Extracto
Antecedentes
transcetolasa tipo 1 (TKTL1) induce la degradación de la glucosa a través de vías anaeróbicas, incluso en presencia de oxígeno, favoreciendo la maligna aeróbico fenotipo característico glucolítica de las células tumorales. Como TKTL1 parece ser un biomarcador válido para el pronóstico del cáncer, el objetivo del presente estudio fue correlacionar su expresión con el estadio del tumor, la probabilidad de recurrencia del tumor y la supervivencia, en una serie de pacientes con cáncer colorrectal.
Methodolody /Principales conclusiones
tejidos tumorales de 63 pacientes diagnosticados con cáncer colorrectal en diferentes etapas de la progresión se analizaron para TKTL1 por inmunohistoquímica. La tinción se cuantificó por análisis de imagen de cálculo, y se evaluaron las correlaciones entre la expresión de la enzima, el crecimiento local, implicación de los ganglios linfáticos y metástasis. Los valores más altos de expresión de TKTL1 se detectaron en el grupo de los tumores en estadio III, que mostró diferencias significativas respecto a los otros grupos (prueba de Kruskal-Wallis,
P = 0.000008
). Los análisis más profundos de la T, N y M clasificaciones revelaron una débil correlación entre el crecimiento local del tumor y la expresión de la enzima (prueba de Mann-Whitney,
P = 0,029
), una asociación significativa de la expresión de la enzima con afectación ganglionar ( prueba de Mann-Whitney,
P = 0,0014
) y una disminución significativa en la expresión de TKTL1 asociado con la metástasis (prueba de Mann-Whitney,
P = 0,0004
).
Conclusiones /importancia
a nuestro entender, pocos estudios han explorado la asociación entre las variaciones en la expresión de TKTL1 en la formación de tumores y la metástasis primaria. Aquí mostramos regulación a la baja de la expresión de la enzima cuando aparece la metástasis, y una correlación entre la expresión de la enzima y la participación regional de ganglios linfáticos en el cáncer de colon. Este hallazgo podría mejorar nuestra comprensión de la metástasis y conducir a nuevos y más eficaces terapias contra el cáncer
Visto:. Díaz-Moralli S, M Tarrado-Castellarnau, Alenda C, Castells A, M Cascante (2011) Transketolase- Al igual que 1 Expresión se modula durante la progresión del cáncer colorrectal y la formación de metástasis. PLoS ONE 6 (9): e25323. doi: 10.1371 /journal.pone.0025323
Editor: Michael Lisanti, Thomas Jefferson University, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Agosto, 2010; Aceptado: 1 de septiembre de 2011; Publicado: 27 de septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Díaz-Moralli et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyada por el Gobierno autónomo de Cataluña (Generalitat) a través de la "Agència de Gestió ad'juts Universitaris i de Recerca" (2009 SGR 849 y 2009 SGR 1308), la Innovación-español Gobierno y regional Europea Fondos de Desarrollo Ministerio de Ciencia e (FEDER) "Una Manera de Hacer Europa" (SAF2010-19273 y SAF2011-25726), "Instituto de Salud Carlos III" a través de ISCIII-RTICC (RD06_0020_0046) y CIBEREHD, y "Asociación Española Contra el Cáncer" ( "Fundación Científica y Junta de Barcelona "). MC reconoce el apoyo recibido a través del premio "ICREA Academia" por su excelencia en investigación, financiada por la Fundación ICREA-Generalidad de Cataluña. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
