Extracto
El cáncer de próstata es la neoplasia maligna más común en los hombres. En el presente estudio, LNCaP (células de cáncer de próstata humano sensibles a los andrógenos) y células (células de cáncer de próstata humano independiente de andrógenos) PC-3 se utilizaron para investigar los efectos anticancerígenos de la radiación ionizante (IR) combinado con trióxido de arsénico (ATO ) y para determinar los mecanismos que subyacen a
in vitro
y
in vivo
. Se encontró que el IR combinado con ATO aumenta la eficacia terapéutica en comparación con los tratamientos individuales en LNCaP y PC-3 células de cáncer de próstata humano. Además, el tratamiento combinado mostraron una mayor generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) en comparación con el tratamiento con ATO o IR solo en células PC-3. El tratamiento combinado inducida autofagia y la apoptosis en las células LNCaP, e inducido principalmente autofagia en células PC-3. La muerte de las células que fue inducida por el tratamiento combinado fue principalmente el resultado de la inhibición de las vías de señalización Akt /mTOR. Además, hemos encontrado que el tratamiento combinado de las células tratadas previamente con 3-MA resultó en un cambio significativo en las células AO-positivas y citotoxicidad. En un
in vivo
estudio, el tratamiento combinado tuvo efectos sobre el crecimiento antitumorales. Estos nuevos hallazgos sugieren que el tratamiento combinado es una estrategia terapéutica potencial no sólo para el cáncer de próstata andrógeno-dependientes, sino también para el cáncer de próstata independiente de andrógenos
Visto:. Chiu HW, Chen YA, Ho SY, Wang YJ (2012 ) trióxido de arsénico Mejora la sensibilidad a la radiación de las células dependientes de andrógenos y cáncer de próstata Independiente‖ humano. PLoS ONE 7 (2): e31579. doi: 10.1371 /journal.pone.0031579
Editor: Eric J. Bernhard, Instituto Nacional del Cáncer, Estados Unidos de América
Recibido: 29 Noviembre 2011; Aceptado: 9 Enero 2012; Publicado: 20 Febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Chiu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia, Taiwán (NSC 98-2314-B-006-034-MY2) y el hospital cristiano Sinlau, Tainan, Taiwán. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata representa un problema de salud importante para los hombres en todo el mundo. Estudios previos han demostrado que se requiere la activación de los receptores de andrógenos (AR) por los andrógenos para el crecimiento y la supervivencia de células de cáncer de próstata. Además, la mayoría de los tumores de próstata son dependientes de andrógenos en el principio [1]. Sin embargo, con el tiempo, el tumor se repite de una manera andrógeno-refractario y presente con un fenotipo más agresivo y metastásico, que es resistente a la manipulación adicional hormonal [2]. Debido a que los andrógenos juegan un papel importante en el crecimiento y supervivencia de las células de cáncer de próstata, la evidencia creciente sugiere un papel importante para Akt en el desarrollo de enfermedad de la próstata independiente de hormonas [3], [4], [5]. La inhibición de Akt en células de la próstata abroga HER-2 /neu inducida por la señalización de AR y la supervivencia celular /efectos de crecimiento en ausencia o presencia de andrógenos [4]. Además, la progresión exitosa a un estado independiente de andrógenos requiere la señalización de PI3K intacta [6]. Por lo tanto, la inhibición de la vía Akt está emergiendo como un objetivo clínico atractivo para la prevención de la enfermedad refractaria a las hormonas.
En la actualidad existe abundante evidencia que respalda los beneficios de altas dosis de radioterapia de haz externo en pacientes con clínicamente localizado cáncer de próstata [7]. Sin embargo, altas dosis de radioterapia causa considerables daños colaterales a las poblaciones de células normales en el sitio de tratamiento [8]. Por lo tanto, el uso de modificadores químicos como radiosensibilizadores en combinación con la irradiación de baja dosis puede aumentar la eficacia terapéutica global. El arsénico ha sido utilizado como agente contra el cáncer en la medicina tradicional china [9]. Recientemente trióxido de arsénico (ATO) se ha empleado con éxito en el tratamiento de la leucemia promielocítica aguda refractario o recidivante (APL), y su eficacia se ha confirmado incluso en pacientes resistentes a la quimioterapia convencional [10]. Estudios previos han demostrado también que la combinación de ATO y la radiación ionizante (IR) es probable que sea la estrategia más eficaz para la leucemia y tumores sólidos [11], [12], [13]. ATO podría servir como un sensibilizador a la radiación potente y puede aumentar la tasa de curación de las células malignas. Sin embargo, los efectos y el mecanismo preciso de tratamiento combinado de ATO y IR contra el cáncer de próstata no están claros.
