Extracto

adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) está asociada con una reacción del estroma rico en colágeno pronunciado que se ha demostrado que contribuyen a la quimio-resistencia. Hemos demostrado previamente que las células PDAC son resistentes a la quimioterapia con gemcitabina en el microambiente de colágeno debido a una mayor expresión del grupo de alta movilidad de proteína remodelación de la cromatina A2 (HMGA2). Se ha encontrado ahora que los tumores humanos PDAC muestran niveles más altos de H3K9 histonas y acetilación H3K27 en regiones fibróticas. Se demuestra que la relación con las células cultivadas en plástico de cultivo de tejidos, las células cultivadas en PDAC geles de colágeno tridimensionales muestran una mayor H3K9 histonas y acetilación H3K27, junto con el aumento de la expresión de p300, PCAF y acetiltransferasas GCN5 histonas (HAT). El derribo de HMGA2 atenúa el efecto del colágeno en H3K9 histonas y acetilación H3K27 y el p300 inducida por colágeno, PCAF y expresión GCN5. También se muestra que los tumores humanos PDAC con HMGA2 muestran una mayor H3K9 histonas y acetilación H3K27. Además, mostramos que las células en geles de colágeno tridimensionales muestran una mayor protección contra la gemcitabina. De manera significativa, la baja regulación de HMGA2 o p300, PCAF y sombreros Gcn5 sensibiliza las células a la gemcitabina en colágeno tridimensional. En general, nuestros resultados aumentan nuestra comprensión de cómo el microambiente colágeno contribuye a la quimio-resistencia in vitro e identificar los HAT como potenciales dianas terapéuticas contra este cáncer mortal

Visto:. Dangi-Garimella S, V Sahai, Ebine K, Kumar K, Munshi HG (2013) tridimensional de colágeno I promueve la resistencia a gemcitabina in vitro en células de cáncer pancreático a través de la expresión de la histona acetiltransferasa HMGA2-dependiente. PLoS ONE 8 (5): e64566. doi: 10.1371 /journal.pone.0064566

Editor: Edna Cukierman, el Fox Chase Cancer Center de los Estados Unidos de América

Recibido: 21 Enero, 2013; Aceptado: April 16, 2013; Publicado: 16 May, 2013

Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0

Financiación:. Instituto Nacional del Cáncer de subvención#R01CA126888 Department of Veterans Affairs al mérito de Subvención#I01BX001363. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

a pesar de enormes esfuerzos, los progresos realizados en el tratamiento del adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) ha sido frustrante escasa [1], [2]. PDAC sigue siendo la cuarta causa principal de muertes relacionadas con cáncer en los EE.UU., con una mortalidad ~ 80% de un año para la mayoría de los pacientes [3]. Esta falta de progreso se debe en parte a la reacción fibrótica rico en colágeno pronunciado asociado con tumores PDAC [4], [5], que posteriormente se limita la entrega y la eficacia de la quimioterapia [6], [7], [8], [ ,,,0],9]. Recientemente, hemos publicado que las células PDAC en el microambiente de colágeno tridimensional inducen alta movilidad grupo A2 (HMGA2), una proteína de arquitectura que regula estructura de la cromatina y también media quimio-resistencia en el microambiente rico en colágeno [6], [10], [11]. De manera significativa, HMGA2 es aumentada en tumores humanos PDAC, sobre todo en tumores de alto grado con metástasis en los ganglios linfáticos [12], [13].

PDAC también se asocia con cambios epigenéticos, que han sido relacionados con el pronóstico del paciente [ ,,,0],14], [15]. Post-traduccionales patrones de modificación de histona detectado por inmunohistoquímica mostraron ser predictivo de pronóstico en dos grandes cohortes de pacientes PDAC tratados con quimioterapia [14], [15]. pacientes PDAC cuyos tumores demostrado una baja expresión de la histona H3 lisina 27 tri-metilación (H3K27Me
3) o la histona H3 lisina 9 di-metilación (H3K9me
2), que son marcas de la cromatina cerrado ( 'heterocromatina') y la represión de genes [16], [17], [18], tuvieron una supervivencia global significativamente más corta que los pacientes cuyo cáncer se muestra PDAC alta histona H3K27Me
3 o histona H3K9me
2 expresión [14], [15]. Sin embargo, los pacientes PDAC con baja histona H3K4me
2, que es una marca de una cromatina más abierta ( 'eucromatina') del estado, también se demostró que la supervivencia general más corta que los pacientes PDAC cuyos cánceres se muestra alta expresión H3K4me
2 [15] . En contraste a la metilación de histona, que está asociada tanto con la activación de genes y la represión, la acetilación de histonas solamente se ha relacionado con la activación de genes asociados con el estado eucromatina [16], [17], [18]. A pesar de la clara relación entre la acetilación de histonas y el desarrollo del cáncer [19], [20], la contribución de los HAT a la progresión PDAC no ha sido bien estudiado.

