Extracto
AZD6244 y MK2206 están dirigidos fármacos de moléculas pequeñas que inhiben la MEK y AKT, respectivamente. La eficacia de esta combinación en el cáncer de pulmón es desconocida. Nuestro trabajo previo mostró la importancia de AKT activado en la mediación de la resistencia del cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) a AZD6244. Por lo tanto la hipótesis de que la inhibición dual de ambos MEK y AKT vías descendentes induciría actividad antitumoral sinérgico. En este estudio, se evaluó la eficacia de AZD6244 y MK2206 de forma individual en un gran panel de líneas celulares de cáncer de pulmón. Entonces, se trataron 28 líneas celulares de cáncer de pulmón humano con una combinación de AZD6244 y MK2206 a relaciones molares de drogas clínicamente aplicables. La terapia de combinación AZD6244-MK2206 resultó en un efecto sinérgico sobre la inhibición del crecimiento de células de cáncer de pulmón en comparación con los resultados del tratamiento de drogas solo solo. MK2206 mejorada AZD6244 inducida por la sobreexpresión Bim y la apoptosis en células A549 y H157. Cuando se probó la combinación de AZD6244 y MK2206 en relaciones de 08:01, 04:01, 02:01, y 01:08, se encontró que el efecto sinérgico de la terapia de combinación era relación dependiente. A relaciones de 08:01, 04:01 y 02:01, la combinación de fármacos demostrado consistentemente sinergia, mientras que la disminución de la proporción de 1:08 dio lugar a una pérdida de sinergia y produjo un efecto aditivo o antagonista en la mayoría de líneas celulares. Además, la terapia de combinación AZD6244-MK2206 mostró sinergia en la supresión de A549 y el crecimiento del tumor de xenoinjerto de H157 y el aumento de tiempo medio de supervivencia de los animales. La terapia de combinación AZD6244-MK2206 como resultado la inhibición efectiva de ambos p-ERK y la expresión de p-AKT en el tejido tumoral. Además, se detectó un aumento significativo de la apoptosis en el tejido tumoral de los ratones tratados con AZD6244-MK2206 en comparación con la del agente único ratones tratados. Nuestro estudio sugiere que la combinación de AZD6244 y MK2206 tiene un efecto sinérgico significativo en el crecimiento del tumor
in vitro
y
in vivo
y conduce a un aumento de las tasas de supervivencia en ratones con tumores de pulmón humano altamente agresivas.
Visto: Meng J, Dai B, fang B, BN Bekele, Bornmann WG, Sun D, et al. (2010) de tratamiento de combinación con inhibidores de MEK y AKT es más eficaz que cada fármaco por separado en células no pequeñas de cáncer de pulmón humano
in vitro
y
En Vivo
. PLoS ONE 5 (11): e14124. doi: 10.1371 /journal.pone.0014124
Editor: Eric J. Bernhard, Instituto Nacional del Cáncer, Estados Unidos de América
Recibido: Junio 7, 2010; Aceptado: 5 Noviembre 2010; Publicado: 29 Noviembre 2010
Derechos de Autor © 2010 Meng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo está apoyado en parte por los Institutos nacionales de Salud a través de subvención de apoyo del Centro del cáncer MD Anderson CA-016 672 - Programa de pulmón, citometría de flujo y celular de imagen (FCCI) Core Facility y el Fondo para el Apoyo a la Investigación Animal, un programa especializado de Investigación de Excelencia (SPORE) de Grant CA-070 907 (J. Minna y J. Roth), un CA-124 951 (B. colmillo) y la familia Cohen-Reinach Fundación R01 subvención de Beneficencia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) /Akt y RAS /RAF /mitogen-activated proteína quinasa (MEK) /señal extracelular regulada quinasa (ERK) vías, median la proliferación y la supervivencia en células de cáncer de pulmón humano y compartir varias moléculas de aguas abajo, tales como FOXO3a [1], [2] y [3].
