Extracto
En trabajos anteriores, hemos demostrado que el factor de transcripción trim28 (motivo tripartita que contiene 28) juega un papel supresor tumoral en el adenocarcinoma-etapas temprana del pulmón debido a su capacidad para contener la transcripción del ciclo celular -regulating genes. En este documento se examina el papel de trim28 en la transición (EMT) epitelio-mesenquimal que está fuertemente implicada en la metástasis del cáncer. Se encontró que trim28 juega un papel en la EMT inducida por TGF-β en células de cáncer de pulmón de células no pequeñas. Silenciando trim28 con ARN inhibidores altera la expresión de numerosos marcadores de EMT, tales como E-cadherina y N-cadherina, mientras que la sobreexpresión de trim28 tiene un efecto contrario. expresión trim28 es inducida después del tratamiento de TGF-β en proteínas y los niveles de ARNm. deficiencia trim28 deteriora EMT inducida por TGF-β y disminuye la migración celular y la invasión. Por último, hemos demostrado que la expresión de trim28 afecta a la metilación y acetilación de las histonas en la E-cadherina y promotores N-cadherina. Estos resultados sugieren que trim28 contribuye a EMT y podría ser importante para la metástasis tumoral en el cáncer de pulmón. Tomados en conjunto con nuestros trabajos anteriores, estos resultados sugieren un modelo en el que trim28 es un supresor tumoral temprano en el proceso de transformación en el cáncer de pulmón, pero en etapas posteriores funciona como un oncogén
Visto:. Chen L, Muñoz- Antonia T, berro WD (2014) trim28 contribuye a la EMT a través del Reglamento de e-cadherina y N-cadherina en líneas celulares de cáncer de pulmón. PLoS ONE 9 (7): e101040. doi: 10.1371 /journal.pone.0101040
Editor: Olivier de Wever, Universidad de Gante, Bélgica
Recibido: December 11, 2013; Aceptado: June 3, 2014; Publicado: 1 de julio 2014
Derechos de Autor © 2014 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional del cáncer (CA119997 y CA163068) y el Centro de cáncer Moffitt. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La transición epitelio-mesenquimal (EMT) se caracteriza por una pérdida de adhesión célula-célula y la polaridad, baja regulación de marcadores epiteliales, y la adquisición de marcadores mesenquimales y fenotipo [1]. La acumulación de pruebas de investigaciones sobre EMT han implicado a muchas vías de señalización, incluyendo TGF-β, Notch, Wnt, EGF y FGF [2]. Entre estos, TGF-β induce EMT de manera eficiente en una variedad de líneas celulares modelo y
in vivo
[3]. Al igual que muchos otros procesos biológicos, EMT es en última instancia regulado transcripcionalmente por un número de factores de transcripción tales como Snail1, Snail2, ZEB1 y ZEB2 [4]. Además, los modificadores epigenéticos también han demostrado desempeñar un papel en la regulación de la EMT. Para ejemplos, histona deacetilasa Sirt1 induce EMT a través del factor de transcripción ZEB1 mientras que la histona metiltransferasa SUV39H1 y G9a reprimir la expresión de E-cadherina e inducir la EMT de manera Caracol dependiente [5], [6], [7].
trim28 es miembro de una familia evolutivamente conservada de transcripción co-factores que tienen diversas funciones [8]; incluyendo la regulación de la proliferación celular, la reparación del ADN, la diferenciación y la pluripotencia [9], [10], [11], [12]. Trim28 ha sido implicada específicamente en la activación de EMT en fibroblastos [13] y células de cáncer cervical [14]. Dependiendo de contexto, trim28 puede activar o reprimir la transcripción a través de distintos mecanismos [15], [16], [17], [18]. silenciamiento génico mediado por trim28 se ha demostrado que la participación de una asociación con SETDB1 histona metiltransferasa, histona deacetilasa NuRD compleja y la captación de regiones promotoras a través de la secuencia específica de factores de transcripción [19], [20]. Este complejo suprime la transcripción de genes diana mediante la alteración de las modificaciones de las histonas en promotores [8]. Cuando fosforilado en S824, trim28 se ha demostrado asociarse con factor de transcripción Oct3 /4 y activar Oct3 /4 genes diana transcripción [12]. Otro mecanismo de activación de la transcripción mediada por trim28 es a través de la contratación a elementos de respuesta específicos, como elemento de glucocorticoides sensibles (GRE) y el elemento de respuesta a Nur (Nure), por NGFI-B y C /EBPb, respectivamente [17], [18]. Estudios recientes han sugerido que trim28 podría desempeñar un papel en el desarrollo del cáncer y la metástasis [13], [14]. En concreto, la expresión trim28 está regulado en tejidos de cáncer en comparación con los tejidos normales [9], [21], [22], [23]. En una búsqueda de proteínas asociados a metástasis de cáncer de mama, trim28 fue identificado como uno de 197 proteínas con elevada expresión en los tejidos metastásicos [24].