La expresión y la actividad de las proteínas HAT se alteran en una variedad de tipos de cáncer [21], [22]. Por ejemplo, el HAT p300 está implicado en la activación del promotor c-myc en células PDAC [23]. También se requiere la HAT p300 para la transición ciclo G1 /S de células, como regulación a la baja de HAT p300 causa la inhibición del crecimiento de células de melanoma [24]. HAT también modulan el estado de la cromatina en las células, con GCN5 y siendo HAT PCAF suelen ser necesarios para la acetilación de la histona H3K9 mundial y siendo el SOMBRERO p300 a menudo involucrados en la acetilación de la histona H3K27 mundial [22], [25]. Curiosamente, el sombrero GCN5 contribuye al mantenimiento generalizado de la cromatina activa inducida por el myc oncogénica [26].

En este informe, se examina el papel y la regulación de p300, PCAF y sombreros Gcn5 en células PDAC. Se demuestra que el microambiente de colágeno tridimensional a través de la expresión de HMGA2 promueve H3K9 histonas y acetilación H3K27 junto con p300, PCAF y la expresión en células GCN5 SOMBRERO PDAC. Además, se muestra que los tumores humanos PDAC con una mayor visualización de la fibrosis mayor H3K9 histonas y acetilación H3K27, y tienen una mayor expresión HMGA2. Por otra parte, las células PDAC en geles de colágeno tridimensionales muestran una mayor protección frente a gemcitabina. De manera significativa, la regulación negativa de HMGA2 o p300, PCAF y sombreros Gcn5 sensibiliza las células a la gemcitabina en colágeno tridimensional. En general, nuestros resultados aumentan nuestra comprensión de cómo el microambiente de colágeno tridimensional contribuye a la quimio-resistencia in vitro, y establecen los HAT como potenciales dianas terapéuticas contra este cáncer mortal.

Resultados

aumentos de colágeno H3K9 histonas y H3K27 acetilación

Recientemente hemos publicado que las células que crecen en PDAC el microambiente rico en colágeno fueron protegidos contra los efectos de la quimioterapia [6]. Hemos demostrado que la protección contra la quimioterapia se debe a una mayor expresión de HMGA2 [6], una proteína de arquitectura implicado en la regulación del estado de la cromatina [10]. Desde HAT se han relacionado con los cambios en el estado de la cromatina y también mediar en la respuesta al daño del ADN [19], [20], [21], [22], [27], [28], se examinó si la fibrosis en PDAC humana Los tumores se asocian con cambios en la acetilación de histonas. Además, dado que p300 y Gcn5 HAT están implicados en la relajación de la cromatina mediante la promoción de la acetilación en los sitios de daño en el ADN y facilitar la reparación [27], [28], se examinaron los cambios en la acetilación de la histona H3 lisina residuos mediadas por estos dos sombreros. Como SOMBRERO p300 suele participar en las funciones globales de acetilación de la histona H3K27 y el sombrero GCN5 para regular la acetilación global de la histona H3K9 [22], [25], las muestras tumorales PDAC humanos fueron teñidos para H3K9 histonas y acetilación H3K27 por IHC y tricrómico tiñeron para evaluar la fibrosis . Como se muestra en las Figs. 1A y 1B, hay una mayor H3K9 histonas y acetilación H3K27 en las regiones de la fibrosis en comparación con las áreas no fibróticas. La cuantificación de la tinción relativa mostró que no había aumento de ~ 2 veces en la tinción nuclear de H3K9 histonas y acetilación H3K27 en áreas de fibrosis en comparación con las zonas no fibróticos (Fig. 1C). Para determinar si el microambiente de colágeno se causalmente vinculado a H3K9 histonas y acetilación H3K27, las células PDAC (células Panc1 y CD18) se sembraron en placas de plástico de cultivo de tejidos o en geles de colágeno tridimensionales y evaluado para H3K9 histonas y acetilación H3K27 por transferencia de Western. PDAC células cultivadas en geles de colágeno tridimensionales demostraron un aumento del H3K9 histonas y acetilación H3K27 (Fig. 1D).