Actualmente, se han desarrollado una amplia gama de inhibidores de molécula pequeña de tirosina quinasa que se dirigen a las vías de señalización de la caspasa-9 Bad , actualmente se están evaluando y dos de estos agentes en los ensayos clínicos. AZD6244 es un inhibidor alostérico de las /2 quinasas MEK1 que no compite con la adenosina trifosfato (ATP) actividad de unión [4]. Este compuesto se une a MEK1 /2 e induce varios cambios conformacionales en los no fosforilados MEK1 /2 enzimas, la inhibición de su actividad catalítica, que resulta en una inhibición de la activación de ERK y un bloqueo de las vías de transducción de señales. MK2206 es un no-ATP inhibidor alostérico competitivo altamente selectiva de AKT con IC
50 en el rango nM y tiene una amplia actividad antitumoral preclínica. También se encuentra en ensayos clínicos de fase temprana y está siendo evaluado en el tratamiento de pacientes con cáncer de pulmón. Sin embargo, la eficacia potencial de una combinación de AZD6244 y MK2206 en el tratamiento de cáncer de pulmón es desconocida. En este estudio, se investigó el efecto de la combinación de AZD6244 y MK2206 en matar líneas celulares de cáncer de pulmón humano y se encontró que esta combinación era altamente sinérgica
in vitro
y muy eficaz en el tratamiento de xenoinjertos de cáncer de pulmón. Además, se estudiaron el mecanismo de la sinergia de estos dos compuestos. Nuestros hallazgos preclínicos apoyan las investigaciones clínicas de la terapia de combinación AZD6244 y MK2206 en pacientes con cáncer de pulmón.
Materiales y Métodos
Materiales
AZD6244 y MK2206, sintetizado en el Dr. William G. El laboratorio de Bornmann en la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center, se disolvieron a concentraciones de 25 mM y 20 mM, respectivamente, en dimetilsulfóxido y se almacena a -80 ° C. Los anticuerpos contra ERK y AKT total y fosforilada se adquirieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Los anticuerpos contra Bim se obtuvieron de Calbiochem (San Diego, CA). cóctel inhibidor de la proteasa, el anticuerpo β-actina, y sulforrodamina B se obtuvieron de Sigma Chemical Corporation (St. Louis, MO). materiales de ensayo de proteínas se adquirieron de Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). TUNEL System ™ DeadEnd Flurometic se adquirió de Promega (Madison, WI).
Cultivo de células
Todas las líneas celulares de cáncer de pulmón humano fueron proporcionados por el Dr. John V. ya sea Heymach en el MD Anderson Cancer centro o los Dres. Adi Gazdar y John D. Minna en la Universidad de Texas Southwestern Medical Center en Dallas. Las líneas celulares se mantuvieron en RPMI 1640 o de alta glucosa del medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), suplementado con 10% de suero fetal bovino, 100 g /ml de ampicilina, y 0,1 mg /ml de estreptomicina; las células se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2 y 95% de aire.
viabilidad de las células de ensayo
Los efectos inhibidores de AZD6244, MK2206, y el combinación de AZD6244 y MK2206 sobre el crecimiento celular se determinó utilizando el ensayo de sulforrodamina B, como se describe anteriormente [5]. Cada experimento se realizó por cuadruplicado y se repitió al menos tres veces. La viabilidad celular relativa (%) se calculó usando la ecuación de OD
T /OD
C × 100% (donde OD
T representa la absorbancia del grupo de tratamiento y OD
C representa la absorbancia de el grupo de control). La concentración inhibitoria mediana (IC
50) los valores se determinaron utilizando CurveExpert 1.3 software y se representa en las curvas de dosis-respuesta.
análisis de transferencia de Western
lisados de células enteras se prepararon por lavado de la células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y someterlos a la lisis con tampón de muestra Laemmli suplementado con el cóctel inhibidor de la proteasa. Después de que los lisados se sometieron a sonicación durante 15 s, las concentraciones de proteína se cuantificaron utilizando el kit de ensayo de proteínas Bio-Rad. cantidades equivalentes de cada proteína se cargaron, separados por 10% o electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 12%, y después se transfirió a fluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas a 80 V durante 2 h. Las membranas se bloquearon durante 1 h con 5% de leche sin grasa seca en tampón de PBS que contenía 0,1% de Tween-20 (PBST) y se sondaron con anticuerpo primario diluido a 4 ° C durante la noche. Las membranas se lavaron tres veces en el tampón de PBST y se sondaron con anticuerpos secundarios marcados con colorante de infrarrojos; las bandas inmunorreactivas se visualizaron con la Odisea Imager (Li-COR Biosciences, Lincoln, NE).
