Extracto
Los mediadores inflamatorios en el microambiente tumoral promover el crecimiento del tumor, el desarrollo vascular y permiten la evasión de la respuesta inmune anti-tumor, mediante la desactivación de la infiltración dendríticas Células. Sin embargo, los constituyentes de la microambiente tumoral que influyen directamente en la maduración de células dendríticas y la función no están bien caracterizados. Nuestro objetivo fue identificar los mediadores inflamatorios asociados a tumores que influyen en la función de las células dendríticas. medios tumorales condicionado obtenido a partir de tejido de explante de tumor colorrectal cultivaron contenían altos niveles de la CCL2 quimiocinas, CXCL1, CXCL5, además de VEGF. Pre-tratamiento de las células dendríticas derivadas de monocitos con este tumor medio acondicionado inhibió la regulación de CD86, CD83, CD54 y HLA-DR en respuesta a LPS, la mejora de IL-10, mientras que la reducción de la secreción de IL-12p70. Se examinó si los componentes individuales específicos del medio acondicionado del tumor (CCL2, CXCL1, CXCL5) podrían modular la maduración de células dendríticas o la secreción de citoquinas en respuesta a LPS. VEGF también fue evaluado, ya que tiene un efecto supresor sobre la maduración de las células dendríticas. Pre-tratamiento de las células dendríticas inmaduras con VEGF LPS inhibidos indujo la regulación positiva de CD80 y CD54, mientras que CXCL1 inhibida HLA-DR. Curiosamente, el tratamiento de las células dendríticas con CCL2, CXCL1, CXCL5 o VEGF suprimió significativamente su capacidad de secretar IL-12p70 en respuesta a LPS. Además, las células dendríticas tratadas con una combinación de CXCL1 y VEGF secretada menos IL-12p70 en respuesta a LPS en comparación con el tratamiento previo con cualquiera de las citoquinas solas. En conclusión, los medios de comunicación del tumor acondicionado influye fuertemente en la maduración de células dendríticas y la función
Visto:. Michielsen AJ, Hogan AE, Marry J, M Tosetto, Cox M, Hyland JM, et al. (2011) tumor microambiente del tejido puede inhibir la maduración de las células dendríticas en cáncer colorrectal. PLoS ONE 6 (11): e27944. doi: 10.1371 /journal.pone.0027944
Editor: Francesco Dieli, Universidad de Palermo, Italia |
Recibido: 30 de mayo de 2011; Aceptado: 28 Octubre 2011; Publicado: 18 Noviembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Michielsen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue financiado por el Consejo de Investigación irlandés de Ciencia, Ingeniería y Tecnología y la Fundación Darren Gibbons. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las células dendríticas (DC) son las células presentadoras de antígenos potentes capaces de activar las células T vírgenes. Los países en desarrollo están presentes en los tejidos en un estado inmaduro y mostrar bajos niveles de maduración o marcadores coestimuladoras tales como CD83, CD80 o CD86. Inmaduros países en desarrollo (IDC) reconocer y capturar antígenos específicos, incluyendo antígenos tumorales. DCs se someten a un proceso de maduración funcional en respuesta a mediadores inflamatorios tales como IFN-α o Toll como agonistas de los receptores (TLR). Como DC maduras que adquieren el potencial de presentar antígeno a las células T y la activación de una respuesta específica de células T anti-tumor [1], [2]. DCs que secretan altos niveles de bioactivo IL-12p70 inducir inmunidad óptima anti-tumor, ya que han aumentado la capacidad para mejorar la actividad de células natural killer, sesgar los respuesta a Th1 y específica CD8
primer tumor + células T [3], [ ,,,0],4].
