Extracto
A pesar de que la yodación de la sal es el método más común utilizado para obtener comida enriquecida con yodo, los trastornos por carencia de yodo siguen siendo un problema de salud global y afectan profundamente la calidad de la vida humana. El yodo es necesario para la síntesis de hormonas tiroideas, que son reguladores importantes del metabolismo humano, el crecimiento celular, la proliferación, la apoptosis y se ha informado de estar involucrados en la carcinogénesis. En este estudio, por primera vez, se evaluó el efecto de la lechuga yodo-biofortificados en el perfil de transcriptómica línea celular de cáncer de Caco-2 aplicando el ensayo del Genoma Humano Microarray entero. Demostramos 1326 expresados diferencialmente Caco-2 transcripciones después del tratamiento con yodo-biofortificados (BFL) y (NFL) extractos de lechuga no enriquecidos. Se analizaron las vías moleculares, funciones, procesos biológicos y clases de proteínas basado en la comparación entre BFL y genes específicos de la NFL. El yodo, que se espera que actúe como un ion libre (KI-NFL) o al menos en parte a ser incorporada en las macromoléculas de lechuga (BFL), de otro vías reguladas de numerosos factores de transcripción que conducen a diferentes efectos celulares. En este estudio se demostró la inhibición de las células Caco-2 proliferación después del tratamiento con BFL, pero no yoduro de potasio (KI), y la inducción de apoptosis mitocondrial y /o la diferenciación celular mediada por BFL. Nuestros resultados mostraron que las plantas de yodo-biofortificada pueden ser utilizados eficazmente por las células como una fuente alternativa de este elemento. Por otra parte, las diferencias observadas en la acción de ambas fuentes de yodo pueden sugerir un potencial de BFL en el tratamiento del cáncer
Visto:. Koronowicz AA, Kopeć A, Master A, Smoleń S, E Piatkowska, Bieżanowska-Kopeć R, et Alabama. (2016) transcriptoma de perfiles de Caco-2 línea celular de cáncer después del tratamiento con extractos de Yodo-biofortificado Lechuga (
Lactuca sativa L.
). PLoS ONE 11 (1): e0147336. doi: 10.1371 /journal.pone.0147336
Editor: María Cristina Vinci, Centro Cardiologico Monzino, ITALIA
Recibido: 30 Julio, 2015; Aceptado: 31 de diciembre de 2015; Publicado: 22 Enero 2016
Derechos de Autor © 2016 Koronowicz et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Los datos son disponible en el gene Expression Omnibus. El número GEO es: GSE7160
Financiación:. Este trabajo fue financiado por el Centro Nacional de Ciencia polaca 2012-2015 concesión no. DEC-2011/03 /D /NZ9 /05560, "I y Se biofortificación de verduras seleccionadas, incluyendo la influencia de estos microelementos en la calidad del rendimiento, así como la evaluación de la absorción de yodo y parámetros bioquímicos seleccionados en ratas alimentadas con verduras biofortificadas con yodo. "
Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La ingesta insuficiente de yodo en la dieta puede resultar en la deficiencia de yodo, que puede causar muchos adverso para la salud. efectos [1, 2, 3, 4]. En la actualidad, la forma más eficaz de controlar la deficiencia de yodo es una yodación generalizada de la sal de mesa. Sin embargo, en los países más industrializados el consumo excesivo de sal se está convirtiendo en un factor de riesgo de enfermedades cardiovasculares, osteoporosis o incluso el cáncer de estómago [5, 6]. Además, debe tenerse en cuenta que ciertas cantidades de yodo se pueden perder durante la preparación y elaboración de alimentos, por ejemplo, debido a la utilización de altas temperaturas [7]. yodo inorgánico es volátil y es difícil de controlar su pérdida durante el almacenamiento y el transporte, así como la cocina, especialmente con el uso de aceites de alta temperatura. En este contexto, la biofortificación de verduras con yodo durante su cultivo es una manera considerable para aumentar el consumo de yodo, especialmente ya que el yodo presente en los alimentos pueden ser fácilmente asimilada [8] y casi totalmente absorbida [7]. Biofortificación de plantas es bien conocido y se dio cuenta a través de algunos métodos biotecnológicos o agronómicos [9, 8, 10, 11, 12]. Zanahorias, tomates, patatas, lechuga y se consumen a diario en la mayoría de las familias. Por lo tanto, la fortificación de estos vegetales con yodo es una manera ventajosa para mejorar el estado nutricional de yodo de los consumidores sin el riesgo de que su ingesta excesiva. La lechuga es una verdura de hoja, que por lo general se consume cruda, sin riesgo de pérdida de yodo, por lo tanto es una buena cosecha para el estudio de yodo-bioenriquecimiento [13].