Ciclo celular y ensayos de apoptosis
Las células se recogieron por tripsinización, se lavaron dos veces en PBS frío, fijo con hielo frío metanol 70%, y se incubaron a 4 ° C durante la noche. Después, las células se lavaron con PBS y se incubaron con 25 mg /ml de yoduro de propidio que contiene 30 mg /ml de ribonucleasa durante 30 min a temperatura ambiente. Las células se analizaron en un EPICS Profile II flujo FACSCalibur (Coulter Corp., Hialeah, FL) usando el software AV multiciclo (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA). Los experimentos se repitieron al menos tres veces.
Los estudios en animales
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo después de la aprobación de la junta de revisión institucional MD Anderson (11-03-09932) y se llevaron a cabo de conformidad con las Directrices para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio publicada por los Institutos nacionales de Salud.
hembra Balb /c ratones desnudos fueron adquiridos de Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Los animales fueron alojados en cabinas de flujo laminar en condiciones libres de patógenos específicos y se utilizaron cuando eran de 6 a 8 semanas de edad. Un total de 3 × 10
6 H157 o A549 células se inocularon por vía subcutánea en los flancos derecho dorsales de los ratones desnudos. Cuando los tumores alcanzaron un volumen medio de aproximadamente 0,1 cm
3, los ratones se dividieron aleatoriamente en grupos control y de tratamiento (
n
= 5 animales por grupo). Para los ratones H157-cojinete, se administraron los grupos de tratamiento 20 mg /kg AZD6244, 10 mg /kg MK2206, o combinación de AZD6244-MK2206 a 20 mg /kg-10 mg /kg, todos los cuales habían sido solubilizado en un medio que contiene 0,5% hidroxipropil metilcelulosa y tampón polisorbato 0,1%. En los ratones A549-cojinete, se administraron los grupos de tratamiento 24 mg /kg AZD6244, 6 mg /kg MK2206, o AZD6244-MK2206 combinación a 24 mg /kg-6 mg /kg, todos los cuales habían sido solubilizado en un medio que contiene 0,5% hidroxipropil metilcelulosa y tampón polisorbato 0,1%. Todos los fármacos se disolvieron en tampón vehículo 100 pl para cada ratón. Todos los fármacos administrados dos veces al día mediante alimentación por sonda oral. El grupo control recibió el tampón vehículo solo. La duración del tratamiento fue de 20 d. El tamaño del tumor, medido por pinzas, se registró cada 5 d. El volumen del tumor se calculó, teniendo longitud a ser el diámetro más largo a través del tumor y la anchura sea el diámetro perpendicular correspondiente, utilizando la siguiente fórmula: longitud x anchura
2 × 0,52. La tasa de inhibición del crecimiento tumoral se calculó como 100% x (tamaño del tumor
tratada tamaño /tumor
control) en cada día de medición. ratones portadores de tumores continuaron el tratamiento como se ha indicado anteriormente después de 20 d. Los ratones se permitió a la altura de su muerte natural o fueron sacrificados cuando su volumen tumoral era mayor que 2000 mm
3. Kaplan-Meier de supervivencia se trazaron y se analizaron estadísticamente. peso corporal del animal se midió y se registró cada 5 d durante el tratamiento.
Para el estudio farmacodinámico, se establecieron tumores como se describe anteriormente y se dejaron crecer a un tamaño de 0.5-0.8cm
3 antes del tratamiento empezado. Los ratones con s.c. tumores A549 fueron luego administraron diariamente vehículo, AZD6244, MK2206 o AZD6244-MK2206 a las mismas concentraciones mencionadas anteriormente (
n
= 5 animales por grupo) durante 3 días. Cuatro horas después de la última dosis, los animales fueron sacrificados y se resecaron los tumores, se fijaron con paraformaldehído al 4% y embebidos en parafina para la tinción inmunohistoquímica y ensayo de TUNEL.
La inmunohistoquímica
Las secciones se deparaffinized en xileno y diluciones seriadas de etanol. Los antígenos se recuperaron y la actividad de peroxidasa endógena fue bloqueada con peróxido de hidrógeno 0,3% durante 10 min. Las secciones se trataron a continuación con 10% de suero de cabra o de caballo normal durante 30 min. Después de la incubación durante la noche con anticuerpos primarios, incluyendo p-AKT (dilución 1:100) y p-ERK (dilución 1:100), las secciones se sondaron con anticuerpos secundarios biotinilados y después se incubaron con estreptavidina-biotina-complejo (Lab Vision, Fremont , CA). Las secciones fueron teñidas con una solución de tetrahidrocloruro 3,3-diaminobencidina (DAB; Vision Lab, Fremont, CA), de contraste con hematoxilina de Mayer (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), deshidratadas y montadas
TUNEL. ensayo de
las secciones se deparaffinized y el ensayo de TUNEL se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante de un kit disponible comercialmente (DeadEnd ™ fluorométrico TUNEL System) de Promega. Las células apoptóticas exhiben una fuerte fluorescencia verde nuclear que podría ser detectado utilizando un filtro de fluoresceína estándar. Todas las células se tiñeron con DAPI exhiben una fuerte fluorescencia nuclear azul. Se observaron las diapositivas bajo microscopía de fluorescencia con células apoptóticas relativas determinadas por el recuento de células TUNEL positivas en cinco campos al azar (en 100 × magnificación) para cada muestra.