Sin embargo, muchos tumores evadir la respuesta inmune mediante la secreción de citoquinas y otros factores que inhiben la diferenciación de DC o la maduración de DCs infiltrantes de tumor. [1]. Uno de los factores de estos "pro-tumorales ', Vascular Endotelial Growth Factor (VEGF) es conocido para sostener el crecimiento tumoral a través de sus propiedades angiogénicas, pero también puede provocar un efecto inhibidor sobre la diferenciación y la maduración de DC, la mejora de la supervivencia del tumor [1], [5] , [6], [7], [8]. VEGF con éxito ha sido el objetivo por el anticuerpo monoclonal humanizado Bevacizumab (Avastin) [9], sin embargo las tasas de respuesta son de aproximadamente 40% y muchos pacientes desarrollan resistencia a este tratamiento. Por lo tanto, es crucial para explorar el potencial de otros mediadores inflamatorios presentes en el microambiente tumoral que puede inhibir la maduración de DC, ya que estos también pueden ser posibles dianas terapéuticas.
Varias citoquinas y quimioquinas están presentes en altos niveles en el microambiente del tumor, en comparación con los tejidos normales, tales como CCL2 (MCP-1), CXCL1 (GRO) y CXCL5 (ENA-78) [10], [11], [12]. CCL2 es conocido para atraer monocitos, células T y células dendríticas [10], [13], mientras que la función principal de CXCL1 y CXCL5 es atraer y activar los neutrófilos [14], [15]. Además de sus funciones quimioatrayentes, CCL2, CXCL1 y CXCL5 también juegan un papel importante en la angiogénesis [15], [16], [17], lo que demuestra el carácter multifuncional de estas quimiocinas. Se sabe que las CD mieloides humanos expresan CCR2 y CXCR2, los receptores de CCL2 y CXCL1 y CXCL5, respectivamente [18], [19]. Sin embargo, el efecto de estas quimiocinas en la maduración de DC y la función previamente no se ha investigado.
En este estudio, hemos utilizado explantados de tejido de cáncer colorrectal humano para modelar el microentorno del tumor [20]. tejidos de explantes mantienen la estructura 3D compleja del tumor, incluyendo el estroma, lo que permite la producción de muchos diferentes factores asociados tumor, imitando de cerca el medio inflamatorio del tumor
in situ
. Estudios anteriores han demostrado que los sobrenadantes de las líneas de células tumorales pueden inhibir la maduración de DC [21], [22], sin embargo, la importancia de los factores secretados por todo el tumor en la maduración de células dendríticas no se ha examinado anteriormente.
Demostramos que tumor medio acondicionado (TCM) de los tumores de cáncer colorrectal cultivadas LPS significativamente inhibidos induce la maduración de DC, notablemente el aumento de IL-10, mientras que la disminución de la secreción de IL-12p70 en respuesta a LPS. Se encontró que el TCM contenía cantidades significativas de la CCL2 quimiocinas, CXCL1 y CXCL5 además de VEGF. Los niveles de CCL2, CXCL1 y CXCL5 en el TCM correlacionan con la expresión de CD83 y la secreción de IL-12p70 de las CD tratados con la medicina tradicional china. Individualmente, todos estos mediadores inflamatorios significativamente inhibidos LPS inducida por IL-12p70 secreción, sin embargo IL-10 secreción no se vio afectado. Curiosamente, los efectos de CXCL1 y VEGF sobre la inhibición de LPS inducido por IL-12p70 secreción por DCs fueron aditivos. Además, CXCL1 también tuvo un marcado efecto inhibitorio en LPS inducida sobre regulación de HLA-DR.