A, B Opiniones. microarrays de tejidos pancreáticos humanos (TMA) que contienen 24 especímenes fueron immunostained con un anticuerpo de control IgG o para H3K9 histonas y acetilación de la histona H3K27 (Ac). El TMA también se tiñó triCHROME para evaluar la fibrosis. El
inserciones
muestran imágenes de mayor aumento de la tinción con IgG de control, y de la histona H3K9ac y la histona H3K27Ac.
C
. La cuantificación de las histonas y las histonas H3K9Ac- células H3K27Ac-positivos se realizó utilizando el software Adobe Photoshop CS3. *, P & lt; 0,01 en relación con las secciones con baja fibrosis.
D
. células Panc1 y CD18 se cultivaron en plástico de cultivo de tejidos o en geles de colágeno tridimensionales durante 24 horas. Las células se lisaron y se sometieron a inmunotransferencia para la histona H3K9ac y H3K27Ac utilizando α-tubulina como control de carga. Los resultados son representativos de al menos cuatro experimentos independientes.

También examinó el efecto de colágeno I superficies recubiertas con ( 'colágeno bidimensional') en H3K9 histonas y acetilación H3K27. Como se muestra en Supplemental Fig. S1, superficies revestidas con colágeno tuvo efectos variables en H3K9 histonas y acetilación H3K27. Histona H3K9 acetilación se incrementó en el colágeno de dos dimensiones en las células Panc1, pero no en células CD18. En contraste, la acetilación de la histona H3K27 se incrementó en el colágeno de dos dimensiones en las células CD18, pero no en las células Panc1. Estos resultados sugieren que las superficies de colágeno de dos dimensiones pueden inducir, en cierta medida, H3K9 histonas y acetilación H3K27. Sin embargo, ya que las células tumorales in vivo están rodeados por colágeno [4], [5], en placas células de colágeno tridimensional es un modelo más representativo para examinar el efecto del colágeno en el comportamiento de células de cáncer de páncreas.

HMGA2 regula H3K9 inducida por colágeno y la acetilación H3K27

Hemos demostrado previamente que el microambiente de colágeno aumentó HMGA2 expresión en células PDAC [[6] y en la Fig. 2A]. Para determinar si HMGA2 mediada H3K9 histonas inducida por colágeno y la acetilación H3K27, expresión HMGA2 se downregulated por 2 siRNAs diferentes en las células Panc1 y CD18 (Fig. 2B) y el efecto sobre H3K9 histonas y acetilación H3K27 fue determinada. Como se muestra en las Figs. 2C y 2D, HMGA2 siRNA disminución inducida por colágeno H3K9 histonas y acetilación H3K27 tanto en las células Panc1 y CD18. Desde nuestros cultivos in vitro establecen la regulación de HMGA2 H3K9 histonas y acetilación H3K27, el próximo examinado la medida en que las muestras humanas tumorales que sobreexpresan PDAC HMGA2 muestran un aumento de H3K9 histonas y acetilación H3K27. Como se muestra en la Fig. 2E, los tumores humanos PDAC con HMGA2 expresión también demostró una mayor H3K9 histonas y acetilación H3K27. La asociación entre HMGA2 y la acetilación H3K9 en nuestra TMA fue estadísticamente significativa (p = 0,03), mientras que la asociación entre HMGA2 y la acetilación H3K27 mostró una tendencia hacia la significación (p = 0,10).


Un
. células Panc1 y CD18 se cultivaron en plástico de cultivo de tejidos o en geles de colágeno tridimensionales durante 24 horas y a inmunotransferencia para HMGA2. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes.
B Opiniones -
D
. células Panc1 y CD18 fueron transfectadas con ARNsi de control o con 2 siRNAs HMGA2 diferentes, se dejaron recuperar durante la noche y luego incorporado en el colágeno tridimensional durante 24 horas. Lisados ​​se sometieron a inmunotransferencia para HMGA2 (
B Opiniones), histona H3K9ac (
C
) y la histona H3K27Ac (
D
) usando α-tubulina como control de carga. Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes.
E
. TMA pancreático humano se immunostained para HMGA2 (

la izquierda), histona H3K9ac (

media) y la histona H3K27Ac (

derecha).
F
. La relación entre HMGA2 y la histona H3K9ac o H3K27Ac se evaluó mediante la prueba exacta de Fisher.