El análisis estadístico
El
vitro
experimentos de citotoxicidad in se realizaron por triplicado para cada punto de tiempo y concentración. La importancia de la
in vitro
datos se determinó utilizando el Student
t
de prueba (2 colas). Los valores de p inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
El gen mutaciones de las líneas celulares se obtuvieron de la base de datos en línea (http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/CellLines/). Las correlaciones de la
in vitro
respuesta a AZD6244 o MK2206 (IC
50) y las mutaciones de genes se evaluaron utilizando la prueba de Wilcoxon y de regresión logística.
En el
in vivo
estudios, los volúmenes de los tumores se calculan como media ± desviación estándar. Wilcoxon rango suma de prueba y la prueba de Kruskal-Wallis se utilizaron para comparar las diferencias de tratamiento. coeficiente de correlación de Spearman se utilizó para estimar la correlación entre dos variables continuas. Las diferencias entre tratamientos con respecto a la supervivencia se evaluaron mediante la prueba de log-rank. Todas las pruebas fueron de dos caras. Los valores de p inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. software estadístico SAS 9.1.3 y S-PLUS 8,0 se utilizaron para todos los análisis.
Resultados
Efectos de AZD6244 o MK2206 El tratamiento de un solo fármaco sobre líneas celulares de cáncer de pulmón
Antes de evaluar los efectos de la terapia de combinación, hemos probado el efecto antiproliferativo de AZD6244 y MK2206 como terapias de un solo agente en un panel de 47 líneas celulares de cáncer de pulmón humano (Figura 1). La respuesta a AZD6244 variar enormemente, desde muy sensibles (IC
50 & lt; 0,2 M) a altamente resistente (IC
50 & gt; 150 mM), entre las líneas celulares. La gama de respuesta de dosis de MK2206 fue más consistente, con el IC
50 que van desde 0,4 M a 25 mM. Encontramos algunas líneas celulares fueron sensibles a AZD6244, pero resistente a MK2206 (como Calu-6, HCC1171, y H1993), mientras que otras líneas celulares fueron resistentes a AZD6244 pero sensible a MK2206 (como H522, H1395, y Calu-3) . No se observó correlación entre la sensibilidad a estos dos compuestos. Comparando los resultados de dosis-respuesta y la base de datos de mutación genética en línea, no se encontró correlación entre EGFR, KRAS, BRAF o mutaciones del gen de PI3K y la IC
50 de AZD6244 o MK2206. Tampoco se observaron correlaciones entre las mutaciones del gen EGFR /KRAS /BRAF generales y el CI
50 de AZD6244 o mutaciones de EGFR /PI3K generales de genes y el CI
50 de MK2206 (Tabla 1 y 2).
Las líneas celulares indicadas se trataron con diferentes concentraciones de cualquiera de AZD6244 o MK2206 para 96 h. La viabilidad celular se determinó utilizando sulforrodamina B, e IC
50 se calculó de acuerdo con la curva dosis-respuesta.