autofagia es uno de los mecanismos de tolerancia al estrés que mantiene la viabilidad celular y pueden conducir a la latencia del tumor, la progresión y terapéutico resistencia. Sin embargo, muchos medicamentos contra el cáncer también podrían inducir la autofagia excesiva o prolongada que desencadena la muerte celular del tumor. Se están realizando estudios para definir las estrategias óptimas para modular la autofagia para la prevención y el tratamiento del cáncer y de explotar la autofagia como un objetivo para el descubrimiento de fármacos contra el cáncer [14]. Un número de conexiones se produce aguas arriba de la maquinaria apoptótica y autofágica, donde las vías de señalización regulan ambos procesos. La activación de la PI3 quinasa /Akt, un método bien conocido para inhibir la apoptosis, también inhibe la autofagia [15]. Akt es una proteína serina /treonina quinasa que desempeña un papel crítico en la supresión de la apoptosis mediante la regulación de sus vías aguas abajo [16]. Akt también fosforila mamíferos objetivo de rapamicina (mTOR), que se ha informado para inhibir la inducción de la autofagia [17]. Tanto la apoptosis y la autofagia puede ser inducida en ciertas células tumorales en el marco del tratamiento de fármacos contra el cáncer [18], [19].
La atorvastatina induce la autofagia en el receptor de andrógenos cáncer de próstata negativa PC-3 células a través de la activación de LC3 transcripción [20]. Además, un estudio reciente ha indicado también que un mimético de BH3 naturales ((-) - gosipol) induce la autofagia en el cáncer de próstata resistente a la apoptosis mediante la modulación de la interacción Bcl-2-Beclin1 en el retículo endoplasmático [21]. células de cáncer de próstata independiente de andrógenos con niveles más elevados de Bcl-2 fueron más resistentes a la apoptosis inducida por gosipol - (-). Sin embargo, (-) - gosipol indujo niveles similares de la muerte celular total tanto en células dependientes de andrógenos y -independiente; mató células de andrógenos principalmente a través de la apoptosis, pero en las células independientes de andrógenos, el modo de muerte celular no se entiende completamente [21]. Recientemente, se demostró que la ATO o IR también puede autofagia inducida, pero no la apoptosis en las células del cáncer [22], [23].
En el presente estudio, LNCaP (células de cáncer de próstata humano sensibles a los andrógenos) y PC se utilizaron -3 células (células de cáncer de próstata humano independiente de andrógenos) para investigar los efectos anticancerígenos de infrarrojos combinado con ATO. Se examinaron los tipos de muerte celular inducida por IR combinado con ATO. También se investigaron los posibles mecanismos de apoptosis o la autofagia subyacentes en LNCaP y células PC-3 inducida por IR y /o ATO.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y tratamiento de drogas
las líneas celulares de cáncer de próstata humano LNCaP (ATCC CRL-1740) y PC-3 (ATCC CRL-1435) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco BRL, Grand Island, NY) que fue suplementado con antibióticos que contiene 100 suero U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina (Gibco BRL, Grand Island, NY), y 10% fetal bovino (Hyclone, Logan Sur, UT, EE.UU.) .Cells se incubaron en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2 a 37 ° C. Células en crecimiento exponencial fueron separadas con 0,05% de tripsina-EDTA (Gibco BRL, Grand Island, NY) en medio RPMI 1640. Para la exposición al trióxido de arsénico (Sigma Chemical Co.), 1 mM de soluciones madre se prepararon antes de cada experimento y se esterilizan-filtro utilizando un filtro de jeringa de 0,2-m. El reactivo se añadió en una forma concentrada al medio de cultivo y se mezcló suavemente. Los cultivos se incubaron posteriormente durante los tiempos indicados en las figuras.