Resultados
tumor medio condicionado inhibe la maduración de DC e IL-12p70 la secreción si bien aumentó el IL-10 la secreción en respuesta a LPS
DCs derivadas
monocitos obtenidos a partir de 2 voluntarios sanos fueron incubadas con diferentes volúmenes de TCM de pacientes con cáncer colorrectal 4 por 4 horas antes de la LPS de simulación durante otras 18 horas, para determinar la concentración óptima de TCM. Se examinó el efecto de TCM en la capacidad de las DC para secretar IL-10 e IL-12p70 en respuesta a la estimulación por LPS. La secreción de IL-12p70 por países en desarrollo aumenta y dirige la expansión y diferenciación de las respuestas Th1 específicas de tumor, mientras que altos niveles de IL-10 y la secreción preferentemente conduce a la expansión de las células T reguladoras inmunosupresores. Tratamiento de DC con una dilución 1 en 2 de TCM mostró tener el efecto más potente sobre la IL-10 y aumento de la inhibición de IL-12p70 (p = 0,028) en respuesta a LPS (Figura 1). No se observó diferencia significativa en la expresión de CD80, CD86, CD54, CD83 y HLA-DR (MHC II), marcadores asociados con la maduración de DC, entre diferentes diluciones de TCM (datos no mostrados). Por lo tanto se utilizó un 1 en 2 dilución de la medicina tradicional china para su posterior análisis.
monocitos las células dendríticas derivadas inmaduras (IDC) (n = 2) fueron tratados durante 4 horas con 1:02, 1:04 y 1:10 diluciones de los medios de comunicación tumor acondicionado (TCM) obtenidos mediante el cultivo de los tumores explantados de pacientes con cáncer colorrectal 4
in vitro
durante 72 horas. Se añadió LPS (1 mg /ml) y las células se cultivaron durante otras 18 horas. Se recogieron los sobrenadantes de las células cultivadas como se describe anteriormente, y los niveles de IL-10 y la secreción de IL-12p70 por las DCs fueron medidos por ELISA. Las diferencias estadísticas se determinaron mediante la prueba de Mann-Whitney. países en desarrollo derivados
monocitos obtenidos a partir de 6 donantes sanos fueron tratados con 1 en TCM 2 de 21 pacientes con cáncer colorrectal durante 4 horas antes del tratamiento con LPS durante 18 horas, y de manera interesante, TCM tratados DCs secretadas niveles significativamente más altos de IL-10 en respuesta a LPS (p & lt; 0,0001), pero los niveles significativamente más bajos de IL-12p70 (p & lt; 0,0001) (Figura 2A). Además IL-12p70 mostró una correlación negativa con la expresión de CD83 Spearman r = -0,71, p. & Lt; 0,001 (datos no mostrados), lo que sugiere, además, que la medicina tradicional china tratada países en desarrollo con el aumento de la expresión de CD83 han disminución de los niveles de secreción de IL-12p70
iDC (n = 6) se trataron con TCM de 21 pacientes con cáncer colorrectal para 4 horas antes de la adición de LPS; las células se cultivaron durante otras 18 horas. Los niveles de IL-10 y la secreción de IL-12p70 por las DCs fueron medidos por ELISA. Las diferencias estadísticas se determinaron por ANOVA. (A) La expresión de los siguientes marcadores de maduración: CD80, CD54, CD86, HLA-DR y CD83 fueron evaluados por citometría de flujo. Se muestra un experimento representativo de seis (B). El cambio a veces la M.F.I. de cada marcador se calculó en relación con SIRD no estimuladas por las células tratadas con LPS o TCM + LPS. La significación estadística se calculó utilizando la prueba de los rangos con signos de Wilcoxon. (DO). *
p & lt; 0,05
, **
p Hotel & lt; 0,01 y ***
p
. & Lt; 0,001
El tratamiento de DC con la maduración DC inducida por LPS TCM también inhibió significativamente, con una expresión reducida de CD54 (
p Hotel & lt; 0,0001), CD86 (
p = 0,0035
), HLA-DR (
p = 0,0474
) y CD83 (
p = 0,0018
) observado (Figura 2B & amp; C). El tratamiento de las DC con medios acondicionados tomados de tejido normal adyacente al tejido tumoral (NCM) no inhibió LPS maduración inducida o la secreción de citoquinas de las CD (Figura 3).