HMGA2 regula p300 inducida por colágeno, PCAF y expresión GCN5 SOMBRERO

A continuación examinó el efecto de tres geles de colágeno dimensionales en p300, PCAF y sombreros Gcn5 en células Panc1 y CD18. Como se explicó anteriormente, SOMBRERO p300 suele participar en la acetilación de H3K27 mundial y sombreros Gcn5 y PCAF función para regular la acetilación H3K9 mundial [22], [25]. PDAC células en geles de colágeno tridimensionales muestran una mayor expresión de p300, PCAF y sombreros Gcn5 (Fig. 3A). Para demostrar que estos sombreros, de hecho, median H3K9 inducida por colágeno y la acetilación H3K27 en las células PDAC, p300, PCAF y GCN5 expresión se downregulated mediante la combinación de tres diferentes siRNAs en Panc1 y células CD18 (Fig. 3B), y el efecto sobre H3K9 y se determinó H3K27 acetilación. La combinación de siRNAs contra p300, PCAF y GCN5 disminuyó inducida por colágeno H3K9 histonas y acetilación H3K27 tanto en las células Panc1 y CD18 (Fig. 3C y 3D).


Un
. células Panc1 y CD18 se cultivaron en plástico de cultivo de tejidos o en geles de colágeno de tres dimensiones para 24 horas. Las células se lisaron y se sometieron a inmunotransferencia de p300, PCAF y acetilatransferasas GCN5 histonas (HAT) utilizando α-tubulina como control de carga. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes
B Opiniones -
D
. células Panc1 y CD18 fueron transfectadas con siRNA control o con la combinación de siRNAs contra p300, PCAF y GCN5 (HAT siRNA); dejaron recuperar durante la noche y luego incorporado en geles de colágeno tridimensionales durante 24 horas. Los lisados ​​se sometieron a inmunotransferencia de las proteínas correspondientes HAT (
B Opiniones), y la histona H3K9ac (
C
) y H3K27Ac (
D
). Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes.
E, F
. células Panc1 y CD18 fueron transfectadas con siRNA control o con siRNAs individuales contra p300, PCAF y GCN5; dejaron recuperar durante la noche y luego incorporado en geles de colágeno tridimensionales durante 24 horas. Los lisados ​​se sometieron a inmunotransferencia para la histona H3K9ac (
E
) y H3K27Ac (
F
). Los resultados son representativos de tres experimentos independientes.

Hemos examinado, además, la contribución relativa de p300, GCN5 y PCAF en la acetilación de histonas mediante siRNAs individuales en lugar de la combinación de los tres siRNAs. Como se muestra en la Fig. 3E, la transfección de siRNAs individuales contra p300, PCAF o GCN5 disminuyó histona H3K9 acetilación en las células Panc1. Sin embargo, la transfección de los siRNAs HAT individuales en células CD18 tuvo un efecto mínimo o un aumento paradójico de la acetilación de histonas H3K9 en las células CD18. Transfección de ARNsi GCN5 o PCAF siRNA en células CD18 aumenta la acetilación de histonas H3K9. Curiosamente, se ha demostrado recientemente que hay un aumento de la acetilación de histonas H3K9 en fibroblastos de embriones de ratón PCAF nulos y Gcn5 nulo [25]. Del mismo modo, el efecto sobre la acetilación de la histona H3K27 fue mínima o aumentado después de la transfección de cualquiera GCN5 siRNA o PCAF siRNA (Fig. 3F). Sin embargo, la transfección con p300 siRNA redujo la histona H3K27 acetilación tanto en las células CD18 y Panc1.

Desde demostramos que HMGA2 regula inducida por colágeno H3K9 histonas y acetilación H3K27 (Fig. 2), se analizó el grado en que HMGA2 también mediada por p300 inducida por colágeno, PCAF y expresión GCN5. Como se muestra en la Fig. 4, HMGA2 ARNsi disminuyó p300, PCAF y niveles Gcn5 tanto en las células CD18 Panc1 y cultivadas en colágeno 3D.