En nuestro trabajo anterior [9], hemos descubierto que la alta trim28 (tripartita motivo que contiene 28) proteínas niveles se correlacionan con supervivencia global más larga en pacientes con adenocarcinoma de pulmón de etapas tempranas, pero no en pacientes-etapas finales. Esta observación nos sugiere que trim28 podría desempeñar un doble papel en el cáncer de pulmón. Especulamos que el papel en las etapas posteriores podría relacionarse con EMT [14]. Con el fin de probar esta hipótesis, hemos examinado el efecto del agotamiento trim28 mediada por shRNAi de EMT en líneas celulares de cáncer (A549 y H358). Se encontró que trim28 contribuye a EMT TGF-β-inducida, y que la alta trim28 favorece EMT lo que sugiere que trim28 podría ser un regulador de la metástasis tumoral, en particular en la última etapa de desarrollo del cáncer de pulmón.
Materiales y Métodos
las líneas celulares, plásmidos y reactivos
líneas celulares de cáncer de pulmón originales se obtuvieron de la ATCC. células A549 y H358 se cultivaron en RPMI 1640 con suero bovino fetal 10%. trim28 células deficientes en A549 (trim28 shRNA), A549 trim28-competente y células de control de líneas derivadas de manera similar se describieron anteriormente [9]. Se seleccionaron las células que expresan de forma estable H358 trim28 shRNA en 1 mg puromicina /ml. Se seleccionaron las células H358 que expresan establemente trim28 en 500 mg /ml G418. Los clones individuales fueron seleccionados para la expresión trim28. líneas celulares de control de manera similar derivadas-se generaron utilizando vectores vacíos. PcDNA-FLAG-HA-TIF1β y PRL-TK se describieron anteriormente [9]. pCS2-Myc-trim28 [25] y pGL3-E-cadherina [26] fueron los generosos regalos de Ryan Potts (UT Southwestern) y Jia colmillo (Moffitt Cancer Center), respectivamente. TGF-β se adquirió de I + amp; D Systems (240-B-002)
Análisis de Proteína
Westerns se realizaron como se describe anteriormente [27].. anticuerpos E-cadherina (# 3195S), N-cadherina (# 4061S), y β-tubulina (# 2128S) fueron adquiridos de Señalización Celular Tecnología. anticuerpo trim28 (A300-275A) era de Bethyl laboratorios. Bandera (F3165), β-actina (A5441), y los anticuerpos γ-tubulina (T6557) fueron de Sigma. Se realizaron ensayos de luciferasa como [9] se describe anteriormente. Las células se recogieron 48 horas después se determinó la actividad de transfección y luciferasa utilizando el Sistema Dual-Luciferase Assay Reporter (Promega) siguiendo el protocolo del fabricante. Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado biológica y todo se repitieron tres veces. Renilla luciferasa vector de PRL-TK se usa para controlar la eficiencia de transfección.
Q-RT-cuantitativa en tiempo real PCR
ARN celular total se cosechó utilizando el RNeasy Mini Kit (Qiagen) siguiendo el Instrucciones del fabricante. reacciones de transcripción inversa se realizaron utilizando iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). PCR en tiempo real se realizó utilizando Perfecta SYBR Green Supermix en un sistema de detección de PCR CFX96 en tiempo real. Los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla 1.