Efectos de la combinación de AZD6244-MK2206 varían entre el cáncer de pulmón líneas celulares
a partir de las 47 líneas celulares, elegimos 28 para probar los efectos antitumorales de la terapia de combinación AZD6244 y MK2206. Se seleccionaron las líneas celulares para representar un espectro de sensibilidad a uno o ambos fármacos. El IC
50 era & gt; 5 uM tanto AZD6244 y MK2206 para 21 de las 28 líneas celulares. Para las otras líneas celulares del CI
50 fue & lt; 5 uM de AZD6244 o MK2206 o ambos. Para determinar si los efectos antitumorales obtenidos con diferentes combinaciones de AZD6244 y MK2206 eran sinérgico, se calculó el índice de combinación (IC) de acuerdo con el método de Chou-Talalay usando software Calculsyn (Biosoft, Cambridge, UK). (CI & gt; 1,1, el antagonismo, IC = 0,9-1,1, efecto aditivo; IC = 0,2-0,9, la sinergia; CI & lt; 0,2 fuerte sinergismo). Dado que el modelo de Chou-Talalay llama a agentes citotóxicos para ser utilizados en una proporción de dosis fija, se optó por utilizar AZD6244 y MK2206 en una relación molar 05:01. Después del tratamiento con diversas concentraciones de AZD6244 (0,024 a 100 mM), MK2206 (0,005 a 20 mM) y AZD6244 /MK2206 (0,024 /0,005 a 100/20 M), que están en el rango de concentraciones alcanzado en el suero de los pacientes que recibieron AZD6244 oral y MK2206, se midió el índice de combinación (IC) en cada línea celular. En 67% de las líneas celulares, incluyendo H2023, H2347, HCC827, y H23 que se muestran en la Figura 2, el tratamiento de combinación produjo un fuerte efecto sinérgico. El tratamiento combinado produjo un efecto aditivo o antagónico sólo en el 11% de las líneas celulares (Tabla 3).
líneas celulares de cáncer de pulmón fueron tratados con diferentes concentraciones de AZD6244 (0,024 a 100 mM), MK2206 (0.005- 20 mM) y AZD6244 /MK2206 (0,024 /0.005-100 /20 M) durante 96 h. Las curvas de dosis-efecto de la combinación y de cada agente solo se presentan con fines comparativos. Se muestran líneas celulares representativas que demostraron los fuertes efectos sinérgicos de la terapia de combinación.
Efecto sinérgico de la terapia combinada AZD6244-MK2006 es
Las proporciones fijas de fármacos de relación dependiente se ampliaron por 7 líneas celulares (H1792, H157, A549, H515, H1693, H1703 y H3122) que eran sensibles a la combinación de AZD6244 y MK2206 a 8:01, 4:01, 2:01, 1:02, 1: 4, y 1:08. Se encontró que el sinergismo consistente resultó cuando se utilizaron los 8:1, 04:01, y 2:1 relaciones (Figura 2, Tabla 4), mientras que la disminución de la relación de AZD6244:MK2206 a 01:08 resultó en una pérdida de la sinergia y produjo un efecto aditivo o antagonista en la mayoría de las líneas celulares (Tabla 4). También se encontró que cada línea celular tiene su propia relación óptima de drogas. Por ejemplo, H1703 mostró el nivel más alto de sinergismo en una relación de 08:01 AZD6244:MK2206; H1693 y A549 era más alta a la 4:01 (Figura 3A, izquierda); y H157 fue más alta a 02:01 (Figura 3A, derecha).
(A) A549 y H157 se trataron con AZD6244, MK2206, o una combinación de estos dos compuestos a las concentraciones indicadas durante 48 h. (B) muestras de proteína se recogieron y AKT, p-AKT, ERK, se detectaron p-ERK y la expresión Bim con análisis de transferencia de Western. (C) Las células se trataron con tripsina y se fijaron, y el ciclo celular se midió con citometría de flujo. Los números representan porcentajes de
1 células en fase G sub-apoptóticas. Los datos representan uno de los tres experimentos independientes con resultados similares.
Columnas
, media;
Bar &, SD *,
P Hotel & lt;.. 0,05, en comparación con los tratamientos con un único agente
MK2206 aumenta la apoptosis inducida por AZD6244
Para determinar si MK2206 tuvo un efecto sobre la apoptosis inducida por AZD6244, hemos probado la expresión de AKT, p-AKT, ERK, p-ERK, y Bim y cuantificamos las células apoptóticas después del tratamiento con agentes individuales y combinados. AZD6244 es conocido por regular positivamente la expresión de Bim, una proteína BH3-solamente, que conduce a una activación de la vía mitocondrial y apoptosis, mediada por FOXO3a [6]. Además, AKT también puede fosforilar FOXO3a, y la inhibición de AKT podría potenciar la activación FOXO3a por desfosforilación. Nos dimos cuenta de que el tratamiento con AZD6244 solo condujo a una sobreexpresión relativamente moderado de Bim a las 48 h. Aunque no detectamos un cambio evidente en la expresión Bim después del tratamiento con MK2206, MK2206 cuando se combinó con AZD6244, Bim expresión aumentó a un nivel más alto que la inducida por AZD6244 solo (Figura 3B). También se encontró que la combinación de 2 fármacos dio lugar a más células apoptóticas que cualquier tratamiento con un solo fármaco solo. Una vez combinado con MK2206, la apoptosis inducida por AZD6244 aumentó del 14,4% al 29,8% en la línea celular A549 y del 6,0% al 27,0% en la línea celular H157 (
P Hotel & lt; 0,05, Figura 3C). Estos resultados indican que MK2206 mejorar de manera efectiva la activación inducida por AZD6244 de la apoptosis mitocondrial.