En nuestros estudios anteriores que mostraron una alta eficiencia de la biofortificación de yodo de lechuga por fertilización del suelo con yoduro de potasio (KI). Por otra parte, también se observó aumento de la concentración de yodo en la orina, así como en los tejidos seleccionados de ratas experimentales, como resultado de complementar su dieta con tal de yodo-biofortificada lechuga [14].
La literatura disponible indica que la deficiencia de yodo aumenta el riesgo de tiroides [15, 7], estómago [16, 17], de mama [18, 19] y de próstata [20] cáncer. efectos antitumorales de yodo pueden ser el resultado de su acción antioxidante, anti-proliferativa, anti-inflamatorios, así como pro-apoptóticas y pro-diferenciadores [21, 22, 23] efectos. En el estudio actual, se determinó que los extractos de lechugas yodo-biofortificados (BFL) reducen la proliferación de la línea celular de cáncer de colon. Sospechamos, que puede estar relacionado con el cambio en la expresión de genes implicados en la proliferación y el ciclo celular.
Para comprender mejor el mecanismo molecular subyacente de acción BFL se aplicó, por primera vez, en su conjunto el análisis del genoma de microarrays del perfil de transcripción de las células Caco-2 humana. Se compararon los genes regulados de manera diferente en las células tratadas con extractos de lechugas fortificados no sea yodo o biofortificada. Por último, se determinó y se analizaron las vías potencialmente afectadas celulares, procesos biológicos, funciones moleculares y clases de proteínas.
Materiales y Métodos
Preparación de extractos de lechugas
Lechuga biofortificada 'melodion ' CV. fue cultivada y fertilizado con KI como se describe por Kopeć et al. [14]. La concentración de yodo fue 0,50 mg /100 g de masa seca (D. M.) para la lechuga biofortificada y 0,12 mg /100 g D. M. para el control de la lechuga [14]. Lechuga fresca (10 g) se rompió usando un homogeneizador (tipo CAT X 120, EE.UU.) y próximo transferido al matraz Erlenmaier con agua en la temperatura de 90-100 ° C. materiales de lechuga fueron extraídos por agitación (Elpan, baño de agua agitador de tipo 357, Polonia) a 100 ° C Temp. durante 2 h, y la solución se centrifugó siguiente (tipo Centrífuga MOP-340, Polonia). A continuación, se utilizó la parte de los extractos para la medición de yodo y otras partes se almacenaron a -80 ° C para los estudios de cultivo celular.
Determinación del extracto yodo concentración
La digestión de 10 cm
3 muestras de extracto de lechuga en la mezcla de 10 cm
3 65% HNO
3 (máxima pureza, Merck, Whitehouse Station, NJ, EE.UU.) y 0,8 cm
3 70% HClO
4 ( máxima pureza, POCH, Gliwice, Polonia) se llevó a cabo en el sistema de microondas CEM MARS-5 Xpress. El contenido de yodo (I
-) se analizó por técnica de generación de vapor frío con el uso de alta dispersión ICP-OES (plasma acoplado inductivamente espectrometría de emisión óptica) espectrómetro de Leeman Prodigy Labs, New Hampshire, Massachusetts, EE.UU. [24 , 25]
Condiciones de cultivo celular
línea de células de colon humano Caco-2 (adenocarcinoma colorrectal; HTB-37). se adquirió de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, VA, ESTADOS UNIDOS). Las células se cultivaron en una incubadora, en condiciones controladas (temperatura, 37 ° C;. Aéreo, 95%; CO
2, 5%), en Eagle medio esencial mínimo (Sigma, Saint Louis, MO, EE.UU.), con de suero fetal bovino (FBS) (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) a una concentración final de 20%, según el procedimiento de la ATCC.