Microscopía de inmunofluorescencia
La inmunofluorescencia se realizó tal como se describe anteriormente [9]. Los anticuerpos primarios utilizados para la tinción eran de Señalización Celular Tecnología (anti-E-cadherina#3195S y anti-β-tubulina#2128S). AlexaFluor cabra 488-conjugado anti-conejo (Invitrogen) se utilizó como anticuerpo secundario. Las celdas eran imágenes por el Núcleo de Microscopía de Moffitt Cancer Center usando un microscopio confocal de barrido en tándem Leica SP5 AOBS invertida.
Se llevaron a cabo ensayos de inmunoprecipitación de cromatina
ensayos de chip como [9] se describe anteriormente. Los anticuerpos utilizados para la inmunoprecipitación incluyen IgG de conejo normal (12 a 370, Millipore), anti-acetil-histona H3K9 (07-352, Millipore), anti-histona H3 K9 trimetil (ab8898, Abcam) y anti-histona H3 dimetil K9 (ab1220 , Abcam). El ADN precipitado se purificó utilizando QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). PCR en tiempo real se realizó mediante SYBR Green Supermix Perfecta en un tiempo real, sistema de detección por PCR de Bio-Rad CFX96. Los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla 1.
ensayos de curación de heridas
Las células fueron sembradas en placas de 6 pocillos y cultivadas hasta & gt; 90% de confluencia. Tres heridas rectas estaban rayados en cada pocillo usando una punta de pipeta de 200 l estéril. Las células se lavaron suavemente con PBS y 2 ml de medio (sin FBS o que contiene 10% de FBS) añadido. Fotos fueron tomadas a 40 aumentos justo después de rascarse y otra vez después de 24 hrs y 48 hrs. Todos los ensayos se realizaron por triplicado y todos los experimentos repetidos tres veces.
Invasión ensayos
Invasión ensayos se realizaron en la cámara de BD BioCoat Matrigel Invasión (354480, BD Bioscences) siguiendo las instrucciones del fabricante. Específicamente, las células A549 se resuspendieron a 5 x 10
4 células /ml y se carga en los insertos de cámara (insertos de control o insertos recubiertos con Matrigel). Las células se incubaron a 37 ° C durante 22 horas y las células que habían migrado se lavaron, se fijaron con metanol, se tiñeron con 0,5% de cristal violeta y se contaron en tres campos microscópicos. La invasión por ciento se calculó dividiendo el número medio de células invasoras través de un inserto de Matrigel por el número medio de células que migran a través de un inserto de control. El índice de invasión se determinó comparando el porcentaje de invasión de las células desmontables trim28 con el porcentaje invasión de las células de control.
culturas esferoide multicelular tridimensionales
tridimensionales cultivos esferoides multicelulares se han creado de manera similar como se describe [28]. Brevemente, las células se resuspendieron en medio de crecimiento a una concentración de 5 × 10
Se han usado 6 células /ml, 30 l de la suspensión celular para hacer una gotita y 12 gotas se cargaron en la tapa de un tejido estéril 10-cm placa de cultivo. La tapa fue cuidadosamente volteado y se añadieron 20 l de medio de crecimiento a cada gota antes de ser colocado en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm que contiene 6 ml de medio de crecimiento y se incubaron durante la noche. El día siguiente, 20 l de medio se retiró de cada gotita y 20 l de medio fresco sin TGF-β o que contiene TGF-β (concentración final; 5 ng /ml) se añadió. Las células se incubaron durante 72 horas y se cosechan para la extracción de RNA.
El análisis estadístico
Los experimentos se realizaron por triplicado y se presentó como la media +/- SD. Los datos fueron analizados por
t-test de significación
de Student de dos colas.
P
los valores inferiores a 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos y representados por asteriscos en las figuras.