desarrollo del tumor es causada por una acumulación secuencial de los cambios genéticos y epigenéticos que conducen células a través de un proceso de múltiples pasos que hace que las células sanas maligna [1] - [4]. A lo largo de este proceso, las alteraciones que favorecen la formación de tumores primarios generalmente difieren de las adaptaciones necesarias para la carcinogénesis avanzado [5] - [7]. inicio carcinogénesis es debido a la desregulación de las interacciones inhibidoras del crecimiento de célula-célula y célula-matriz y la acumulación de otras alteraciones genéticas que conduce a la activación de proto-oncogenes y la inhibición de genes supresores de tumores [7], [8]. Después de estos primeros eventos, la transformación maligna progresa, gobernado por un proceso de selección darwiniana durante el cual, en lugar de genotipos, se seleccionan los fenotipos. Esto da a las células tumorales una ventaja sobre las células no transformadas. Esta selección de fenotipos, independiente de los genotipos asociados, es la base de la elevada heterogeneidad genética de las células cancerosas, ya que diferentes (PAI) mecanismos genéticos pueden converger en fenotipos similares [7], [9]. Una de las principales características fenotípicas de las células del cáncer es la glucólisis aeróbica asociada con la producción elevada, pero ineficiente, ATP, así como la alta producción de NADPH y ácidos (H
+), tales como lactato [10]. Este fenómeno, conocido como el "efecto Warburg", fue descrito por Otto Warburg en 1924 [11]. Constituye la base para la tomografía por emisión de positrones (PET), una técnica que se utiliza ampliamente para detectar alteraciones en el consumo de glucosa en pacientes con cáncer. La alta tasa glucolítica no se justifica por requerimientos energéticos, ya que más del 80% de la síntesis de ATP en las células tumorales se produce a través de la fosforilación oxidativa, y sólo alrededor del 17% se produce a través de la ruta de Embden-Meyerhof (EMP). Estas proporciones son similares a los encontrados en células no tumorales [12]. Por otra parte, la formación de NADPH es importante para el metabolismo de las células del tumor, ya que los protege contra el estrés oxidativo y proporciona combustible para el aumento de la tasa de síntesis de ácidos grasos característica de las células cancerosas. Por último, la producción de lactato y la acidificación microambiente dan las células tumorales una ventaja sobre las células sanas, mediante la mejora de su capacidad de invasión y metástasis [7], [13] - [16]. Sorprendentemente, la acidificación del medio ambiente es independiente del EMP, ya que en las células de la glucólisis con problemas de este fenómeno es todavía observable [17], [18].
Además de la glucólisis aeróbica, la vía pentosa fosfato (PPP) es importante para el metabolismo del tumor, ya que más del 85% de la ribosa necesario para la síntesis de ácido nucleico en las células tumorales se genera, directa o indirectamente, de la rama oxidativa de la PPP [19]. Por lo tanto, el PPP está en la base de la regulación del metabolismo del tumor. G6PDH y TKT, que controlan la vía, son suficientes para explicar las características metabólicas básicas adquiridas por las células tumorales durante su transformación. A través de la PPP, las células no sólo sintetizan los precursores de ácidos nucleicos necesarias para mantener la característica de la tasa de proliferación acelerada en el cáncer. G6PDH regula el flujo de la rama oxidativa a través del cual se sintetiza y NADPH CO
2 se libera, lo que lleva a la matriz acidificación por la anhidrasa carbónica. La enzima TKT dependiente de tiamina muestra el coeficiente más alto control sobre la rama no oxidativa de la vía, dejando al descubierto su papel clave en la regulación de la APP [20], [21]. TKT ha postulado para vincular el PPP y el EMP en las células cancerosas, lo que permite independiente en oxígeno degradación de la glucosa [22]. Por otro lado, el papel de TKT en el metabolismo de la célula tumoral ha sido subrayada por informes de una disminución significativa en la proliferación de células del tumor tras el tratamiento con inhibidores específicos TKT, tanto
in vitro
y
in vivo
[21] - [30]. Por otra parte, cuando TKT se activa mediante la adición de su cofactor, la tiamina, el crecimiento del tumor es estimulado [31].