El tratamiento con irradiación y la viabilidad de las células de ensayo
IR se realizó con 6 MV rayos X usando un acelerador lineal (Digital M Mevatron Acelerador , Siemens Medical Systems, CA, EE.UU.) a una dosis de 5 Gy /min. Un 2 cm adicionales de bolo equivalente a tejido se colocó en la parte superior de un frasco de cultivo de tejidos de plástico para asegurar el equilibrio electrónica, y 10 cm de material equivalente a tejido se colocó bajo el matraz para obtener la plena retrodispersión. Las células tratadas se centrifugaron y se resuspendieron en 0,1 ml de PBS. Cada suspensión de células (0,02 ml) se mezcló con 0,02 ml de solución de azul de tripano (0,2% en PBS). Después de 1 o 2 minutos, cada solución se puso en un hemocitómetro, y las células teñidas de azul se contaron como no intacta.
ensayo clonogénico
Las células se irradiaron con 2, 4 o 6 Gy . ATO se añadió a las células a concentraciones de 2 a 5 micras. Las células se trataron con tripsina y se contaron. un número conocido de células se volvieron a sembrar posteriormente en placas de cultivo de 6 cm y se devolvieron a la incubadora para permitir el desarrollo de la colonia. Después de siete días, las colonias que contienen (≥ 50 células) se tiñeron con una solución de cristal violeta 0,5% para 30 min. Plating eficiencia (PE) es la relación entre el número de colonias con el número de células sembradas en el grupo no irradiado. Cálculo de fracciones de supervivencia (FE) se realizó utilizando la ecuación:. SF = contaron las colonias (células sembradas × PE) /, teniendo en cuenta la
individual del PE
Determinación de apoptosis temprana
La apoptosis fue evaluado mediante la observación de la translocación de la fosfatidil serina en la superficie celular, tal como se detecta con un kit de detección de apoptosis con anexina V (Calbiochem, San Diego, CA, EE.UU.), de acuerdo con nuestro informe anterior [13].
Medición de ROS producción
especies reactivas de oxígeno (ROS) se controló mediante citometría de flujo utilizando diacetato de 2,7-dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA), como se describe anteriormente [24]. Después del tratamiento con IR y /o ATO, las células se incubaron con 20 M de DCFH-DA para 30 min. Se recogieron las células, se lavaron una vez y se resuspendieron en PBS. La fluorescencia se controló usando un citómetro de flujo.
tinción de células supravital con naranja de acridina para la detección de la autofagia
tinción de las células con naranja de acridina (Sigma Chemical Co.) se realizó de acuerdo con los procedimientos publicados [13]. Las células se pre-tratados con inhibidores de la autofagia 3-metiladenina (3-MA) (Sigma Chemical Co.) a una concentración final de 1 mM durante 1 hora antes del tratamiento IR.
Microscopía electrónica
Las células se fijaron con una solución que contiene 2,5% de glutaraldehído, más 2% de paraformaldehído en tampón de cacodilato 0,1 M, pH 7,3, durante 1 hora. Después de la fijación, las muestras se fijaron posteriormente en 1% OSO
4 en el mismo tampón durante 30 min. secciones ultrafinas se observaron posteriormente con un microscopio electrónico de transmisión (JEOL JEM-1200EX, Japón) a 100 kV.
Análisis de transferencia Western
Total de proteína lisados celulares se preparan cultivando las células en proteínas tampón de extracción durante 1 hora a 4 ° C, como se describe anteriormente [12]. Las densidades de las bandas se cuantificaron con un densitómetro ordenador (AlphaImager ™ 2200 Sistema Alfa Innotech Corporation, San Leandro, CA, EE.UU.). La expresión de GAPDH se utilizó como control de carga de proteínas. Los anticuerpos para la detección de Akt, fosfo-Akt, fosfo-mTOR, fosfo-p70S6K, ERK, fosfo-ERK, fosfo-PDK1, PDK1, JNK, p38, fosfo-p38, Beclin 1, Bax y Bcl-2 se obtuvieron a partir de la célula Tecnología de señalización (Ipswich, MA, EE.UU.); anti-GAPDH se obtuvo de Abcam (Cambridge, MA, EE.UU.); LC3, ATG5 y Atg5-12 se obtuvieron de Abgent (San Diego, CA, EE.UU.); anti-p62 /SQSTM1 anticuerpo se obtuvo de MBL (Nagoya, Japón); anti-poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) de anticuerpos se obtuvo de Millipore (Billerica, MA, EE.UU.); mTOR, p70S6K, fosfato JNK, caspasa-3 y se escindió-caspasa-3 se obtuvieron de Epitomics (Burlingame, CA, EE.UU.).