Cell tratamientos
Las células fueron sembradas en 96 pocillos placas de cultivo (Becton, Dickinson and Company, Warszawa, Polonia) para la viabilidad celular y las placas de cultivo de proliferación o 6 pocillos (Becton, Dickinson and Company, Warszawa, Polonia) para el aislamiento de ARN durante 24 h, de acuerdo con el protocolo de Roche (Basel , Suiza) y A & amp; A Biotecnología (Gdynia, Polonia), respectivamente. Después de ese tiempo, el medio de cultivo fue reemplazado por un medio que contiene a) el extracto de la no fortificada lechuga (lechuga de control, NFL) con contenido de yodo de 27,6 mg /dm
3, b) extraer de la lechuga yodo-biofortifed (BFL) con yodo contenido de 186,7 g /dm
3, c) de yoduro de potasio añadido a la NFL (KI-NFL) en la concentración de 186,7 g /dm
3. Una concentración final de yodo en medios de cultivo era 107.33 nmol /dm
3 para la NFL y 441,37 nmol /dm
3 de BFL. Una concentración final de yodo en el grupo KI-NFL fue el mismo que en el grupo de BFL. En todos los estudios se examinaron al menos 4 pocillos por tratamiento. Los experimentos se repitieron 3 veces. Se midió
La viabilidad celular y la proliferación
viabilidad celular usando el kit de detección de citotoxicidad (LDH) (Roche, Basilea, Suiza), de acuerdo con el protocolo del fabricante. La citotoxicidad se evaluó para los extractos de BFL con concentraciones finales de yodo que asciende a 147.12; 294,25 y 441,37 nmol, a intervalos de tiempo de 24, 48 y 72 h y se calcula según la fórmula:
La proliferación celular se determinó utilizando Labeling 5'-bromo-2'-desoxi-uridina y detección Kit III ( Roche, Basilea, Suiza), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La proliferación se estandarizado a 100% de control. El análisis de las muestras se llevó a cabo por triplicado y en tres experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student de dos colas.
El aislamiento de ARN, la validación, el etiquetado y la hibridación
El ARN total fue aislado de las células utilizando el kit de aislamiento de ARN a partir de cultivos celulares ( A & amp; A Biotecnología, Gdynia, Polonia). la cantidad de ARN se midió con NanoDrop (NanoDrop Technologies, EE.UU.). El análisis de la calidad final de ARN y la integridad se realizó con un Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.). Para asegurar una calidad óptima de datos, sólo las muestras con el número de la integridad del ARN (RIN) ≥8.0 se incluyeron en el análisis. El análisis del perfil de expresión génica se realizó mediante la expresión SurePrint G3 Human Gene 8x60K v2 de microarrays (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.). Cada diapositiva contenía 8 microarrays que representan aproximadamente 50000 sonda fija. El bajo de entrada rápida Amp Kit de etiquetado, de dos colores (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.) se utilizó para amplificar y ARN diana etiqueta para generar ARN complementario (cRNA) para oligo microarrays utilizados en los perfiles de expresión génica. El experimento se realizó con un diseño de referencia común, donde la referencia común era una piscina de cantidades iguales de ARN de las células de control.
En cada una de dos colores microarrays, hibridizada 300 ng de ARNc de la piscina (con la etiqueta Cy3) y 300 ng de cRNA (con la etiqueta Cy5). En total, nos encontramos con 12 microarrays-tres para cada grupo experimental. Microarray hibridación se realizó con el Kit de Hibridación de la Expresión Génica (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.), de acuerdo con los protocolos del fabricante. ARN Spike en Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.) se utilizó como control interno. Adquisición y análisis de las intensidades de hibridación se realizaron utilizando el escáner de microarrays de ADN de Agilent (G2565CA, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.).
detección de señales y el análisis estadístico
Los datos fueron extraídos y antecedentes resta utilizando los procedimientos estándar que figuran en la versión del software Agilent extracción de características (FE) 10.7.3.1. FE realiza una normalización Lowess. El análisis estadístico se realizó utilizando el software de Gene primavera 12.6.1 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.). Las muestras se sometieron a control de calidad y los resultados mostraron que cada muestra tenía un perfil métrica QC similar. El siguiente paso se filtraba por las banderas sonda fija para eliminar las sondas de baja calidad (banderas ausentes). La significación estadística de las diferencias se evaluó utilizando un ANOVA de una vía y la prueba HSD post-hoc de Tukey (p & lt; 0,05). Una corrección de múltiples ensayos se realizó a través de Benjamini y Hochberg tasa de falsos descubrimiento (FDR) & lt; 5%. Microarray datos fueron depositados en el Gene Expression Omnibus repositorio de datos bajo el número GSE71605 y siguieron requisitos MIAME. Para identificar las rutas de señalización y funciones de los genes de los datos de microarrays se analizó utilizando el sistema de clasificación de una pantera de base de datos en línea.