Una TKT y dos genes de transcetolasa-como (TKTL1 y TKTL2) se han descrito en el genoma humano [32 ]. Este hallazgo condujo a examinar la expresión de las tres enzimas en las células cancerosas y concluir que TKTL1 era el único upregulated específicamente en tumores [33]. Estudios posteriores revelaron que TKTL1 es responsable de alrededor del 60% o 70% de la actividad de transcetolasa en hepatoma y células de cáncer de colon humano [33] - [35] que muestra el importante papel desempeñado por esta isoenzima en estos tumores. Se ha planteado la hipótesis de que podría generar TKTL1 acetylCoA para la síntesis de ácidos grasos, que uniría la degradación de la glucosa anaeróbica y la lipogénesis [32]. Por otra parte, la sobreexpresión de la enzima se ha informado en varias células y tejidos tumorales, por ejemplo, en el colon y el cáncer urotelial [33], [36], cáncer gástrico [37], diversos cánceres ginecológicos (de ovario, células de la granulosa del ovario y de cuello uterino) [38] - [40], cáncer de mama [41], [42 ], los carcinomas papilares de tiroides [43] y el cáncer de pulmón de células no pequeñas [44]. También se ha demostrado que la inhibición específica de la expresión de TKTL1 por shRNA desencadena la apoptosis y suprime el crecimiento del tumor [35]. Esta correlación entre la sobreexpresión de TKTL1 y el crecimiento tumoral, la supervivencia pobre y la recurrencia del tumor, además de con la regulación al alza de la transcripción de la expresión de la enzima provocado por el promotor desmetilación [45] condujo Smith y compañeros de trabajo para sugerir la enzima como un proto-oncogén potencial [46 ]. Además, también se ha propuesto que TKTL1 induce el fenotipo maligno aeróbico glicolítica mediante la mejora de la producción de la fructosa-6-fosfato y gliceraldehído-3-fosfato, que resulta en flujos elevados de piruvato y lactato [16], [46]. Sin embargo, hay una necesidad de un estudio más detallado de la correlación de TKTL1 con la progresión del tumor en el cáncer colorrectal, para dilucidar su papel en la afección de los ganglios linfáticos y metástasis. Por otra parte, hasta la fecha imagen cuantificación de la expresión de la enzima en los tejidos ha sido realizada por métodos semicuantitativos basada en la observación y la evaluación subjetiva experto [38], [47] que demuestra la necesidad de una mejora en el sistema de evaluación que permiten la obtención de resultados objetivos.
a continuación se presenta un nuevo método de cuantificación de análisis de imágenes para la evaluación de inmunotinciones que nos permiten examinar cómo la expresión de TKTL1 varía según la etapa de progresión en una serie de carcinomas colorrectales. Las muestras se clasifican en cuatro grupos o etapas de la progresión (I a IV) de acuerdo con el Comité Americano Conjunto sobre el Cáncer (AJCC) Manual de puesta en escena (sexta edición), que tiene en cuenta la extensión transmural, la afectación ganglionar y presencia de metástasis a distancia. Las posibles correlaciones entre la expresión de TKTL1 y la progresión tumoral se exploran, para determinar su papel en el desarrollo de tumores.
Resultados
Los pacientes
La expresión de TKTL1 se analizó mediante técnicas de inmunohistoquímica en 63 pacientes con cáncer colorrectal primario (CRC). Las características demográficas, clínicas y relacionadas con el tumor se enumeran en la Tabla S1 y S2 tabla. Después de una mediana de seguimiento de 49 meses, 26 pacientes habían muerto.
Detección inmunohistoquímica de la expresión de TKTL1
Los tumores primarios incubados con anticuerpo anti-TKTL1 mostraron etiquetado significativa, mientras que las muestras de control no mostraron cualquier etiquetado no específico (Figura 1 y Figura 2). pruebas de Levene y Cochrand no establecieron que nuestros datos se distribuyen normalmente (resultados no mostrados) por lo que realizaron pruebas no paramétricas para evaluar la significación de las diferencias. Mediante la aplicación de las pruebas de Mann-Whitney o Kruskal-Wallis, se confirmó que la expresión de TKTL1 no estaba género o dependientes de la edad (los resultados no se muestra). inmunohistoquímica datos clínico-patológico y se resumen en la Tabla S1.
Estas microfotografías de color revelan tinción inmunohistoquímica citoplasmática (depósitos marrones) de transcetolasa tipo 1 (TKTL1) en tumores colorrectales (aumento original × 200). En la columna de la derecha (E-H) hay tejidos teñidos en diferentes etapas de la progresión y en la columna izquierda (A-D) áreas homólogas en los controles negativos. La tinción para TKTL1 es observable en todas las muestras positivas, lo que indica su expresión en los tejidos tumorales; la intensidad más alta se detectó en las muestras de la etapa III.
Estas microfotografías monocromáticas se analizaron con el software ImageJ inmunotinción para cuantificar y evaluar la expresión de TKTL1 (aumento original × 200). En la columna de la derecha (E-H) existen tejidos teñidos en diferentes etapas de la progresión y en la columna izquierda (A-D) áreas homólogas en los controles negativos.