Resultados
altera la deficiencia trim28 la expresión de marcadores de EMT
Para abordar el papel de trim28 en A549 y no pequeñas líneas celulares de cáncer de pulmón de células H358, control y células deficientes trim28 se desarrollaron utilizando no silenciar shRNA como control y la orientación shRNA trim28. En primer lugar, se utilizó un anticuerpo E cadherina y la microscopía confocal para la imagen E-cadherina expresión en células A549 de control y en A549s trim28 deficientes. Higo. 1A demuestra que las células A549 de control expresan niveles relativamente bajos de E cadherina, mientras que las células con deficiencia de trim28 expresan una gran cantidad de E cadherina localizada en la membrana plasmática. Los niveles de β-tubulina no se vieron afectados por trim28-deficiencia. PCR en tiempo real se utilizó para examinar la expresión de marcadores de EMT adicionales en el control y A549s trim28 deficientes y las células H358. Como se muestra en la Fig. 1B, E-cadherina ARNm se incrementa, mientras que N-cadherina y Snail2 se redujeron en desmontables células trim28. En las células H358 (fig. 1B inferior) E-cadherina se incrementa mientras fibronectina, snail1, Snail2, y TWIST1 están disminuidos en desmontables células trim28. Western blots confirmaron que trim28 caída resultó en un incremento en la expresión de E-cadherina y una reducción en la expresión de N-cadherina a nivel de proteínas (Fig. 1C). La reducción de la proteína N-cadherina también fue evidente por microscopía confocal (ver Fig S1). Las respectivas correlaciones positivas entre la expresión y la expresión trim28 N-cadherina y la correlación negativa entre la expresión trim28 y la expresión de E-cadherina también son evidentes cuando una serie de líneas de células no manipuladas son examinados por Western Blot (véase la figura S2).
Un
, control y trim28 desmontables células A549 se tiñeron (como se describe en "Procedimientos experimentales") y se examinaron mediante microscopía confocal de inmunofluorescencia, de la siguiente manera: e-cadherina (verde, panel superior), β-tubulina ( panel verde, parte inferior), y DAPI (azul). las imágenes fusionadas están en la parte inferior de cada panel.
B
, extractos de ARN de control y trim28 A549 desmontables y H358 células fueron sometidas a PCR en tiempo real para determinar la expresión de los genes diana como se indica.
Los asteriscos representan importantes
valores de p
, *:
p Hotel & lt; 0,05.
C
, la expresión de marcadores de EMT E-cadherina y N-cadherina se midieron en el control y la caída trim28 A549 y H358 células por Western Blot.
trim28 sobreexpresión altera la expresión de marcadores de EMT
Desde el trabajo previo ha informado de que trim28 puede actuar como un factor de transcripción co-[16], [17], nos preguntamos si trim28 puede regular la actividad del promotor de la E-cadherina utilizando un constructo informador de luciferasa dirigido por el promotor de E-cadherina. Vector pcDNA vacío o pCS2-Myc-trim28 plásmidos se transfectaron en células A549 y H358 junto con un indicador de luciferasa promotor impulsado por E-cadherina y un reportero de control de transfección (PRL-TK Renilla luciferasa). Higo. 2A muestra que el promotor de E-cadherina se reprime de manera significativa por trim28 sobreexpresión en ambas líneas celulares. Para hacer frente a un mayor número de células marcadores A549 y H358 de forma estable que expresan trim28 fueron derivados junto con las líneas de control de manera similar derivadas de utilizando el vector vacío. Como era de esperar, la sobreexpresión trim28 dio lugar a niveles reducidos de E-cadherina expresión mientras que los niveles de N-cadherina se incrementaron (Fig. 2B). Resultados similares (Fig. 2C) se obtuvieron en el ARNm utilizando PCR en tiempo real. En conjunto, estos datos sugieren que trim28 puede promover la EMT en líneas celulares de cáncer de pulmón.
Un
, A549 y H358 se transfectaron por triplicado con E-cadherina promotor reportero luciferasa, reportero de PRL-TK, y plásmidos de expresión indicados en la figura. Las células se recogieron 48 horas después de la transfección para la determinación de los niveles de luciferasa.
B Opiniones, de control (pcDNA3) y Bandera-trim28 estable expresó A549 y H358 se analizaron las células para E-cadherina y N-cadherina niveles por Western Blot.
C
, extractos de ARN de control y trim28 A549 expresado de forma estable y H358 células fueron sometidas a PCR en tiempo real. Se determinó la expresión de genes diana.
Los asteriscos representan importantes
valores de p
, *:
p Hotel & lt; 0,05
trim28 expresión es inducida por el TGF-β
se sabe que la expresión trim28 y la señalización de TGF-β se incrementaron tanto en una variedad de cánceres incluyendo cáncer de pulmón [9], [23], [29]. Para determinar si estas observaciones están conectados en el cáncer de pulmón, hemos utilizado dos líneas celulares de cáncer de pulmón de células no pequeñas que se someten a la EMT en el tratamiento de TGF-β como modelos [30], [31]. Como puede verse en la figura 3A, los niveles de proteína trim28 se aumentan tras el tratamiento de TGF-β en ambas líneas celulares. Aunque el nivel basal de trim28 fue muy baja en las células trim28 caída, su expresión se indujo después de la incubación, sin embargo, TGF-β. PCR en tiempo real mostró el resultado similar en los niveles de mRNA (Figura 3B).