In vivo
ensayos de crecimiento tumoral utilizando el PC- 3 modelo de tumor en ratones desnudos
Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de nuestro instituto (la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio, Universidad Nacional Cheng Kung). El protocolo de uso animal que se enumeran a continuación ha sido revisado y aprobado por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) (Número de Registro: 99138). De seis a ocho semanas de edad ratones desnudos macho (BALB /cAnN.Cg-Foxn1
nu /CrlNarl) fueron adquiridos de Laboratorio Centro Nacional de Animales (Taiwán). Los animales se alojaron de cinco por jaula a 24 ± 2 ° C y 50% ± 10% de humedad relativa y se sometieron a un /12-h ciclo de oscuridad de 12 h de luz. Los animales se aclimataron durante 1 semana antes del inicio de los experimentos y se alimentaron con una dieta de pienso Purina y agua ad libitum. Los tumores se indujeron por inyección subcutánea (s.c.) de células PC-3 (2 × 10
6 células en 0,1 ml de PBS) en un sitio del flanco derecho. Tumores (visualizados como pequeños nódulos en los sitios de inyección) aparecieron ~ 7 días después de la inyección, y los animales se distribuyeron al azar en cada grupo. Los ratones se trataron con: (1) vehículo (PBS), (2) 6 mg /kg ATO tres veces por semana durante dos semanas (en días 0, 2, 4, 7, 9 y 11), (3) una sola dosis de 6 Gy IR, o (4) un tratamiento de combinación que consiste de 6 mg /kg ATO tres veces por semana durante dos semanas empezó justo después de una sola dosis de 6 Gy IR. los pesos corporales de ratón se midieron una vez por semana y se utilizaron como un indicador de la toxicidad sistémica del tratamiento. El crecimiento del tumor se midió cada dos días, y se calculó el volumen del tumor según la fórmula que se muestra a continuación [25]: Los datos se expresan como el volumen relativo del tumor en comparación con el volumen de pretratamiento medido en el día 0. El tiempo de volumen del tumor cuadruplicando (TVQT, en días) se determinó mediante un análisis de regresión de mejor ajuste. El tiempo de retardo del crecimiento tumoral (TGD) se define como la diferencia entre el TVQT de los tumores tratados en comparación con el de los tumores de control no tratados. El tiempo de TVQT y TGD se calcularon para cada ratón individual y un promedio para cada grupo. tasa de inhibición del crecimiento del tumor se calculó como sigue:. Inhibición (%) = (media del volumen del tumor del volumen de control de ratones de tumor sin tratar de los ratones tratados) /significa el volumen del tumor de los ratones de control no tratados × 100
inmunohistoquímica (IHC) análisis de la tinción de secciones de tejido
embebidos en parafina-4 (M) se secaron, se deparaffinized, y rehidratada. Después del pretratamiento de microondas en tampón de citrato (pH 6,0; para la recuperación de antígeno), los portaobjetos se sumergieron en peróxido de hidrógeno al 3% durante 20 minutos para bloquear la actividad de peroxidasa endógena. Después del lavado intensivo con PBS, los portaobjetos se incubaron durante la noche a 4ºC anticuerpos con la LC3 (MBL, Japón), PCNA (Grupo ProteinTec, Inc., Chicago, EE.UU.) y ATG5 (Abgent, San Diego, CA, EE.UU.). Las secciones se incubaron con un anticuerpo secundario durante 1 hr a temperatura ambiente, y los portaobjetos se desarrollaron con el kit de detección STARR TREK universal HRP (Biocare médica, Concord, CA). Por último, las diapositivas se counterstained con hematoxilina. Cada diapositiva se escaneó a baja potencia (x200).