TKTL1 variaciones en función del estadio tumoral
La expresión de TKTL1 varió: de 1,8 a la 26.4 au (Media, 13,3 ± 7,9) en los tumores en estadio I, 4,0-37,3 a.u. (Media, 20,8 ± 9,9) en la etapa II, 17,3-50,0 a.u. (Media, 32,9 ± 11,5) en el estadio III y 3,7-41,3 a.u. (Media, 13,7 ± 8,7) en la etapa IV (Figura 3A). Estos datos demuestran que la expresión de TKTL1 en tumores en estadio III fue mayor que en cualquier otra etapa (prueba de Kruskal-Wallis,
P = 0,00003
, Figura 3B). Sin embargo, una muestra (id.#7118) mostró un valor de anormalmente alta (41,3) en comparación con el resto de las muestras de este grupo. Q-test de Dixon identifica este valor como un valor atípico con un nivel de confianza del 99,9% y, en consecuencia, se excluyeron del análisis. Después de la exclusión de esta muestra, la expresión de TKTL1 en tumores en estadio IV rangos de 3,7 a 20,8 a.u. (Media, 12,0 ± 5,1) y la expresión de TKTL1 en tumores en estadio III se vuelven aún más diferente (prueba de Kruskal-Wallis,
P = 0.000008
).
Estos gráficos muestran la expresión de transketolase- tipo 1 (TKTL1) en los tejidos analizados CRC, dividida por grupos según su estadio de evolución. (A) Cada punto corresponde a una muestra. En el grupo de la etapa IV de la cruz representa un valor atípico. Promedios están marcados por una línea horizontal negro en cada grupo. (B) Este diagrama de caja y bigotes muestra las diferencias entre los grupos. El valor atípico del grupo IV etapa está representada por un cuadrado negro. III fase de grupos es significativamente diferente del resto de los grupos (prueba de Kruskall-Wallis,
P = 0.000008
).
expresión de TKTL1 en tumores en estadio III fue significativamente mayor que en cualquier otro etapa progresión. Por otra parte, cuando se consideran por separado, casi todas las etapas individual mostró valores significativamente diferentes para la expresión de TKTL1 tanto de la anterior y la siguiente etapa: la etapa I mostró una tendencia a ser más baja que la etapa II (prueba de Mann-Whitney,
P
= 0,06). expresión de la enzima en los tumores en estadio II fue significativamente menor que en tumores en estadio III (prueba de Mann-Whitney,
P
= 0,02) y la fase III los valores fueron significativamente superiores a los de la etapa IV (Mann-Whitney U test,
P = 0,000003
).
Correlación entre la presencia de la expresión y la metástasis tumoral a distancia TKTL1
Una fuerte disminución en la expresión de TKTL1 tumor primario se observó en los pacientes que se presentaron con metástasis a distancia. De hecho, las muestras de los pacientes sin metástasis (M0) exhibieron valores de expresión entre 1,8 y 50,0 a.u. (Media 23,5 ± 12,4), mientras que los valores de las muestras de los pacientes que desarrollaron metástasis a distancia (M1) varió desde 3,7 hasta 20,8 a.u. (Media de 12,0 ± 5,1) (Mann-Whitney U test,
P-valor = 0,0004
) (Figura 4A). Teniendo en cuenta las diferencias entre M0 (no metastásico) y M1 (metastásico) tumores, se realizaron las siguientes comparaciones sólo para muestras del grupo M0.
Estos gráficos de barras muestran la correlación entre transcetolasa tipo 1 ( TKTL1) valores de clasificación de expresión y tumorales. (A) expresión de TKTL1 tumor en los pacientes que no presentan metástasis distantes (M0) es significativamente mayor que la expresión en pacientes que habían desarrollado metástasis (M1) (Mann-Whitney U,
P
= 0,0004) . (B) En los pacientes que no habían desarrollado metástasis, expresión de TKTL1 tiende a ser menor en los tumores en fase inicial con respecto a la invasión transmural (T1-2) que en los tumores más avanzados (T3-4) (
P
= 0,029, Mann-Whitney U test). (C) invasión ganglionar se correlaciona con un aumento en la expresión de TKTL1 en el tumor primario (test de la U de Mann-Whitney,
P = 0,0014
).