Panc1 y células CD18 fueron transfectadas con siRNA control o con 2 siRNAs HMGA2 diferentes, dejaron recuperar durante la noche y luego chapado en geles de colágeno tridimensionales durante 24 horas adicionales. Los lisados ​​fueron analizados para p300 (
Un
), PCAF (
B Opiniones) y GCN5 (
C
) HAT utilizando α-tubulina como control de carga. Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes.

PDAC células en geles de colágeno tridimensionales están protegidos contra la gemcitabina

Nos ha demostrado previamente que las células PDAC en colágeno tridimensional geles fueron protegidos contra los efectos de gemcitabina y continúan proliferando [6]. Por lo tanto, hemos examinado el efecto del colágeno en las células CD18 después del tratamiento con gemcitabina. células CD18 en plástico o en geles de colágeno tridimensionales se trataron con gemcitabina durante 24 horas y luego se trataron con tripsina o sometidos a la colagenasa de extracción. Después las células se volvieron a sembrar en plástico o en geles de colágeno tridimensionales, y la capacidad de las células para formar colonias se evaluó a los 5 días. Aproximadamente el 5% de células CD18 en el plástico tratados con gemcitabina forma colonias multicelulares en relación con las células no tratadas (Fig. 5A). Por el contrario, mayor que 50% de las células CD18 en geles tridimensionales de colágeno tratados con gemcitabina forman colonias (Fig. 5A).


A
. células CD18 cultivadas en plástico o en geles de colágeno tridimensionales se dejaron sin tratar o tratados con gemcitabina durante 24 horas. Después las células se trataron con tripsina o extraídas de colágeno por tratamiento con colagenasa. Las células se volvieron a sembrar en el plástico de cultivo de tejidos o en geles de colágeno tridimensionales en baja densidad (

la izquierda). Las células se fotografiaron 5 días más tarde y se contaron (

derecha). **, P & lt; 0,001. Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes.
B, C
. células CD18 fueron transfectadas con ARNsi de control, HMGA2 siRNA (
B
) o combinación de siRNAs contra PCAF, GCN5 y p300 (
C
), se dejó recuperar durante la noche y después se sembraron en geles de colágeno para 24 horas. Las células se trataron entonces con gemcitabina durante 24 horas, extraídos de colágeno por tratamiento con colagenasa y luego se volvieron a sembrar en geles de colágeno tridimensionales a baja densidad. Las células se fotografiaron 5 días más tarde y se contaron. *, P & lt; 0,05. Los resultados son representativos de al menos 3 experimentos independientes.

HMGA2 y sombreros median la protección contra la gemcitabina en geles de colágeno tridimensionales

Como habíamos demostrado previamente que HMGA2 siRNA disminución de la proliferación de PDAC células en geles tridimensionales de colágeno después del tratamiento con gemcitabina [6], se analizó el efecto de HMGA2 siARN en las células PDAC en colágeno después del tratamiento con gemcitabina. células CD18 fueron transfectadas con ARNsi de control o HMGA2 siRNA, y se trataron con gemcitabina durante 24 horas mientras que el crecimiento en geles de colágeno tridimensionales. Las células se extrajeron después de colágeno y se volvieron a sembrar en colágeno a una baja densidad para un adicional de 5 días. Las células CD18 transfectadas con siRNA HMGA2 Mostrar número de colonias en comparación con las células CD18 transfectadas con siRNA control (Fig. 5B) reducen. Del mismo modo, se examinó el efecto de siRNAs contra p300, PCAF y sombreros Gcn5 sobre las células PDAC en geles de colágeno tridimensionales después del tratamiento con gemcitabina. Como se muestra en la Fig. células 5C, CD18 transfectadas con P300, PCAF y GCN5 SOMBRERO siRNAs también muestran reducción del número de colonias en comparación con las células CD18 transfectadas con siRNA control.