El análisis estadístico
Los datos se expresan como la media ± desviación estándar. La significación estadística se determinó usando la prueba t de Student para la comparación entre el medio o en un solo sentido el análisis de varianza con la prueba de Dunnett post hoc [26]. Las diferencias se consideraron significativas cuando p. & Lt; 0,05
Resultados
dosis óptima y la selección de tiempo de IR y ATO para el tratamiento de células LNCaP y PC-3
La viabilidad de LNCaP y células PC-3 se observó a diferentes dosis de IR (0-8 Gy) para 6, 12, 18, 24 y 48 horas (Fig. 1A). El tratamiento con IR sola redujo la viabilidad de la células LNCaP y PC-3 de una manera dependiente de la dosis. Además, se observó la viabilidad de las células a diferentes concentraciones de ATO (0 a 15 mM) para 12, 24, 36 y 48 horas (Fig. 1B). ATO sola redujo la viabilidad de las células de una manera dependiente de la concentración. Después del tratamiento con ATO 5 mM durante 48 horas, la viabilidad de las células LNCaP y PC-3 se redujo a 60% y 73%, respectivamente. La Figura 1C muestra la viabilidad de ATO y IR tratado solo o en combinación en LNCaP y células PC-3. De manera significativa se encontró toxicidad mejorada para el tratamiento de combinación en comparación con la OAM y el tratamiento IR solo en células LNCaP y PC-3. Figuras 1D muestra las curvas de radiación de dosis-respuesta de supervivencia de LNCaP y células PC-3 con o sin tratamiento ATO. Las curvas de supervivencia cambiaron drásticamente a la baja. ATO (2 M) aumentó la muerte celular inducida clonogénico-IR en LNCaP y células PC-3. ATO redujo significativamente la fracción de supervivencia de una manera dependiente de la dosis en comparación con IR solo.
(A) el curso temporal y dependiente de la dosis efectos de IR sobre la viabilidad de LNCaP y células PC-3. Las células se trataron con 2, 4, 6 o 8 Gy de IR para 6, 12, 18, 24 y 48 hrs. (B) El curso temporal y los efectos dependientes de la concentración de ATO en la viabilidad de las células LNCaP y PC-3. Las células se trataron con 2, 5, 10 o 15 M de ATO para 12, 24, 36 y 48 hrs. (C) Los efectos citotóxicos de células tratadas con IR (4 Gy) y ATO (5 M). (D) La radiación de dosis-respuesta curvas de supervivencia de las células LNCaP y PC-3 con o sin ATO. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes.
Medición de la apoptosis en células LNCaP y PC-3 se trata con ATO e IR solo o en combinación
La inducción de muerte celular por apoptosis es un mecanismo importante de células tumorales bajo la influencia de radio- /quimioterapia [27]. Como se muestra en la Figura 2A, la apoptosis temprana en células LNCaP y PC-3 se midió por citometría de flujo con el kit de detección de apoptosis con anexina V. Los resultados cuantitativos mostraron que el tratamiento de combinación indujo la muerte celular apoptótica más que el tratamiento solo con la ATO o IR en las células LNCaP. Por el contrario, la aparición de apoptosis temprana en las células PC-3 se trató con ATO y /o IR fue baja (menos de 10%). la generación de ROS fue evaluado por citometría de flujo. Se encontró un aumento de aproximadamente 3,5 veces en los niveles de peróxido intracelular cuando las células PC-3 se expusieron al tratamiento de combinación para 1 hr (Figs. 2B, 2C). La figura 2D muestra el análisis Western blot de poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP), caspasa-3, y Bcl-2. La escisión de PARP por caspasa-3 activada como resultado la formación de un fragmento de 85 kDa C-terminal. Nuestros resultados muestran que la escisión específica de PARP y la caspasa-3 se puede encontrar en las células tratadas con IR, solo o en combinación, en las células LNCaP ATO. También se analizó el nivel de expresión de Bcl-2, que es un supresor de la muerte celular programada, y se encontró que las proteínas Bcl-2 se redujo cuando son tratados con IR solo y el tratamiento combinado tanto en las células.
(A ) de detección de apoptosis temprana se midió por citometría de flujo con un kit de detección de apoptosis con anexina V. Las células fueron tratadas con IR (4 Gy) y ATO (5 M) durante 48 hrs. #,
p Hotel & lt; 0,05, IR versus tratamiento combinado. *,
p Hotel & lt; 0,05, ATO frente al tratamiento combinado. (B) (C) ROS generación en las células PC-3 tratados con ATO 5 M o 4 Gy IR sola o en combinación para 30, 60, 120 min y con DCFH-DA para un 30 min adicionales. La fluorescencia en las células se ensayó inmediatamente usando citometría de flujo. #,
p Hotel & lt; 0,05, IR versus tratamiento combinado. *,
p Hotel & lt; 0,05, ATO frente al tratamiento combinado. (D) de Western Blot de la PARP, escindido con PARP, pro-caspasa 3, caspasa-escindido 3y Bcl-2. El nivel de proteína total GAPDH se utilizó como control de carga. Las células fueron tratadas con IR (4 Gy) y ATO (5 M) durante 48 hrs. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes.