TKTL1 participación en la progresión tumoral
con respecto a la progresión transmural, tumores en estadios tempranos (T1 y T2) presentó valores de expresión de TKTL1 entre el 1,8 y el 45,5 au (Media 16,5 ± 12,6), mientras que la expresión de la enzima en el tumor primario más avanzado (T3 y T4) variaron desde 4,0 hasta 50,0 a.u. (Media 25,5 ± 11,8). Estos datos indican un ligero aumento en la expresión de TKTL1 cuando el desarrollo local del tumor aumenta (Mann-Whitney U test,
P = 0,029
, Figura 4B).
expresión de TKTL1 en muestras sin lymph- regional afectación de los ganglios (N0) varió desde 1,8 hasta 37,3 au (Media de 18,6 ± 9,8), mientras que los valores correspondientes para aquellos con afectación de los ganglios linfáticos regionales (N1 y N2) oscilaron desde 17,3 hasta 50,0 a.u. (Media 32,9 ± 11,5) (prueba de Mann-Whitney,
P = 0,0014
) (Figura 4C).
expresión de TKTL1 y la supervivencia
análisis
univariante de Kaplan-Meier hizo no revelan una asociación significativa entre la tinción de TKTL1 y la supervivencia en muestras de tejido de CRC (Mantel-Cox log-rank test,
P
= 0,37) (Figura 5). Por otro lado, surgen cuando se considera el tratamiento diferencias. Nuestros datos revelan una asociación significativa entre la expresión de TKTL1 y la supervivencia en los pacientes tratados con 5-fluoroacyl (prueba de log-rank de Mantel-Cox,
P = 0,017
) (Figura 5B), esta correlación no se observa en los pacientes no tratados (Mantel-Cox log-rank test,
P = 0,993
) (Figura 5C).
(a) gráfico de Kaplan-Meier correlacionar la expresión de TKTL1 y la supervivencia en pacientes con CCR no metastásico. (B) gráfico de Kaplan-Meier correlacionar la expresión de TKTL1 y la supervivencia en los pacientes no tratados. plot (C) de Kaplan-Meier correlacionar la expresión de TKTL1 y la supervivencia en pacientes con CCR tratados con 5-fluoroacyl. La línea continua representa a aquellos con la expresión de TKTL1 debajo del valor medio, y la línea de puntos representa aquellos con expresión de TKTL1 por encima del valor medio para cada grupo.
basada Validación del análisis de imágenes inmunotinción método de cuantificación
para la validación del método de cuantificación de análisis de imágenes, 5 muestras que pertenecen a la etapa I, II y III de la progresión, y con diferente nivel de expresión de TKTL1 se analizaron por Western blot. La inmunodetección de TKTL1 y actina como control de carga muestran una clara correlación entre la expresión de TKTL1 determinada por Western blot y mediante análisis de inmunohistoquímica (Figura 6).
proteína TKTL1 y actina se analizaron por transferencia de Western usando anticuerpos monoclonales específicos. TKTL1 /Act representa el análisis cuantitativo de TKTL1 corregida por actina. TKTL1 IHC son los valores de expresión de TKTL1 se determinó mediante análisis inmunohistoquímico. Todas las muestras de cáncer de colon 5 homogeneizados analizados muestran valores similares de expresión de TKTL1 en ambos análisis.
Discusión
La expresión de TKTL1 ha sido detectado y correlacionado con varios tipos de cáncer hasta el momento . La mayoría de los autores de informes estas correlaciones seguir un protocolo análogo al descrito en el documento actual, usando el mismo anticuerpo y kit para la tinción inmunológica. Sin embargo, hasta la fecha la evaluación de la inmunotinción fue inexacto, ya que se ha realizado la aplicación de un sistema semicuantitativo basado en la asignación de las puntuaciones de los observadores. El manuscrito actual describe un nuevo y más objetiva sistema para cuantificar la tinción a través de análisis de imagen computacional. Esta técnica permite la obtención de datos cuantitativos de la tinción inmunohistoquímica que conducen a una evaluación más precisa de la expresión de la enzima. Por lo tanto el método reportado se revela como una herramienta muy poderosa para la cuantificación de inmunohistoquímica de la expresión de proteínas que ofrece datos numéricos objetivas en lugar de las puntuaciones arbitrarias.