Normal medios acondicionados (NCM) de 5 cáncer colorrectal los pacientes se utilizó para el tratamiento de las DC derivadas de monocitos antes de añadir LPS. La expresión de CD80, CD54, CD86, HLA-DR y CD83 se midió por citometría de flujo. No se observó ninguna diferencia significativa estadística. El análisis estadístico se realizó mediante el test de Wilcoxon.
Los niveles de CCL2, CXCL1 y CXCL5 presente en la medicina tradicional china se correlaciona con la expresión de CD83 y la secreción de IL-12p70 de las CD
TCM obtuvo de 21 pacientes con cáncer colorrectal se analizaron por ELISA para varios factores asociados a tumores conocidos. Los niveles de CCL2, CXCL1 y CXCL5 fueron consistentemente más altos que los de VEGF (una diana terapéutica actual en el cáncer colorrectal) en todos los pacientes examinados. Se encontró que los niveles de CCL2 (Spearman r = 0,59,
p = 0,0053
) CXCL1 (Spearman r = 0,50,
p = 0,0202
) y CXCL5 (Spearman r = 0,50,
p = 0,0199
) presente en el TCM correlacionó positivamente con la expresión de CD83 en las DC tratadas con la medicina tradicional china (Figura 4A). Esto implica que al aumentar los niveles de CCL2, CXCL1 y CXCL5 presente en la medicina tradicional china, la expresión de CD83 es elevada en países en desarrollo tratados con la medicina tradicional china. A pesar de que VEGF está presente en niveles detectables en el TCM, que no mostró correlación con la maduración de DC. Además, se encontró que la IL-12p70 la secreción de las CD tratadas con TCM negativamente correlacionada con CCL2 (Spearman r = -0,64;
p = 0,0019
), CXCL1 (Spearman r = -0.59,
p
= 0,0049) y CXCL5 (Spearman r = -0,57;
p = 0,0075
) (Figura 4B). Esto sugiere que con el aumento de los niveles de CCL2, CCL1 y CXCL5 en la secreción TCM, IL-12p70 de las CD disminuye. No hubo correlación significativa entre las cuatro citocinas y los otros marcadores DC, CD80, CD54, CD86 y HLA-DR, y la secreción de IL-10.
Las concentraciones de CCL2, CXCL1, CXCL5 y VEGF en el tumor condicionado los medios de comunicación de 21 pacientes con cáncer colorrectal fueron medidos por ELISA. Las concentraciones de CCL2, CXCL1 y CXCL5 correlacionan con la expresión de CD83 en las DC tratadas con TCM (A). CCL2, CXCL1 y CXCL5 inversamente correlacionada con la secreción de IL-12p70 de las células dendríticas tratadas con el TCM (B). Se utilizó la prueba de correlación de Spearman.
Efecto de CCL2, CXCL1, CXCL5 y VEGF en la expresión de marcadores de maduración de DC y la secreción de citoquinas en respuesta a LPS
Una vez establecido que la medicina tradicional china inhibe DC maduración en respuesta a LPS y que TCM contiene altos niveles de la CCL2 quimiocinas, CXCL1 y CXCL5 que determina a continuación si estos componentes individuales tuvieron un efecto directo en los países en desarrollo. expresión inducida por LPS de VEGF recombinante inhibió significativamente la maduración de DC marcadores CD80 (
p = 0,0391
) y CD54 (
p = 0,0078
) y CXCL1 inhibió significativamente la regulación positiva de HLA-DR (
p
= 0,0156) (datos no mostrados). Aunque CCL2 y CXCL5 mostraron una reducción de la maduración inducida por LPS de países en desarrollo, esto no alcanzó significación estadística (datos no mostrados). Mientras que el pretratamiento de las DC con CCL2, CXCL1, CXCL5 o VEGF no lograron aumentar LPS inducido por IL-10 secreción, se observó una disminución significativa en los niveles de LPS inducido por IL-12p70 secreción: CCL2 (
p
= 0,048), CXCL1 (
p = 0,0068
), CXCL5 (
p = 0,0255
), VEGF (
p = 0,0402
) (Figura 5). IL-1β, TNF-α, IL-8 y la producción de IL-6 por las DC en respuesta a LPS en ausencia o presencia de pre-tratamiento con VEGF, CCL2, CXCL1 o CXCL5 También se midieron; Sin embargo, no hubo diferencias significativas en los niveles de estas citoquinas determinados en estas condiciones (datos no mostrados). El tratamiento de las DC con CCL2, CXCL1, CXCL5 y VEGF no afectó a su capacidad para inducir la proliferación de células T o la producción de IFN (datos no mostrados).