Discusión

El microambiente tumoral rica en colágeno juega un elemento esencial papel en la progresión PDAC por tanto las células cancerosas que promueven tanto la invasión tumoral y la metástasis y la protección contra la quimioterapia [4], [29]. No sólo limita la administración de quimioterapia a las células del cáncer [7], pero también activa las vías que limitan el efecto de la quimioterapia [6] de señalización, [7], [8], [9]. Anteriormente, habíamos publicado que la inducción de la expresión de HMGA2 en tridimensionales de colágeno permitido células PDAC para superar el efecto de la quimioterapia y continuar proliferando [6]. Curiosamente, HMGA proteínas se mostraron recientemente para aumentar la expresión de la ataxia-telangiectasia mutada (ATM), el sensor celular principal de estrés genotóxico, aumentando así la resistencia a los agentes que dañan el ADN [30]. En este informe, se muestra que HMGA2 también puede regular la expresión de p300, PCAF y sombreros Gcn5 en geles de colágeno tridimensionales para limitar el efecto de la gemcitabina.

A pesar de que no examinó si HMGA2 se une directamente a HAT promotores para regular la expresión, HMGA2, al actuar como un interruptor mundial de la cromatina, se ha demostrado que regulan & gt; 1.000 genes [31]. Algunos de estos genes están regulados por HMGA2 uniéndose directamente a las secuencias promotoras. Por ejemplo, HMGA2 regula la expresión de hTERT por la unión al promotor de hTERT y causando la disminución de la ocupación de HDAC2 en el promotor de hTERT [32]. Esto conduce a un aumento localizado de la acetilación de histonas H3K9 y la modulación de la transcripción de hTERT [32]. Sin embargo, otros estudios han demostrado que HMGA2 puede afectar indirectamente la expresión de genes a través de la activación de vías de señalización, tales como la inducción de PI3K /Akt /mTOR /p70S6K cascada de señalización siguiente sobreexpresión de HMGA2 en las células del estroma [33]. Hemos demostrado previamente que HMGA2 promueve la señalización ERK1 /2 en células de cáncer de páncreas en el colágeno 3D [6]. Por otra parte, hemos encontrado que ERK1 /2 señalización también puede mediar en la expresión HAT inducida por colágeno (Dangi-Garimella S. y Munshi H.G., observación no publicada). Por lo tanto, es posible que la regulación HMGA2 de HAT en el colágeno tridimensional está mediado a través de la señalización ERK1 /2.

Se demuestra que el aumento de p300, GCN5 y PCAF expresión sombrero en 3D colágeno promueve H3K9 histonas y acetilación H3K27 . Es importante destacar que, H3K9 histonas y acetilación H3K27 son en su mayoría situados en los sitios de inicio de transcripción y se enriquecen en los promotores de genes transcritos activamente [16], [18], y por lo tanto los cambios en H3K9 histonas y H3K27 histona puede tener efectos amplios y profundos en la expresión génica y el comportamiento celular. Es posible que el microambiente de colágeno también puede modular la acetilación de otros residuos de lisina. Sin embargo, se ha demostrado que GCN5 y PCAF son redundantes y se específicamente necesarios para la acetilación de histonas H3K9 en fibroblastos [25]. fibroblastos PCAF nulos tienen preservación de la acetilación de histonas H3K9 y demuestran reducción en la acetilación de histonas H3K9 sólo cuando GCN5 es derribado en estos fibroblastos [25]. Curiosamente, los autores muestran que convincente GCN5 puede acetilar H3K14 histona en un ensayo in vitro, pero no se detectó ningún cambio en la acetilación de histonas H3K14 cuando PCAF y GCN5 fueron derribados in vivo [25]. Además, p300 downregulating no afectaron a la acetilación de la histona H3K14 in vivo, pero sobre todo disminuyeron histona K3K27 acetilación [25]. También es posible que los cambios en H3K9 histonas y acetilación H3K27 podría ser debido a la represión de las histona desacetilasas (HDACs) en el colágeno tridimensional. HDAC1 y HDAC7 se incrementan en los tumores pancreáticos humanos en comparación con tejido normal [34], [35]. Por otra parte, la expresión de los miembros de las HDAC de clase I en líneas celulares de cáncer de páncreas aumenta en comparación con las células normales HPDE [36]. En estudios futuros, vamos a examinar si el microambiente colágeno modula la expresión de las HDAC en líneas celulares de cáncer de páncreas.