Nuestros resultados proporcionan evidencia de que la expresión de TKTL1 en el cáncer colorrectal primario está fuertemente correlacionado con la progresión tumoral . La capacidad para degradar la glucosa en condiciones anaerobias es crítica para el crecimiento del tumor, especialmente que el tumor primario se expande y las células internas se llevan lejos de la membrana basal y su suministro de oxígeno. En esta situación, TKTL1 sobreexpresión confiere una ventaja sobre las células malignas y les permite crecer más rápido. Nuestros datos muestran que la expresión de TKTL1 se correlaciona fuertemente con la progresión local (T) y la linfa regional afecto nodo (N). Esta es la primera vez que la correlación entre la expresión de TKTL1 y clasificación N se ha informado en CRC. Por otra parte, se muestra que la correlación es más fuerte que entre la expresión de TKTL1 y clasificación T (Figura 4B y C), lo que indica que el efecto de los aumentos de la enzima a medida que progresa el tumor. Este comportamiento es consistente con el hallazgo de que la sobreexpresión de TKTL1 favorece la metabolización anaeróbico de la glucosa, el aumento de la producción de lactato y la inducción de la acidificación ambiente que mejora la capacidad de invasión local. Aunque nuestros datos no revelaron ninguna asociación significativa entre la tinción TKTL1 tumor y la supervivencia del paciente, el univariado análisis de Kaplan-Meier representa en la figura 5A tendería a sugerir que un número mayor de muestras podría revelar una correlación significativa. Además, si bien el número de muestras es pequeño, la correlación entre la expresión de TKTL1 y la supervivencia en pacientes sometidos a quimioterapia parece claro. La correlación observada sugiere que el 5-fluoroacyl puede ser eficiente en el tratamiento de tumores con niveles altos de TKTL1, aquellos con una alta tasa de progresión local (Figura 5B). Sin embargo, la quimioterapia no muestra ningún efecto sobre la supervivencia de pacientes con tumores que contienen bajos niveles de la enzima, los más metastásicos (Figura 5C). Estos datos sugieren que los niveles de TKTL1 podría ser un biomarcador potencial para la predicción de la respuesta del tumor a la quimioterapia.
El estudio actual también muestra otro hallazgo interesante, la disminución altamente significativa en la expresión de TKTL1 observado cuando se comparan los pacientes no metastásicos (M0) con los metastásicos (M1). Esta regulación a la baja de la enzima cuando se produce la metástasis, al igual que la correlación con la participación de los ganglios linfáticos regionales, no se ha informado antes. Esta es la primera vez que la expresión de TKTL1 se ha correlacionado con la estadificación del tumor y la formación de metástasis en CRC. Curiosamente, un comportamiento similar se ha descrito en la incidencia de mutado
Hoteles en Ras CRC: la incidencia de la mutación aumenta de ~ 7% en adenoma temprano a ~55% en intermedia, y ~ 60% a finales de los carcinomas, pero disminuye a ~ 45% de los carcinomas invasivos, lo que indica una implicación de esta mutación en la agresividad de células pero no en las células de metástasis [7], [48].
La regulación de la expresión de TKTL1 en las células tumorales es en gran parte sin explorar, pero se ha propuesto que se podría upregulated en respuesta a la hipometilación [46]. Se desconoce el mecanismo responsable de la desmetilación global en células de cáncer, aunque los miembros de la familia Ras han sido implicados en la regulación de la metilación [49] - [52]. En la mayoría de los casos, Ras-señalización se ha relacionado con la hipermetilación y la inhibición de genes supresores de tumores. Sin embargo, también se ha relacionado con la desmetilación en algunos estudios [53] - [56]. Aquí proponemos un nuevo papel para la señalización de Ras-en la transformación tumoral que consiste en la activación por hipometilación de diferentes oncogenes, incluyendo TKTL1 en el CCR.