Efecto sinérgico
in vivo
Respuesta al tratamiento combinado AZD6244-MK2206
in vivo
se evaluó en tumores subcutáneos generados por la inyección de células A549 o H157 en los flancos de ratones BALB /c desnudos. Los ratones con tumores en los flancos establecidos de volúmenes iguales se trataron con vehículo, una sola administración AZD6244, una sola administración MK2206, o la combinación de AZD6244-MK2206. Tanto en el modelo de ratón con xenoinjerto subcutáneo H157 A549 y, los ratones que recibieron la combinación de AZD6244 y MK2206 mostraron un volumen tumoral medio significativamente reducida (135 ± 120 y 188 ± 107 mm
3) en comparación con los ratones que recibieron AZD6244 solo (848 ± 302 y 669 ± 154 mm
3), MK2206 sola (1497 ± 380 y 858 ± 125 mm
3), o el tratamiento de control (2.666 ± 275 y 1437 ± 217 mm
3) el día 20 (
P
& lt; 0,01 para las tres comparaciones; Figura 4A). Este resultado indica que la supresión de AKT con MK2206 aumento de la sensibilidad de las células A549 y H157 de AZD6244
in vivo
. Además, se encontró que el tiempo de supervivencia de los animales eran más largos en los grupos que recibieron la combinación de 2 fármacos que en los grupos que recibieron compuestos de un solo agente o tratamiento de control (Figura 4B). El tiempo medio de supervivencia de los animales tratados con la combinación de AZD6244-MK2206 aumentó significativamente (
P Hotel & lt; 0,01, Figura 4B). En el modelo de xenoinjerto A549, los ratones tratados con AZD6244-MK2206 tenían una mediana de supervivencia de 50 d, mientras que los tratados con AZD6244 solo, MK2206 solo, y el control del vehículo tenía una mediana de supervivencia de 32 d, 23 d, y 17 d, respectivamente (
P
& lt; 0,01 para las tres comparaciones). Tuvimos resultados similares en el modelo de xenoinjerto H157: los tiempos de supervivencia media para la terapia de combinación marcadamente aumentado a 45 días, mientras que para AZD6244 independiente, MK2206-solo, y los tratamientos de control fueron 33,5 d, 33 d, y 26.5 d, respectivamente (
p
& lt; 0,01 para las tres comparaciones). Además, el 20% de los ratones portadores de tumores H157 y 40% de los ratones portadores de tumores A549 que recibieron el tratamiento de combinación sobrevivieron pasado 55 d y no tenían tumores en la observación final. Además, no se encontraron diferencias significativas en el peso corporal del ratón entre los cuatro grupos siguientes el tratamiento 20 d, y no hubo toxicidades evidentes a partir de la combinación de fármacos (datos no mostrados). En conjunto, estos resultados sugieren que la combinación de AZD6244 y MK2206 tiene un efecto terapéutico sinérgico sobre el crecimiento de células de cáncer de pulmón humano en un panel de líneas celulares de NSCLC
in vitro
, y en A549 y líneas de células H157
en
vivo.
tumores en los flancos se establecieron en ratones desnudos y tratados con vehículo, la terapia de AZD6244, MK2206, o una combinación de AZD6244-MK2206 por vía oral dos veces al día a las dosis indicadas. Los volúmenes tumorales (A). Las diferencias globales entre los tratamientos fueron estadísticamente significativas (
P Hotel & lt; 0,001; prueba de Kruskal-Wallis). Hemos observado efectos estadísticamente significativas de tiempo de tratamiento al comparar el Control vs A (
P Hotel & lt; 0,05); Control frente a M (
P Hotel & lt; 0,05); Control frente a A + M (
P Hotel & lt; 0,05); A vs M (
P
= 0,05); A vs A + M (
P
= 0,05) y M vs A + M (
P Hotel & lt; 0,05) para el A549; los resultados fueron similares para H157 excepto que A vs. M no fue estadísticamente significativa. veces (B) la supervivencia. Las diferencias globales entre los tratamientos fueron estadísticamente significativas (
P Hotel & lt; 0,001; Log-RankTest).
