros. Sin embargo, se observó que la expresión de TPP1 no tuvo efecto sobre la longitud del telómero en células de fibrosarcoma HTC75 humanos [16]. La diferencia entre estos resultados podría ser debido a la distinta elegido en líneas celulares. Curiosamente, no hubo un aumento detectable en la actividad de la telomerasa o los niveles de proteína hTERT en células HCT116-TPP1 comparación con las células de control. Este resultado indica que los telómeros alargamiento por TPP1 no se debe a un cambio general en la actividad de telomerasa, pero puede ser debido a la translocación nuclear hTERT o localizada la activación de la telomerasa en el telómero.
co-localización de los telómeros y activado marcadores de DDR (como 53BP1 andγ-H2AX), llamados focos inducida por la disfunción de los telómeros (TIF), es una marca típica de la disfunción de los telómeros. TIF implican DDR de los telómeros no niveladas [33] Los estudios demostraron que .Recent TPP1 consiste en respuesta daño en el DNA y la supresión de la expresión TPP1 en fibroblastos de embrión de ratón (MEFs) o células de cáncer humano podría iniciar la disfunción telomérica [19,20]. En este estudio, se encontró que la sobreexpresión inhibe TPP1 los TIF espontáneas en las células HCT116 de colon. Así TPP1 puede proteger la estructura de los telómeros y mantener la función de los telómeros normal.
Se encontró que la sobreexpresión TPP1 acelera la cinética de reparación de ruptura total de ADN de doble cadena inducida por la exposición IR. Más importante aún, el ensayo TIF reveló que la tasa de reparación del daño en el ADN en los telómeros después de la radiación también se vio acelerado por la sobreexpresión TPP1. Telomere homeostasis había sido identificado para servir como un objetivo potencial en radioterapia. Los estudios han puesto de manifiesto que la inhibición de la telomerasa podría dar lugar a una disfunción de los telómeros y por lo tanto una mayor radiosensibilidad [22,34]. También se confirmó que la interrupción de shelterin podría resultar en disfunción de los telómeros [14,20]. David Soler y sus colegas mostraron que los telómeros disfuncionales en las células epiteliales humanas eran propensos a interferir con la reparación eficiente de las DSB inducidas por la radiación y luego llevaron a una mayor radiosensibilidad [35]. Nuestro estudio demostró que TPP1 puede participar en la homeostasis del telómero y podría proteger de la radiación de los telómeros en las células de cáncer colorrectal humano.
En conclusión, este estudio revela que los niveles elevados de TPP1 proteger los telómeros de daño en el ADN y confieren radioresistance en el cáncer colorrectal humano Células. Además, nos proporcionan pruebas de la correlación entre TPP1expression, longitud de los telómeros y la radiosensibilidad intrínseca. Además, este estudio ha avanzado la comprensión de la relación entre la homeostasis del telómero y radiosensibilización. Estos resultados sugirieron que los niveles de TPP1 pueden ser un indicador útil de la capacidad de respuesta a la terapia de radiación. En resumen, nuestro estudio por primera vez indica que TPP1 puede ser un objetivo potencial en la radioterapia del cáncer colorrectal. Por otra parte, la inhibición de la inhibición TPP1 TPP1 puede proporcionar un adyuvante funcional en la terapia de radiación, una posibilidad que estamos investigando actualmente.
Reconocimientos
Agradecemos al Dr. Joachim Lingner ((ISREC, Epalinges, Suiza)) por su amable regalo del plásmido pcDNA6-bandera-hTPP1.