De manera significativa, se muestra que los Sombrero contribuyen a la quimio-resistencia en colágeno tridimensional. El sombrero p300 ha demostrado estar implicado en la respuesta al daño de ADN por la modulación de extremos no homólogos (NHEJ) reparar [27]. La disminución de la actividad o expresión de p300 HAT suprime NHEJ, perjudica la reparación de doble filamento romper (OSD) y sensibiliza a las células de cáncer de pulmón a la radiación y la quimioterapia [27]. Se requiere que el HAT p300 para la acetilación de las histonas en DSBs para facilitar la relajación de la cromatina y la reparación del ADN eventual [27]. Además, GCN5 estimula la reparación por escisión nuclear mediante la promoción de H3K9 acetilación y la relajación de la cromatina en los sitios de daño [28]. Es importante destacar que se está reconociendo cada vez más que el estado de la cromatina puede afectar a la respuesta celular a la quimioterapia. Aunque la heterocromatina más compacto puede limitar el grado de daño en el ADN inicial [37], también puede restringir el acceso a las proteínas de reparación del ADN. la reparación del ADN tras la exposición a carcinógenos es menos eficiente dentro de las regiones heterocromatínicas relativos a las regiones menos compactos euchromatic [38]. En consonancia con el modelo en el que la heterocromatina restringe el acceso a las proteínas implicadas en la reparación del ADN, el tratamiento con el inhibidor de HDAC tricostatina promovió la formación de eucromatina y una mayor respuesta al daño del ADN en las células del cáncer de mama [39]
.
A pesar de que no hemos examinado la efecto de la orientación HAT in vivo, nuestros resultados sugieren fuertemente que los HAT segmentación nos permitirán aumentar la eficacia de la quimioterapia en modelos de ratón de cáncer de páncreas y en pacientes con cáncer de páncreas. Esto también es apoyado por los hallazgos de que un estado de la cromatina más abierta en las muestras de tumor PDAC puede estar asociada con un peor pronóstico [14], [15]. Aunque varios inhibidores de HDAC se han descrito y estudiado de forma exhaustiva en la progresión del cáncer [40], [41], [42], se han desarrollado sólo un número limitado de inhibidores de HAT [22]. Además, es importante tener en cuenta que los pacientes PDAC tratados con el inhibidor de HDAC CI-994 y gemcitabina no demostraron un aumento de las tasas de respuesta en comparación con la gemcitabina sola [43]. Los inhibidores sintéticos HAT iniciales demostraron ser eficaces en el bloqueo de la actividad HAT in vitro; sin embargo, su uso estaba limitado por la baja estabilidad metabólica y la mala permeabilidad celular. El uso del ácido anacárdico inhibidor de HAT de origen natural también se limita por la mala permeabilidad celular [44]. Aunque los compuestos de origen natural curcumina y garcinol han demostrado ser inhibidores eficaces HAT in vitro e in vivo [22], que también demuestran la actividad no específica significativa. Recientemente, compuesto C646 fue diseñado por el cribado de ligando virtual y ha demostrado ser un potente, altamente selectivo, célula permeable inhibidor de molécula pequeña p300 HAT [45]. El inhibidor impide C646 intracelular acetilación de histonas y disminuye el crecimiento de las células cancerosas in vitro [45], [46]; Sin embargo, no se ha reportado la eficacia de C646 en estudios con animales y humanos.

En general, se demuestra que el microambiente de colágeno in vitro limita la eficacia de la gemcitabina través de la expresión SOMBRERO HMGA2-dependiente (Fig. 6). También mostramos que HMGA2 expresión se asocia con la acetilación de histonas en los tumores humanos PDAC, sobre todo en zonas de fibrosis, lo que sugiere que la reacción fibrótica pronunciada puede contribuir a la resistencia a la quimioterapia mediante el aumento de la señalización HMGA2-HAT. Teniendo en cuenta que se ha avanzado muy poco en el tratamiento del cáncer de páncreas, la orientación HAT podría ser un enfoque novedoso para sensibilizar a los tumores de páncreas a la quimioterapia
.
Anteriormente, habíamos publicado que el microambiente de colágeno inducida HMGA2 expresión [Dangi- Garimella S et al, [6]]. Ahora demuestran que las células en el microambiente PDAC colágeno inducen la expresión HAT HMGA2-dependiente y acetilación de histonas H3, lo que sugiere que el microambiente de colágeno promueve la formación de eucromatina. Esta vía de señalización permite que las células PDAC para resistir los efectos de la gemcitabina en el microambiente de colágeno.