modulación de destino en el A549 de xenoinjertos modelo de ratón
En el estudio farmacodinámico , cuatro horas después de la dosis final en el día 3, los animales fueron sacrificados y los tejidos de tumores se extirparon y se analizaron para p-ERK y p-AKT por tinción inmunohistoquímica. Se observó una inhibición de la expresión de p-ERK en los tumores de ratones tratados con AZD6244 solo o la combinación de AZD6244-MK2206. La inhibición de la p-AKT fue visto en los tumores de ratones tratados con MK2206 solo o la combinación de AZD6244-MK2206 (Figura 5A). Los resultados indicaron que el p-ERK y p-AKT se inhibieron eficazmente con AZD6244 y MK2206
in vivo
. La combinación de AZD6244 y MK2206 también podría inhibir los objetivos con eficacia. El ensayo de TUNEL mostró que MK2206 aumento de la apoptosis inducida por AZD6244 significativamente (
P Hotel & lt; 0,05). Del 2,6% al 11,2% en el tejido tumoral de xenoinjertos (Figura 5B)
Los modelos de ratón se xerograft tratados con control de vehículo, AZD6244 (24 mg /kg), MK2206 (6 mg /kg) o AZD6244-MK2206 (24 mg /kg-6 mg /kg) combinación durante 3 días. Cuatro horas después de la última dosis, los tumores fueron resecados, fijos y embebidos en parafina. (A) Las secciones se analizaron por inmunohistoquímica utilizando p-ERK y anticuerpos p-AKT y se muestran las fotografías representativas de secciones de tumor. (B) Las secciones se sometieron a TUNEL y tinción con DAPI. Las células apoptóticas relativas se determinaron contando TUNEL células positivas en cinco campos aleatorios (a 100 aumentos) para cada muestra.
Columnas
, media;
Bar &, Dakota del Sur. *,
P
& lt; 0,05, en comparación con los tratamientos con un solo agente. Se muestran las fotografías representativas en las secciones del tumor.
Discusión
En este estudio nos informan de que la terapia de combinación del inhibidor de MEK AZD6244 y el inhibidor de AKT MK2206 puede inducir inhibición sinérgica dramática del crecimiento del tumor
in vitro
y
in vivo
. Anteriormente estudios se ha observado que la resistencia a AZD6244 en células de cáncer de pulmón está mediada por la activación de AKT [5], [7]. El bucle de realimentación de RAS /RAF /MEK /ERK y vías /Akt PI3K nos llevó a formular la hipótesis de que la supresión de estas dos vías puede superar la resistencia a AZD6244 y actuar de manera sinérgica para inhibir el crecimiento del cáncer de pulmón. En este estudio, se demostró que la monoterapia con cualquiera de AZD6244 o MK2206 tiene un efecto inhibidor moderado sobre líneas celulares de cáncer de pulmón. Debido a que ciertas mutaciones de genes pueden estar implicados en la respuesta a estos agentes, también comprobamos el estado mutacional de BRAF, KRAS, EGFR y PI3K en estas líneas celulares. La mutación BRAF V600E ha informado que se correlaciona con la sensibilidad a los inhibidores de MEK [8], [9] y se ha utilizado como un criterio importante para el reclutamiento de pacientes en un ensayo clínico de inhibidores de MEK en pacientes con melanoma. KRAS, BRAF /KRAS, y LKB /KRAS mutación (s) se correlacionan con la sensibilidad a los inhibidores de MEK en el cáncer de ovario [10], el cáncer colorrectal [11], y NSCLC [12], respectivamente. Sin embargo, no se detectó una correlación evidente entre la expresión de mutaciones del EGFR, BRAF, PI3KI, o KRAS y la sensibilidad a AZD6244 o MK2206 en las líneas de cáncer de pulmón que probamos. Esto puede ser debido a los diferentes efectos de las mutaciones en los tipos histológicos de cáncer específicos o en vías específicas de líneas celulares. Por ejemplo, para cáncer de mama y de pulmón, la expresión de genes asociados con la sensibilidad diferencial a AZD6244 incluye muchos genes que no estaban en común para ambos histologías [13]. Otra posible explicación de la discrepancia de nuestros resultados y estudios previos podría ser debido a varias frecuencias de las mutaciones de genes en diferentes tipos de cáncer. Por ejemplo, BRAF está mutado en muchos cánceres, incluyendo el melanoma maligno (27-70%), cáncer de tiroides papilar (36-53%), cáncer de ovario (aproximadamente 30%), y el cáncer colorrectal (5-22%). Sin embargo, las mutaciones de BRAF se detectan sólo en el 1-2% de los pacientes con cáncer de pulmón. Sería difícil para mostrar las relaciones estadísticamente significativas con este tipo de eventos de baja frecuencia.