Un
y
B Opiniones, A549 y H358 expresan de forma estable no silenciar shRNA y trim28 shRNA fueron tratados con TGF-β (2 ng /ml) durante 3 a 10 días. Lisados de células enteras y extractos de ARN se sometieron a transferencia de Western usando los anticuerpos indicados (A) y PCR en tiempo real (B).
Los asteriscos representan importantes
valores de p
, *:
p Hotel & lt; 0,05
trim28 participa en EMT inducida por TGF-β
células tratadas TGF-beta se someterán a la EMT que puede ser caracterizado por los cambios morfológicos de células del guijarro-como a la forma de tipo huso [32]. Para determinar si se requiere trim28 para EMT inducida por TGF-β, se trataron las células de control desmontables y trim28 con TGF-β (2 ng /ml) y observamos el cambio morfológico en el tiempo. Higo. 4A demuestra que la adquisición de morfología mesenquimal en control H358 inducida por el TGF-β no se observó en las células trim28 desmontables bajo la misma condición que sugiere fuertemente que trim28 está involucrado en EMT inducida por TGF-β. El uso de PCR en tiempo real, se analizó el nivel de ARNm de E-cadherina y otros marcadores mesenquimales conocidos en el control de las células A549 y ajuste KD después del tratamiento de TGF-β. Aunque en desmontables células mesenquimales trim28 algunos genes muestran una ligera regulación, la inducción robusta de marcadores mesenquimales N-cadherina, fibronectina, vimentina, y TWIST1 causada por el tratamiento de TGF-β se atenuó significativamente (figura 4B). Western blot resultados (figura 4c) confirman que el TGF-β es capaz de reducir la E-cadherina y un máximo de regular la expresión de N-cadherina en las células de control, pero no lo hace en las células trim28 desmontables.
Una
, control y células trim28 desmontables fueron tratados con TGF-β o se dejan sin tratar. Las células se fotografiaron a 40 aumentos.
B
, el ARN se extrajo de control y las células A549 knockdown trim28 tratados con TGF-β como anteriormente o no se tratan. PCR en tiempo real se llevó a cabo y se determinó la expresión de genes diana.
C
, las células de control y trim28 A549 desmontables y H358 se trataron con TGF-β (2 ng /ml) hasta que se observaron o se dejan sin tratar cambios en la morfología. lisados de células enteras fueron sometidos a Western Blot utilizando anticuerpos tal como se indica.
El agotamiento de trim28 reduce la migración celular y la invasión
El papel de trim28 en la migración celular y la invasión fue evaluada por wound- ensayo de la curación y el ensayo transwell invasión basada en Matrigel. En nuestros estudios anteriores, se encontró que trim28 afecta a la proliferación celular en células A549, pero no de manera significativa en células H358 (datos no publicados y [9]). En este documento, se utilizó el medio de cultivo con o sin FBS para excluir la contribución de la proliferación celular en la determinación de la migración de las células A549. células trim28 desmontables mostraron menos cierre de la herida que las células de control (figura 5A y 5B) con o sin suero. Además, el ensayo Transwell invasión basada en Matrigel mostró que trim28 la invasión de células desmontables inhibido de células A549 (Fig.5C).
Un
, control y trim28 desmontables H358 células fueron sometidas a la herida -healing ensayo. Las células fueron fotografiados después de cero, y 24 horas y 48 horas después de cero.
B
, el control y las células A549 knockdown trim28 fueron sometidos a ensayo de heridas de curación en la ausencia o presencia de suero. Las células fueron fotografiados después de cero y 24 horas más tarde.
C
, control y células trim28 desmontables se sembraron por triplicado en los pocillos superiores de cámaras recubiertas con Matrigel o no recubiertos. Después de 18 horas, las células que habían invadido a través de la capa de Matrigel se fijaron y se tiñeron. El porcentaje de células invasivas se muestra en el gráfico de barras.