En particular, miembros de la superfamilia Ras han sido implicados en la regulación de la glucólisis aeróbica el aumento de la captación de glucosa y /fructosa-2,6-bisfosfatos 3 (PFKFB3) expresión 6-fosfofructo-2-quinasa [57] - [59]. actividad PFKFB3 provoca la acumulación de fructosa-2,6-bisphosfate (F26bP) y la posterior regulación al alza de 6-fosfofructo-1-quinasa (PFK-1) la actividad, lo que finalmente conduce a la producción de lactato elevada. El sustrato metabólico para PFKFB3 y PFK-1 reacciones, que son esenciales para la producción de lactato, es la fructosa-6-fosfato (F6P), uno de los productos de TKTL1. Además, TKTL1 sobreexpresión favorece la estabilización de normoxia de la malignidad de promoción de factor de transcripción inducible por hipoxia factor 1α (HIF-1α) [16] y la regulación al alza de las enzimas glucolíticas aguas abajo tales como transportador de glucosa 1 (GLUT1) y PFKFB3 [16], [ ,,,0],60]. Como hemos visto, TKTL1 juega un papel importante en piruvato y la producción de lactato a través de sus productos finales, la fructosa-6-fosfato y gliceraldehído-3-fosfato. Por lo tanto, ya que el piruvato y lactato de regular la expresión génica inducible por hipoxia e inactivan la caries HIF-1α [61], [62], TKTL1 sobreexpresión puede estimular la acumulación de HIF-1α de una manera hipóxico-independiente y promover la expresión de HIF-1 -regulated genes implicados en el metabolismo glucolítico, la angiogénesis y la supervivencia celular.
en resumen, durante el inicio de la carcinogénesis, las mutaciones en los miembros Ras pueden acumularse y dar lugar a TKTL1 promotor desmetilación y la activación de su expresión. Este fenómeno se seleccionaría porque la actividad TKTL1 sería permitir que las células para consumir la glucosa en ausencia de oxígeno transformado, producir lactato y acidificar su microambiente, fortaleciendo así su capacidad de invasión. TKTL1 también puede conducir a la estabilización de HIF-1α hipóxico-independiente y la posterior sobreexpresión de varios genes glucolíticas y angiogénicos, que proporciona un entorno adecuado para la progresión del tumor. En cuanto a la formación de metástasis dos posibles mecanismos podrían explicar los datos observados: i) sobreexpresión TKTL1 no sólo conducen a la progresión del tumor, pero también podría permitir la formación de metástasis, y cuando se establece la metástasis, TKTL1 ya no es necesario, y como la incidencia de mutado
ras
, disminuye. ii) TKTL1 es necesaria para la progresión tumoral in situ y la invasión local, pero los tumores que no sobreexpresan la enzima son incapaces de crecer en su entorno local e inducir el comportamiento metastásico como una estrategia de supervivencia del tumor a través de un proceso de selección darwiniana.
Este informe arroja luz sobre el papel de TKTL1 en la progresión tumoral, y pretende ser el primer paso hacia un nuevo enfoque para el estudio de la terapia de metástasis y el cáncer.
Materiales y Métodos
Declaración de ética
aprobación ética para el estudio se obtuvo del comité de ética del hospital Clínic de Barcelona, el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los pacientes y todas las investigaciones clínicas se han realizado de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki.
los pacientes
En el presente estudio, se incluyeron 46 hombres y 17 mujeres (70 ± 11 años) con carcinoma colorrectal (CCR) que se sometieron a cirugía entre noviembre de 2000 y octubre de 2001. De acuerdo con la clasificación TNM del cáncer de colon y rectal del Comité Americano Conjunto sobre el Cáncer (AJCC), 9 pacientes presentaron tumores en estadio I, 21 en estadio II, 16 en estadio III y 17 con estadio IV.
A todos los pacientes fueron reclutados en el Departamento del hospital Clínic de Barcelona Gastroenterología, y formaban parte del proyecto EPICOLON, un estudio prospectivo, multicéntrico, de ámbito nacional, el estudio basado en la población tuvo como propósito establecer la incidencia y características de las formas de cáncer colorrectal hereditarios y familiares en España [63]. En este proyecto, todos los pacientes con CRC recién diagnosticados en cualquier centro participante durante el período de un año se incluyeron en el estudio.