Nuestra investigación demostró que la terapia de combinación AZD6244-MK2206 de doble agente mostró un efecto sinérgico sobre el crecimiento del tumor en relación con cada agente por separado. Como agente único, AZD6244 fue ineficaz contra algunas líneas celulares de cáncer de pulmón (como Calu-1, H460, H661 y). Sin embargo, cuando se combina con MK2206, estas líneas celulares resistentes fueron sensibles al tratamiento de combinación. De acuerdo con los métodos de Chou-Talalay [14], se utilizó una relación de fármaco fijo para la prueba de un efecto sinérgico. En ensayos clínicos, se le dará la terapia de combinación a pacientes en la repetición de ciclos de 28-D. La dosis inicial prevista de MK2206 es 45 mg /kg cada dos días (el más alto una vez cada dos dosis día de MK2206 será 45 mg /kg) o 90 mg /kg una vez por semana y aumentar a tanto como 250 mg /kg una vez por semana ; la dosis inicial prevista de AZD6244 es de 75 mg /kg dos veces al día (http://clinicaltrials.gov/). Se seleccionó una relación de fármaco de 5:01 AZD6244:MK2206 que es en este rango para nuestro estudio inicial
in vitro
. Nuestros resultados mostraron que AZD6244:MK2206 puede inducir efectos sinérgicos entre líneas celulares 89%. Para obtener un análisis más cuantitativo, hemos ampliado las relaciones de drogas para identificar la gama más eficaz y la relación sinérgica óptima. Se encontró que estos dos fármacos mostraron efectos sinérgicos consistente en 08:01, 04:01, y 2:1 proporciones de AZD6244 a MK2206, mientras que la disminución de esta relación de 1:08 dio lugar a una pérdida de la sinergia y la presencia de efectos único aditivo o incluso el antagonismo en la mayoría de líneas celulares. Se seleccionaron dos KRAS mutado líneas celulares, A549 y H157, para seguir investigando el efecto de la combinación de AZD6244-MK2206
in vivo
. El crecimiento del tumor se inhibió significativamente con el tratamiento de combinación en comparación con el tratamiento de agente único. Los efectos farmacodinámicos en xerografts A549 mostraron que el nivel de expresión de p-ERK y p-AKT se suprime suficientemente con AZD6244 y MK2206 respectivamente. La combinación de AZD6244 y MK2206 inhibió tanto p-ERK y p-AKT con eficacia. El ensayo TUNEL mostró que el tratamiento de combinación indujo mucho más apoptosis de células tumorales que las drogas individuales. Estos resultados sugieren fuertemente que AZD6244 y MK2206 sinérgicamente inducen apoptosis por la inhibición dual de la fosforilación de ERK y AKT.
Estudios anteriores han demostrado que si las combinaciones de fármacos contra el cáncer interactúan sinérgicamente o antagonista puede depender de la relación de los agentes combinados [15 ], [dieciséis]. por lo tanto, falta de control de relaciones de fármaco debido a mecanismos no coordinados o farmacocinética podría dar lugar a resistencia a los medicamentos si las células tumorales se exponen a las relaciones de las drogas antagonistas. Es posible que las proporciones precisas descritas
in vitro
puede no ser obtenidos en el tumor de un paciente debido a la distribución diferencial y el metabolismo de estos dos compuestos. Sin embargo, se encontró que los efectos sinérgicos se produjeron en un amplio intervalo de concentraciones de la droga por lo que es probable que se logre un efecto terapéutico.
En nuestro mecanicista y
in vivo
estudios, se utilizó A549 y las líneas celulares H157 porque ambos albergan mutaciones de KRAS. Las mutaciones en KRAS se han encontrado en 20% a 30% de los cánceres de pulmón y se cree que juegan un papel clave en esta malignidad [17].