Materiales y Métodos

Reactivos Químicos /

GCN5 (SC-20698) , PCAF (sc-13124), y α-tubulina (sc-8035) los anticuerpos se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); p300 (05-257), la acetilación de la histona H3K9 (04-1003), y la acetilación de histonas H3K27 (05-1334) anticuerpos se obtuvieron de Millipore (Billerica, MA); y el anticuerpo HMGA2 era de BioCheck Inc. (Foster City, CA). Los anticuerpos secundarios fueron adquiridos de Sigma (St. Louis, MO). El colágeno tipo I se obtuvo de BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ). La gemcitabina se obtuvo de Eli Lilly (Indianapolis, IN). kit electroporación Nucleofector se adquirió de Lonza (Walkersville, MD). HMGA2#1 (279254), HMGA2 nº 2 (279,255), GCN5 (s5659), PCAF (s16894), y P300 (s4696) siRNAs se adquirieron de Life Technologies (Carlsbad, CA).

La inmunohistoquímica (IHC )

microarrays de tejidos pancreáticos (TMA) se obtuvieron de los Estados Unidos Biomax (Rockville, MD) y consistieron en 24 núcleos de páncreas que miden 1,5 mm de diámetro y 5 m de espesor. Los portaobjetos se tiñeron tricrómico o se tiñeron para H3K9 acetilación, la acetilación de H3K27 y HMGA2 de acuerdo con procedimientos IHC estándar [5], [6], [47]. las muestras teñidas se calificaron en una escala de 0-3 con el siguiente sistema de puntuación: 0-0% de las células teñidas; 1- & lt; 25%; 02/26/50%, o 3- & gt;. 50%

Cultivo celular

Panc1 y CD18 /HPAF-II se obtuvieron de ATCC (Manassas, VA). Las células se mantuvieron en DMEM que contenía 10% de FBS y antibióticos (100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina) [6]. Las células fueron probados por un perfil de STR en el Centro Johns Hopkins recursos genéticos y Core mostraron un perfil similar a la de la página web de la ATCC.

células de incrustación de tipo tridimensional de colágeno I geles

Colágeno mezcla (2 mg /mL) se hizo mediante la adición de los volúmenes apropiados de agua estéril, 10X DMEM y NaOH y se mantuvo en hielo hasta que se necesite [6], [48], [49]. células PDAC se suspendieron en la solución de colágeno y se dejaron gelificar durante 15 minutos a 37 ° C. a continuación, se añadió medio regular en la parte superior del gel y se incubó durante 24 horas.

La transfección

Las células fueron transfectadas con siRNA contra HMGA2, GCN5, PCAF, p300 o controlar siRNA (50 nmoles) usando Nucleofector Kit R (Lonza), se dejó recuperar durante la noche y después se sembraron en geles de colágeno tridimensionales (2 mg /ml).

Immunoblotting

La inmunotransferencia se realizó como se describió anteriormente [5], [50]. Para las células cultivadas en el colágeno, la matriz se disolvió primero en colagenasa (Worthington Biológicos, Lakewood, NJ) y después se lisaron como se ha descrito previamente [6], [51].

formadoras de colonias ensayo

células CD18 en el plástico de cultivo de tejidos o en geles de colágeno tridimensionales fueron tratados con gemcitabina. Veinticuatro horas después, las células se trataron con tripsina o extraídas de colágeno, y luego se volvieron a sembrar en el plástico de cultivo de tejidos o en geles de colágeno tridimensionales a una densidad baja. Las células se fotografiaron 5 días más tarde y se contaron.

El análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad INSTAT (La Jolla, CA), utilizando el análisis de la prueba t o la prueba exacta de Fisher.

Apoyo a la Información
Figura S1.
Efecto de colágeno en 2D H3K9 histonas y acetilación de la histona H3K27.
A, B Opiniones. células Panc1 y CD18 se cultivaron en plástico de cultivo de tejidos o en el colágeno I-recubrieron placas de cultivo de tejido (BD BioCoat colágeno I) durante 24 horas. Las células se lisaron y se sometieron a inmunotransferencia para la histona H3K9ac y H3K27Ac utilizando α-tubulina como control de carga. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes
doi:. 10.1371 /journal.pone.0064566.s001 gratis (TIF)