Los sobrenadantes de los DCs cultivadas en presencia de CCL2, CXCL1 , CXCL5 y VEGF (n = 8) fueron cosechadas y las concentraciones de IL-10 e IL-12p70 determinado por ELISA. La significación estadística se determinó mediante la prueba de Mann-Whitney. * P & lt; 0,05, ** p & lt;.
0,01
Además se investigó si CCL2, CXCL1, CXCL5 y VEGF podrían afectar la migración de CC. CCL19 se utilizó como control positivo puesto que se sabe que se unen a la CCR7 receptor quimiocinas, que se expresa por países en desarrollo [23]. Encontramos que no aumentó la migración en comparación con CCL19 (datos no mostrados).
CXCL1 y VEGF tienen un efecto inhibidor aditivo sobre la secreción de IL-12p70 por países en desarrollo en respuesta a LPS
El TCM tiene un potente efecto inhibidor sobre la maduración de DC y la función, pero CCL2 y CXCL5, que están presentes en altos niveles en TCM, no tienen un efecto significativo en la expresión del marcador de maduración de células dendríticas, mientras que CXCL1 solamente inhibió significativamente HLA-DR y VEGF inhibieron significativamente CD80 y CD54 (datos no mostrados). Por lo tanto, se investigó si la combinación de las citoquinas recombinantes podría tener un efecto más potente sobre la maduración de células dendríticas. Se examinaron siete combinaciones diferentes de los cuatro citoquinas: CCL2 + CXCL1, CCL2 + CXCL5, CCL2 + VEGF, CXCL1 + CXCL5, CXCL1 + VEGF, VEGF + CXCL5, CCL2 + + CXCL1 CXCL5 + VEGF. La combinación de CXCL1 y VEGF no inhibió significativamente la expresión de marcadores de maduración inducida por LPS por DC (CD80
p = 0,0625
, CD54
p = 0,6
, CD86
p =
0.6, HLA-DR
p = 0,1
, CD83
p
= 0,8) (Figura 6A). Sin embargo la combinación de CXCL1 y VEGF reducido significativamente LPS inducido por IL-12p70 (
p = 0,0028
), pero no alteró los niveles de IL-10 (Figura 6B). IL-1β, TNF, IL-8 o IL-6 secreciones no se alteraron (datos no mostrados). No otra combinación tenía un efecto directo sobre inducida por LPS maduración o la secreción de citoquinas DC de las DC en respuesta a LPS en comparación con las citoquinas individuales (datos no mostrados). Además la inclusión de anticuerpos neutralizadores de CXCL1 y VEGF, solo y en combinación, no corrigió alteración TCM inducida de la maduración de DC, IL-10 o la secreción de IL-12p70 de las CD en respuesta a LPS (datos no mostrados).