Después de la resección quirúrgica, pacientes fueron sometidos a medidas terapéuticas y de seguimiento estándar de acuerdo con las pautas recomendadas. De hecho, el tratamiento adyuvante postoperatoria con 5-fluorouracilo y leucovorina se administra a los pacientes con estadio II y III de los tumores, y la radioterapia se indica en pacientes con cáncer de recto. El seguimiento postoperatorio consistió en la historia clínica, el examen físico y los estudios de laboratorio que incluyen el antígeno sérico carcinoembrionario (CEA) niveles cada tres meses, la ecografía abdominal o tomografía computarizada cada seis meses, y la radiografía de tórax y la colonoscopia total de una vez al año. Además, todas las recidivas tumorales detectadas durante el seguimiento fueron confirmados histológicamente.
tinción inmunohistoquímica
Inmediatamente después de la resección quirúrgica, los tumores se snap-congelado y se mantienen en nitrógeno líquido. Para llevar a cabo la tinción, las secciones de CRC se obtuvieron utilizando vibrotom cortes, se desecaron para evitar la degradación y se mantuvieron a condiciones ambientales de laboratorio hasta su uso.
muestras de cáncer colorrectal se cortaron en secciones de 2 a 5 micras, colocado en portaobjetos y se fija con paraformaldehído. Las diapositivas fueron hidratados mediante aclarado en concentraciones decrecientes de etanol. Para el antígeno de muestras de desenmascaramiento se calentaron a 65 ° C aprox. en tampón 10 mM de citrato de sodio (pH 6,0) durante 5 min. Después de aclarar en H destilada
2O, la inhibición de peroxidasa endógena se realizó con una incubación de 10 min con 3% de H
2O
2. Los portaobjetos se lavaron con PBS y se incubaron con 3% de BSA en PBS durante 15 min para bloquear la tinción inespecífica. Después, las secciones se incubaron con un anticuerpo anti-TKTL1 monoclonal de ratón (clon JFC12T10) descrito previamente por Coy [32] a una concentración de 4 mg ml
-1 durante 60 minutos en una cámara humidificada a temperatura ambiente. Posteriormente, los portaobjetos se lavaron con PBS, se incubaron con biotina inmunoglobulinas anti-ratón (biotinilado Link, LSAB + -Kit, DakoCytomation, Hamburgo, Alemania) durante 25 min y, después de un nuevo lavado con PBS, se trataron con estreptavidina-peroxidasa (estreptavidina-HRP , LSAB +-kit, Dako, Hamburgo, Alemania) durante 25 minutos más. Finalmente las muestras se incubaron con 3,3 'diaminobencidina (DAB + cromógeno, Dako, Hamburgo, Alemania) durante 20 minutos a temperatura ambiente para obtener la tinción.
expresión de TKTL1 se evaluó con análisis de imágenes usando una Leica DM 4000 B microscopio (Leica Microsystems, Alemania), una monocromática IEEE-1394 cámara CFW-1312M (Scion Corporation, Frederik, MD, EE.UU.) y el dominio público NIH de imagen ImageJ programa de software, disponible a través de Internet desde la URL: http: //rsbweb .nih.gov /ij /. La intensidad se mide como "intensidad relativa /zona" y se cuantifica por interpolación en una curva de calibración trazados usando una escala de grises. Para cada muestra de 3 o 4 imágenes de diferentes áreas fueron capturados y la tinción de una zona homólogo de un control negativo, se incubaron con 3% de BSA en PBS sin anticuerpo anti-TKTL1, se restó. Los valores se presentan como "Valor relativo × 1000" unidades arbitrarias (a.u.). Este tipo de cuantificación informática de la tinción requiere 8 bits imágenes monocromáticas (Figura 2) y cuantifica la intensidad de gris dentro de una escala de calibración [64], [65] que da una evaluación de la expresión de TKTL1 que permite mucho más objetiva comparaciones entre las muestras que las clasificaciones por las puntuaciones arbitrarias.
Protein Extraction
La proteína total se purificó del 6 al 19 mg de muestras quirúrgicas congeladas. Las muestras se sonicaron a 4 ° C con una sonda de titanio en tampón de lisis que contiene 20 mM HEPES pH 7,5, 10% (v /v) de glicerol, 0,4 M NaCl, 0,4% (v /v) X-100, 10 EGTA Triton mM, EDTA 5 mM, NaF 25 mM, Na 25 mM ß-glicerofosfato, 1 mM de DTT, 1 × Inhibidores de la proteasa, 0,4 mM Pefabloc SC y 20 mg /ml de pepstatina. Después de sonicación muestras se centrifugaron a 4 ° C y 16000 rcf durante 20 minutos.