RT y PCR en tiempo real análisis
La transcripción inversa se realizó usando 1 g de ARN total aislado de las células con kit Maxima primera Strand cDNA Synthesis para RT-qPCR (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE.UU.). la verificación cuantitativa de los genes se realizó mediante el tacto CFX96
™ instrumento sistema de detección de PCR en tiempo real (Bio Rad, Hercules, CA, EE.UU.), utilizando el kit de SYBR Green Supermix precisión Melt (Bio-Rad). Condiciones de reacciones de PCR individuales se optimizaron para la pareja de oligonucleótidos (Tabla S1, información de apoyo) sobre la base de las condiciones de la forma siguiente: 95 ° C, 10 min; 45 ciclos de PCR a 95 ° C, 15 s; 59 ° C, 15 s; 72 ° C, 15 s, seguido por la fusión de análisis de la curva (65 a 97 ° C con 0,11 ° C velocidad de rampa y 5 adquisiciones por 1 ° C). Los resultados se normalizaron utilizando
GAPDH
,
ACTB Opiniones y
HPRT
genes de referencia. Las diferencias en la expresión génica entre los grupos de BFL y la NFL se evaluaron mediante pruebas t de Student.
Resultados
viabilidad y proliferación celular
Se determinó que el extracto de lechuga yodo-biofortificada suprimió la proliferación de células Caco-2 con más eficacia que el extracto de no fortificada lechuga (Fig 1). ensayo de citotoxicidad LDH se verifica que efecto observado no fue causado por la necrosis. No encontramos ninguna citotoxicidad LDH significativa de extracto de BFL en la línea celular Caco-2 en cualquier estudiaron la concentración de yodo (datos no mostrados). La proliferación celular no se vio afectada por KI además de extracto de NFL. Además, la influencia de BFL y NFL en la proliferación de la línea normal de las células FHC fue examinada y no se observó ninguna disminución en la proliferación celular (datos no presentados)
.
Los valores se expresan como medias ± SEM para el N ≥ 9 , estandarizado a NC como 100%. La significación estadística se basa en la prueba de la t de Student-* p & lt; 0,05 frente (vs). NC y ^ p & lt; 0,05 frente a la NFL.
lechuga yodo-biofortificada genes específicos en la línea celular Caco-2
Se analizaron un total de 2603 transcripciones. Hemos demostrado que alrededor del 50% de las transcripciones (1326 2603) se expresa de forma diferente entre las células tratadas con BFL y la NFL (Tabla 1). La lista de transcripciones específicas BFL se presenta en la información de apoyo (S2 tabla, información de apoyo). Entre ellos, el uso de un programa de estudio Pathway, determinamos (Tabla 2) y se visualizan las interacciones de los genes y las proteínas en respuesta al yodo (Figuras 1 y 2).
Genes regulación específica por el extracto de lechuga yodo-biofortificada en la línea celular Caco-2
Las interacciones de genes específicos BFL (S2 de mesa, información de apoyo) en respuesta al yodo (Figura 2) se generaron automáticamente mediante un programa de estudio Pathway. Como se muestra en la figura 2, yodo afecta a:
IGF1
,
TG
,
PPARg
,
GPX1
,
FOS
,
SLC6A4
,
NOS2
, y
THRB
través de arriba /abajo-regulación de su expresión y /o otras funciones moleculares. acción indirecta de yodo se refleja principalmente a través de la tiroglobulina (TG), que los residuos de tirosina son yodados en la vía de síntesis de la hormona tiroidea (TH). Por lo tanto, TG está directamente involucrado en el metabolismo de yodo y se ha informado que se asocia con numerosas enfermedades de deficiencia de yodo [26, 27]. De acuerdo con el Programa de Estudio Camino, yodo, que forma enlaces covalentes con TH y su análogo sintético (levotiroxina), puede influir en la expresión o actividad de
NOS2
,
HMOX1
,
NPPB
,
TXN
,
ABCB1
,
G6PD
,
MYLK
, así como
THRB
que codifica receptor de hormona tiroidea beta (TRβ1). A nivel genómico, TRβ1, que es un factor de transcripción TH-liganded, puede influir en los niveles de mRNA de múltiples genes regulados positivamente incluyendo tipo 1 yodotironina deiodinasa
ESD1
y regulada negativamente
E2F1
factor de transcripción involucrados en la progresión del ciclo celular (Fig 2). Este receptor también se piensa que es un mediador de la acción no genómico de TH que es responsable de la activación de la integrina αvβ3 membrana plasmática seguida de activación de las vías aguas abajo que conducen a la fosforilación de ERK1 /ERK2 y proteínas TRβ1. Por otra parte, la formación T3 mediada por complejos TRβ1 citoplasmáticos con la subunidad p85 de PI3K puede activar las vías de mTOR dependiente de aguas abajo que pueden explicar las acciones pleiotrópicos de TH [28]. Todas estas relaciones directas e indirectas entre los genes influenciados por las moléculas que contienen yodo puede corresponder, al menos en parte, con nuestros resultados muestran diferencias en la acción de la sal de yoduro de potasio (KI) y el yodo que podría incorporarse en macromoléculas de lechuga biofortificada.