Medición de la autofagia en las células LNCaP y PC-3 se trata con ATO e IR solo o en combinación
La autofagia es caracterizado por la formación de numerosas vesículas ácidas, que se denominan orgánulos vesiculares ácidos (avos) [23]. Se observaron fotomicrografías de objetos AVO a través de la fluorescencia verde y rojo en el naranja de acridina (AO) células teñidas con un microscopio de fluorescencia (Fig. 3A). El tratamiento combinado reveló un aumento significativo de objetos AVO en comparación con grupos de control en LNCaP y células PC-3. Los ultraestructuras de las células PC-3 para cada grupo de tratamiento se observaron por EM fotomicrografía (Fig. 3B). El tratamiento combinado también dio lugar a un gran número de vacuolas autofágicas y autolisosomas en el citoplasma. Además, no había ninguna condensación de la cromatina o picnosis nuclear, que son característicos de la apoptosis, en cualquiera de las células tratadas. Por otra parte, la tinción AO se cuantificó mediante citometría de flujo (Fig. 3C, 3D). Un aumento significativo en las células AO-positivos se encontró para las células que reciben el tratamiento combinado en comparación con los tratados con IR o ATO solo en ambas células. Para detectar la expresión de proteínas relacionadas con la autofagia, se realizó la transferencia Western con lisados de LNCaP y células PC-3 que reciben cada uno de los diferentes tratamientos (Fig. 3E, 3F). Los niveles de expresión de la LC3-II, p62, las proteínas ATG5 y Atg5-12 aumentaron con el tratamiento combinado tanto en las células. La autofagia inducida por el tratamiento combinado en LNCaP y células PC-3.
(A) Microfotografía de AVO en LNCaP y células PC-3. La detección de la fluorescencia verde y rojo en el naranja de acridina (AO) células teñidas se realizó con un microscopio de fluorescencia. El
flechas blancas
punto de AVO. (B) microfotografías EM de células PC-3 tratados con IR (4 Gy) y ATO (5 M) durante 48 hrs. El
flechas blancas
punto de autofagia vacuolas y autolisosomas. (C) Desarrollo de AVO en LNCaP y células PC-3. La detección de la fluorescencia verde y roja en las células teñidas con AO utilizando citometría de flujo. (D) La cuantificación de objetos AVO con células teñidas-AO tratados con IR (4 Gy) o ATO (5 M) solo o en combinación con citometría de flujo. Los datos se presentan como la desviación estándar media ± a partir de tres experimentos independientes. #,
p Hotel & lt; 0,05, IR versus tratamiento combinado. *,
p Hotel & lt; 0,05, ATO frente al tratamiento combinado. (E) (F) transferencia de Western de LC3-I, LC3-II, p62 /SQSTM1, ATG5 y expresión Atg5-12 en LNCaP y células PC-3. Las células fueron tratadas con IR (4 Gy) y ATO (5 M) durante 48 hrs.
PI3K vía de señalización /Akt está involucrado en la muerte celular inducida por el tratamiento combinado y las células se someten tanto las células apoptóticas y autophagic cuando se expone a la muerte IR y ATO en las células LNCaP y PC-3
para investigar si la vía PI3K /Akt vía de señalización estuvo involucrado en la muerte celular inducida por el tratamiento combinado, se realizó el Western Blot para detectar el estado de fosforilación de proteínas ( Figs. 4A, 4B). proteínas fosforiladas que están relacionados con la PI3K /Akt también se examinaron las vías de señalización. Los resultados muestran que la fosforilación de Akt, mTOR, p70S6K y PDK1 disminuyó en las células tratadas con el tratamiento combinado en comparación con el control. A continuación, se investigó si la inhibición de la autofagia podría cambiar el porcentaje de células viables que habían sido tratados con ATO y IR (Fig. 5). Para este propósito, se utilizó 3-metiladenina (3-MA) (un inhibidor de la autofagia). Anexina V y tinción AO se cuantificaron utilizando citometría de flujo. El tratamiento combinado de células LNCaP y PC-3 pre-tratados con 3-MA no mostró ningún efecto en las células apoptóticas (Fig. 5C, 5F), y una disminución significativa en AO-positivo células (Fig. 5b, 5e) en comparación con combinado tratamiento. Además, se examinó si la inhibición de la autofagia podría alterar la citotoxicidad del tratamiento combinado (Fig. 5A, 5D). Se encontró una disminución significativa en la citotoxicidad en comparación con las células que reciben el tratamiento combinado sin pre-tratamiento con 3-MA. Estos resultados sugieren que ATO combinado con IR puede inducir la muerte celular autofágica en LNCaP y células PC-3.