Los asteriscos representan importantes
valores de p
, *:
p Hotel & lt; 0,05.
D
, el control y las células A549 trim28 desmontables se cultivaron en un modelo en tres dimensiones y se trató con TGF-β (5 ng /ml) durante 72 hrs. El ARN se extrajo de las células y se sometió a PCR en tiempo real. Se determinó la expresión de genes diana.
cultivos celulares tridimensionales se ha demostrado que someterse a EMT más eficientemente que las células en monocapa [28]. Para examinar si trim28 caída reprime EMT en un modelo tridimensional, sembramos control y trim28 desmontables células A549 en las tapas de placa de cultivo p100 y les permite formar gotas que cuelgan como se describe en
Materiales y Métodos
. Después de 72 horas en la presencia de TGF-β, se recogieron las células y el ARN extraídos para análisis en tiempo real PCR de marcadores de EMT. Higo. 4B revela que después del tratamiento de TGF-β la expresión de vimentina, Snail1, y Snail2 en las células A549 de control cambia más dramáticamente (6-10 veces) en el modelo 3D (Fig. 5D) que los de las monocapas (1.5 a 2.5 veces). Sin embargo, estos marcadores de EMT no fueron reguladas en las células trim28 desmontables después del tratamiento de TGF-β. En conjunto, estos resultados apoyan nuestra conclusión de que trim28 es un regulador de la EMT.
trim28 altera la histona 3 modificaciones en E-cadherina y promotores N-cadherina
trim28 se ha demostrado para regular la expresión génica a través de modificación de las histonas de promotores de genes diana [8]. socios conocidos de trim28 incluyen SETDB1 [19], una histona 3 lisina metiltransferasa y las histonas desacetilasas 9-específicas, tales como HDAC1 [8]. En nuestro trabajo anterior, se encontró que trim28 caída aumenta la histona 3 lisina 9 de la acetilación de ciertos promotores diana [9]. En este documento, hemos explorado si trim28 afecta a la histona 3 modificación de los E-cadherina y N-cadherina promotores. Se emplearon ensayos de chip y se utilizaron anticuerpos IgG, acetil-H3K9, dimetil-H3K9 y trimetil H3K9. Como se muestra en la Fig. 6A, las células deficientes en trim28, acetilación se incrementa mientras que la metilación de histonas se reduce en 3 lisina 9 del promotor de la E-cadherina en comparación con las células control shRNA. Se observó un efecto contrario en la N-cadherina en las mismas células.
Un
, ensayos de chip se llevaron a cabo en el control y células A549 caída trim28. PCR cuantitativa se realizó para examinar la ocupación de IgG, acetilado histona 3 K9, dimethylated histona 3 K9, y trimethylated histona 3 K9 de E-cadherina y promotores N-cadherina. B, ensayos de chip se llevaron a cabo en el control y células A549 trim28 expresados de forma estable. PCR cuantitativa se realizó para examinar la ocupación de IgG, acetilado histona 3 K9, dimethylated histona 3 K9, y trimetilada histona 3 K9 en E-cadherina y N-cadherina promotores.
Además, para demostrar si trim28 sobreexpresión puede afectar a los e-cadherina y N-cadherina promotores, se utilizó el control pcDNA3 y las células A549 trim28 con dominio y chip de ensayo realizado. En la Fig. 6B, al contrario de los resultados observados en las células trim28 caída, la acetilación de la histona H3K9 se disminuye y la metilación se aumenta en las células trim28-dominio. En promotor N-cadherina, la acetilación de la histona H3K9 3 se incrementa y la metilación se disminuye. En total, estos resultados indican que trim28 altera E-cadherina y la expresión de N-cadherina (al menos en parte) por modificación de las histonas que a su vez regulan su transcripción.