Además, las interrelaciones entre los genes específicos en respuesta a BFL yodo en células Caco-2 (Tabla 2) se presentan en la figura 3.
-PCR en tiempo real
análisis en tiempo real PCR se realizó por los receptores nucleares de hormonas tiroideas (TR): receptor de la hormona tiroidea, alfa (
THRA
) codificación TRα isoformas de la proteína y receptor de hormonas tiroideas, beta (
THRB
) que codifica los receptores TRβ, así como para ESD1, que es regulado positivamente por TRs y regulada negativamente E2F1. Para determinar si los cambios en la expresión génica en BFL pueden ser el resultado de ion yoduro (I
-) acción, KI en la misma concentración que en se añadió a BFL NFL. Como resultado, los niveles de mRNA TRβ1 se redujeron en ambos extractos y no hubo cambios significativos en las transcripciones TRα. Se observó un aumento significativo de ESD1 ARNm en las líneas celulares tratadas con extractos BFL y KI-NFL. Expresión de E2F1 mRNA se redujo en el extracto de BFL y aumentó en extracto de KI-NFL (Tabla 3). Los datos obtenidos con el Real-Time PCR mostraron la misma tendencia, la verificación de los resultados de microarrays.
ontología genética molecular, análisis completo
A continuación, examinó ontología de genes (GO) para todos BFL vs . NFL transcripciones regulados diferencialmente (Tabla S2, información de apoyo), utilizando el Sistema de Clasificación de la pantera. Los resultados obtenidos a partir del análisis de las vías de señalización se presentan en la Tabla 4. GO procesos biológicos, funciones moleculares y clases de proteínas se presentan en la información de apoyo (Tablas S3-S5).
Discusión
a nuestro leal saber y entender, nuestro estudio es el primero en evaluar el efecto de la lechuga yodo-biofortificados, en el perfil del transcriptoma de la línea celular Caco-2. También es primero para mostrar la inhibición de las células de cáncer de colon proliferación en respuesta a tratamiento con extracto de lechuga yodo-biofortificada (Fig 1). Nosotros sospechamos que la reducción de la viabilidad celular puede ser causada por la presencia de yodo, que fue incorporada en la estructura de la planta. La adición de KI al extracto NFL no afectó a la reducción de la síntesis de BrdU. Esto puede sugerir que en BFL, el yodo se une covalentemente a lípidos o proteínas de las membranas del cloroplasto [29,30,31,32], aunque se necesitan más estudios. Esta forma orgánica de yodo puede interferir con vías que conducen a la reducción de la viabilidad de células. Se indica, que los tratamientos con yodo inhibir la proliferación celular mediante la generación de yodo-lípidos incluyendo el ácido 6-yodo-5-hidroxi-8,11,14-eicosatrienoico (un ácido araquidónico yodado) y iodohexadecanal [33, 34]. Estos compuestos se han detectado después de yodo (I
2) la administración de suplementos, y se presume que pueden ser potentes activadores de gamma activado por el proliferador de peroxisomas tipo de receptor (PPAR) [35]. En nuestro estudio, se observó la disminución del ARNm de PPAR después del tratamiento con BFL, así como la misma tendencia de los genes diana de PPAR (ácidos grasos proteína de unión 4,
FABP4;
disociación de proteínas 1,
ucp- 1