Las células fueron tratadas con IR (4 Gy) y ATO (5 M) durante 48 hrs.
(a) (D) Efectos de la 3-MA sobre la citotoxicidad inducida por el tratamiento combinado. (B) (E) apoptosis temprana se midió por citometría de flujo con anexina V. (C) (F) Cuantificación de objetos AVO con AO usando citometría de flujo. *,
p
. & Lt; 0,05, ATO + IR frente ATO + IR + 3-MA
El crecimiento del tumor en ratones desnudos fue suprimida por IR y ATO
a continuación, el próximo evaluó el efecto del crecimiento antitumoral de IR y ATO
in vivo
. Los tumores se indujeron por s.c. inyección de células PC-3 en ratones desnudos. Se midió el peso corporal de los ratones cada semana y el volumen del tumor cada dos días. Los resultados de este estudio demostraron que ninguno de los regímenes de tratamiento produce ninguna pérdida de peso corporal, que puede ser un signo de toxicidad (Fig. 6A). El tratamiento combinado suprime el volumen del tumor y el peso del tumor en ratones desnudos en comparación con ATO o tratamientos IR por sí solo (Figs. 6B, 6C, 6D). Como se muestra en la Tabla 1, se midió el tiempo del volumen del tumor cuadruplicando (TVQT) del grupo de control en el día 18 (17,9 ± 2,2). El tiempo de retardo del crecimiento tumoral (TGD) para el tratamiento de 18 días de ATO solo fue de 11 días, que no fue significativamente diferente que para el grupo control (
p
= 0,11). solo IR produce un tiempo de TGD de 8,9 ± 5,1 días (
p
= 0,17 comparado con el grupo control). El tratamiento de combinación resultó en un tiempo TGD de 39,5 ± 8,3 días (a
p Hotel & lt; 0,05, comparado con el IR solo o ATO solo). La terapia de combinación de IR y ATO resultó en una inhibición del crecimiento tumoral de 74% el día 18. Así, el tratamiento de combinación posee efecto de crecimiento anti-tumor
in vivo
. A continuación, el PCNA, LC3 y patrón de expresión ATG5 en los tumores PC-3 fueron examinados por tinción inmunohistoquímica (Fig. 6E). la expresión de PCNA se redujo y LC3 y ATG5 se incrementaron en el tratamiento combinado en comparación con ATO o tratamiento IR solo.
(A) Medición del peso corporal en ratones desnudos una vez por semana. (B) La medición del volumen del tumor en ratones desnudos cada dos días. Los datos se presentan como el volumen relativo del tumor (media ± error estándar) normalizado con el volumen inicial del tumor medido en el día 0. (C) Las observaciones directas de ratones con tumores. Después de los experimentos, los ratones se sacrificaron y se extrajeron los tumores. (D) Medición del peso del tumor en los ratones desnudos después del sacrificio. (E) inmunohistoquímica (IHC) tinción de los tejidos de xenoinjerto PC-3 de ratón. IHC se utilizó para determinar los niveles de expresión de PCNA, LC3 y ATG5 (200 × aumento del objetivo).
Discusión
En la actualidad, la progresión del cáncer de próstata a un estado de la independencia de andrógenos sigue siendo el principal obstáculo para la mejora de la supervivencia del paciente. Por lo tanto, nuevas estrategias de tratamiento que son útiles para la enfermedad independiente de andrógenos deben ser identificados [28]. En el presente estudio, una combinación de IR y ATO mostró potencial como estrategia terapéutica para el tratamiento de cáncer de próstata (dependiente de andrógenos y-independientes) (Fig. 1). Lian et al. informó de que la natural de BH3 mimético de (-) - gosipol induce preferentemente la autofagia en células de cáncer de próstata independientes de andrógenos que son resistentes a la apoptosis, mientras que la apoptosis se induce preferentemente en células dependientes de andrógenos [29]. El presente estudio muestra que IR combinado con ATO tiene una mayor eficacia terapéutica en LNCaP y PC-3 células de cáncer de próstata humano. En concreto, el tratamiento combinado indujo la autofagia y la apoptosis en células LNCaP, y se indujo principalmente la autofagia en células PC-3 (. Figs 1, 2, 3). Lo anterior
in vitro
resultados están respaldadas por
in vivo
experimentos que empleaban a unas modelos de ratones con xenoinjertos de tumores de células PC-3. El tratamiento combinado suprime el volumen del tumor y el peso del tumor en ratones desnudos en comparación con ATO o tratamiento IR por sí solo (Fig. 6B). Además, la terapia de combinación de IR y ATO resultó en una inhibición del crecimiento tumoral del 74% (Tabla 1). Además, los tejidos tumorales de expresión LC3 y ATG5 se incrementaron en el tratamiento combinado en comparación con ATO o tratamiento IR por sí solo (Fig. 6E).