SIRD (n = 5) fueron tratados con una combinación de CXCL1 recombinante (100 ng /ml) y VEGF (20 ng /mL), 4 horas antes de la adición de LPS (1 mg /ml). Las células se cultivaron a continuación durante otras 18 horas y los niveles de CD80, CD54, CD86, HLA-DR y CD83 fueron evaluados por citometría de flujo. Los resultados se muestran como factor de cambio en M.F.I. en relación con SIRD no tratados. La significación estadística se determinó por el test de Wilcoxon (A). Los sobrenadantes se retiraron de las células tratadas como se describe anteriormente y la concentración de IL-10 e IL-12p70 se determinó por ELISA. La significación estadística se calculó mediante la prueba de Mann-Whitney U (B). * P & lt; 0,05, ** p & lt;. 0,01
Discusión
En este estudio hemos demostrado por primera vez que el medio condicionado tumoral a partir de explantes tumorales de cáncer colorrectal puede inhibir significativamente LPS inducida por la maduración de las DC derivadas de monocitos. Además, el tratamiento de las DC con la estimulación TCM antes de LPS aumentó significativamente la producción de IL-10, una citoquina anti-inflamatoria que inhibe una respuesta Th1 [24], mientras que la disminución de la secreción de IL-12p70, una citoquina pro-inflamatoria requiere para respuestas Th1: un fenotipo DC asociada con la tolerancia. Posteriormente, se encontró que CCL2, CXCL1 y CXCL5 se expresaron en niveles elevados en el TCM en comparación con VEGF, y se determinó si estos mediadores inflamatorios podrían alterar la función de las DC. VEGF se incluyó en los análisis, ya que previamente se había demostrado que inhibe la maduración de DC [8], [22]. La adición de VEGF recombinante para SIRD tenía un efecto inhibitorio en la regulación al alza inducida por LPS de CD80 y CD54, mientras que la adición de CXCL1 recombinante para SIRD disminución de la expresión de HLA-DR tras el tratamiento LPS.
Sin embargo, el tratamiento de SIRD con humana CCL2 recombinante, CXCL1, CXCL5 o VEGF, en dosis de acuerdo con otros estudios [13], [22], [25], [26], por resultado una disminución significativa de los niveles de secreción de IL-12p70 en respuesta a la estimulación con LPS. Estos datos sugieren que los mediadores inflamatorios presentes en el microambiente tumoral reducen la capacidad de las DC de la zona para secretar IL-12p70 y por lo tanto la inducción de una respuesta eficaz anti-tumor.
Similares resultados se informaron en un estudio que investigó el efecto de medios acondicionados tomados de la línea celular de cáncer de páncreas BxPC-3 (BxCM), donde la diferenciación y maduración de DC se inhibió por BxCM. El estudio mostró que BxCM redujo la expresión de CD83, CD1a, CD1c, CD80 y CD86 por las CD en respuesta a TNF. De acuerdo con nuestros resultados, este estudio encontró un aumento significativo de IL-10 y una reducción en la producción de IL-12p70 en respuesta a la estimulación con TNFa después del tratamiento BxCM [27]. Sin embargo, el tratamiento de los DC con el sobrenadante de RCC-10 (células de carcinoma de células renales), resultó en una reducción en la expresión de marcadores de maduración, pero no afectó a la producción de IL-10 en respuesta a la estimulación con TNF, IFN y poli I: C [22]. Estos estudios, junto con los datos presentados aquí sugieren que muchos tipos de tumores secretan mediadores inflamatorios que pueden inhibir la funcionalidad de las CD; pero que no es probable que sea la variación en el medio inflamatorio y el efecto resultante sobre la función DC según el tipo de tumor y el estadio. Aunque habría sido interesante evaluar y aislar a los niveles reales de la infiltración de DC en el tejido de explante tumoral, esto no fue posible, debido a la limitación de tamaño del tejido de explante que recibimos de la cirugía. Nuestros resultados indican que NCM no afecta significativamente la maduración de DC o la secreción de citoquinas, lo que indica que el tejido normal adyacente puede tener inmunidad funcional. No hubo evidencia de un efecto inmunosupresor campo.
VEGF se estableció como un factor importante que contribuye al crecimiento del tumor mediante la inducción de la angiogénesis. El VEGF es una diana terapéutica en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer colorrectal, en donde se emplea el humanizado anti-VEGF mAb, Bevacizumab (Avastin). Estudios previos han demostrado que el VEGF inhibe la maduración de DC y la capacidad de los DC para activar las células T [5], [8], [22]. En este estudio, hemos demostrado que el VEGF inhibe la expresión de CD80 y CD54, pero no CD86 o HLA-DR, de datos que necesite Alfaro
et al.