Discusión
Hemos demostrado que puede trim28 afectar a la modificación post-traduccional de la histona 3 en e-cadherina y promotores N-cadherina. En este punto no hemos elucidado los mecanismos específicos implicados. Trim28 puede mediar estas modificaciones directa o indirectamente. El mecanismo directo implicaría modificadores de histonas asociadas a trim28 trim28 y siendo reclutados para cadherina promotores de EMT-regulan los factores de transcripción. Trim28 se ha demostrado que se unen y regular muchos factores de transcripción de este modo [16], [19], [33]. cebadores Sin embargo, hemos diseñado dirigidas a la -2 kb a +0,5 kb de E-cadherina y N-cadherina promotores y no lograron detectar una región de unión trim28 por chip de ensayo (observaciones no publicadas). Otra posibilidad es que trim28 regula la expresión de factores de transcripción relacionados con la EMT que regularán más genes de la EMT. Los factores de transcripción que pueden residir directamente en promotor de E-cadherina incluyen Snail1, Snail2, ZEB1, ZEB2, TWIST1 y FOXC2 [4]. En nuestro estudio, se encontró que la expresión de muchos factores de transcripción se cambia con trim28 sobreexpresión o deficiencia que proporciona evidencia para apoyar la posibilidad. Otras investigaciones se exploran este mecanismo.
El componente más notable de nuestro trabajo aquí descrito es que trim28 influye EMT TGF-β-inducida en el cáncer de pulmón a través de la regulación transcripcional de múltiples marcadores epiteliales y mesenquimales. Ratón knockout condicional estudios han indicado claramente que trim28 y miembro de la familia relacionados pueden comportarse como supresores de tumores [34]; sin embargo, otros estudios indican que trim28 tiene niveles elevados y efectos oncogénicos en una variedad de tipos de cáncer [21], [35]. Proponemos el modelo que se muestra en la Fig. 7 para explicar el doble papel de trim28 en el desarrollo del cáncer de pulmón y metástasis. Nuestra hipótesis es que trim28, mediante la regulación de múltiples vías alternativas puede tener tanto supresor de tumores oncogénicos y actividades al igual que la vía de señalización de TGF-β se sabe que juega un papel complejo de la tumorigénesis. Por un lado, el TGF-β1 regula negativamente el ciclo celular y sirve como un supresor de tumores en tejidos normales y pre-malignment. Por otra parte, TGF-β, secretada por las células tumorales, promueve la invasión tumoral y la metástasis [36]. Proponemos que trim28 contribuye de manera significativa a la capacidad del TGF-β para frenar el crecimiento celular y para TGF-β1 para inducir EMT. Estas posibilidades no son mutuamente excluyentes y esta red puede ser aún más complejo cuando se consideran las etapas y tipos de cáncer. Como se muestra en la Figura 7, en los tejidos normales y los cánceres en etapa temprana, trim28 es responsable de la regulación del ciclo celular a través de factores de transcripción E2F y HDACs; Por lo tanto, trim28 muestra una función de anti-proliferativa y actúa como un supresor de tumor. En el estadio o metastásicos cánceres finales, alto nivel de trim28 contribuir a EMT a través de regulación de la transcripción de genes epiteliales y mesenquimales, como resultado, las células con alto nivel de trim28 tienden a tener un carácter más invasivo y metastásico. Este modelo se apoya en informes en la literatura [13], [24] y nuestros resultados [9]. Nuestros resultados pueden arrojar luz hacia la comprensión de la doble función de señalización de TGF-β en los tumores.
Este modelo explica este trabajo y nuestro trabajo previo que demuestra un papel supresor de tumores para trim28 [9].
Apoyo a la Información
Figura S1. La deficiencia de
trim28 reduce la expresión de N -cadherin.
C ontrol
y se tiñeron las células A549 caída trim28 (como se describe en "Procedimientos Experimentales") y se examinaron utilizando microscopía confocal de inmunofluorescencia, de la siguiente manera: N-cadherina (verde, panel superior), β-tubulina (verde, panel inferior), y DAPI (azul). las imágenes fusionadas están en la parte inferior
doi:. 10.1371 /journal.pone.0101040.s001 gratis (TIF)
figura S2.
trim28 muestran la expresión de correlación negativa con la expresión de cadherina E y correlación positiva con la expresión de N-cadherina en una serie de pequeñas líneas de cáncer de pulmón no de células. A, lisados de células enteras se sometieron a transferencia de Western usando los anticuerpos indicados. B, intensidades de las bandas se cuantificaron y se representa en una escala logarítmica. Las correlaciones no son estadísticamente significativas
doi:. 10.1371 /journal.pone.0101040.s002 gratis (TIF)