Shen et al. indica que la terapia de ATO es en gran medida segura y pocos pacientes requieren la interrupción del tratamiento debido a efectos secundarios [30]. El nivel plasmático de arsénico en el manejo clínico de la leucemia promielocítica aguda por lo general alcanza 5.5-7.3 M [30]. Se ha informado de que la concentración pico de nivel de arsénico plasma fue de 10,6 M después de la administración intraperitoneal de 0,2 mg (10 mg /kg) de ATO en ratones [31]. La dosis utilizada en nuestro estudio fue 6 mg /kg en ratones ATO representan una concentración de nivel de arsénico plasma de 6,4 M, lo que es clínicamente relevante. Además, nuestros resultados en el modelo de ratón con xenoinjerto encontraron que no había pérdida significativa de peso corporal en ratones de tratamiento combinado en comparación con grupo de control (Fig. 6A), y el procedimiento de tratamiento, por lo tanto combinada (6 mg /kg ATO tres veces por semana durante dos semanas y una sola dosis de 6 Gy IR) fue bien tolerado.
El papel de la autofagia en la terapéutica del cáncer sigue siendo controvertido. La autofagia se ha encontrado para desempeñar un papel como un mecanismo de supervivencia celular que permite a las células para despejar proteínas y orgánulos citoplasmáticos dañados través de la degradación lisosomal y sobrevivir estrés metabólico [32]. Por otro lado, la autofagia se ha encontrado para contribuir a tipo II la muerte celular programada en respuesta a la hipoxia, agentes quimioterapéuticos, infección viral, y las toxinas [33]. Nuestros resultados sugieren que el aumento significativo observado en la autofagia puede explicar, al menos en parte, el efecto citotóxico del tratamiento combinado porque pre-tratamiento con 3-MA, un inhibidor de la autofagia, tenía un efecto protector sobre la muerte celular inducida por el tratamiento combinado en LNCaP y las células PC-3 (. Las figuras 3, 5). Estudios recientes han encontrado que la vía Akt /mTOR desempeña un papel crucial en la regulación de la apoptosis y la autofagia tanto [34]. Ser473 es importante para el reconocimiento y la fosforilación de Akt por PDK1 [35]. Además, los efectos antitumorales de OSU-03012, un derivado de celecoxib, se piensa que es mediado principalmente a través de la inhibición de PDK1 [36]. La interrupción de la vía PI3K /Akt, que culmina en la inhibición de Akt, se ha encontrado que se asocia con la autofagia inducida por una variedad de agentes antineoplásicos en células de cáncer [34]. Una combinación de indol-3-carbinol y genisteína induce sinérgicamente la apoptosis y la autofagia en las células humanas de cáncer de colon HT-29 mediante la inhibición de la fosforilación de Akt [37]. Friedrichs et al. indican que los ácidos grasos poliinsaturados pueden prevenir la progresión de las células de cáncer de próstata a la independencia de hormonas mediante la modificación de las vías de transducción de señales, tales como la ruta de Akt /mTOR [28]. Una vía PI3K intacto /Akt se requiere para las células LNCaP a avanzar a estado refractario a las hormonas, y la actividad de Akt aumenta a medida que las células transformada de dependiente de hormonas a la hormona-independiente [6]. El presente estudio demuestra que la expresión de p-Akt, p-mTOR, p-p70S6K y proteínas p-PDK1 disminuyó en las células tratadas con IR combinado con ATO en comparación con el tratamiento con ATO o IR por sí solo (Fig. 4A).