[22]. Curiosamente, se encontró que las DC tratadas de VEGF secretadas redujo significativamente los niveles de IL-12p70 en respuesta a LPS; un hallazgo que no se ha documentado previamente. El uso de LPS para madurar las DC, en comparación con el cóctel de maduración que consiste en TNF, IFN y poli I: C utilizado por Alfaro
et al
podría explicar las diferencias observadas en el efecto de VEGF en la maduración de DC y IL. la secreción -12p70. Nuestro hallazgo de que la estimulación de VEGF de las DC no afecta a la proliferación de células T y la secreción de citoquinas es coherente con Alfaro
et al.
, Sin embargo, encontraron un efecto inhibidor de VEGF cuando está presente en la etapa de diferenciación de desarrollo DC, lo que indica que DC diferenciadas pueden ser menos sensibles a los efectos de VEGF [22]. Nuestro estudio también mostró que los pacientes con cáncer colorrectal tejido de explante secretan altos niveles de CCL2, CXCL1 y CXCL5, en comparación con VEGF. Curiosamente, los niveles de CCL2, CXCL1 y CXCL5 en la medicina tradicional china se correlacionaron con la expresión de CD83 en la medicina tradicional china tratan los DC. Esta es la primera vez se ha observado esta correlación, y sugiere que los pacientes con niveles más altos de CCL2, CXCL1 o CXCL5 podrían haber aumentado los niveles de CD83 en las CD. CD83 es muy importante para ingenuo de células T y la activación de células B [28], [29], sin embargo también se encontró que una mayor expresión de CD83 en las DC tratadas con TCM correlacionada con la reducción de la secreción de IL-12p70 de TCM tratada DCs. Se ha informado anteriormente de que mientras que diferentes estímulos pueden madurar las DC a niveles similares, con expresión similar de CD83, CD80 y CD86, el perfil de las citoquinas que secretan difieren; estímulos tales como IFN-γ puede resultar en IL-12 que secretan CD83 + DCs que estimulan las respuestas Th1 mientras que otros estímulos como resultado de la prostaglandina E2 en CD83 + DCs que secretan no IL-12 pero de manera eficiente promueven una respuesta Th2 [30].
Si bien se ha informado de que CCL2, CXCL1 y CXCL5 son importantes para el crecimiento tumoral, la proliferación y la angiogénesis [31], [32], el efecto de estas quimiocinas en DCs no ha sido previamente documentado. CCL2, los niveles de CXCL1 y CXCL5 en TCM inversamente correlacionada con la IL-12p70 secreción, esta es la primera vez se ha observado esta correlación, y sugiere que con el aumento de los niveles de CCL2, CXCL1 y CXCL5 en el TCM, IL-12p70 la secreción de las CD es reducido. CCL2 es un quimioatrayente para monocitos, células T de memoria y células dendríticas [26], [31]. CCL2 también se ha informado anteriormente para inducir la angiogénesis [17], que es importante para el crecimiento tumoral y la metástasis. Ambos efectos pro-y anti-tumorales de CCL2 se han observado a través de su efecto sobre los monocitos y macrófagos [31], mientras que aquí se muestra que CCL2 también puede influir en la respuesta inmune antitumoral, al afectar la capacidad de los países en desarrollo para secretar IL-12p70 pero no otras citoquinas incluyendo IL-10, IL-1β, IL-6, IL-8 o TNF-α en respuesta a la estimulación LPS. Por el contrario, Braun
et al.
Han demostrado previamente que CCL2 puede inhibir la producción de IL-12p70 de los monocitos y esta es la toxina pertussis sensible, pero no observar esta disminución de la secreción de IL-12p70 de las células dendríticas tratadas con ya sea SAC + IFN o CD40L + IFN [33]. Alternativamente, Omata
et al.
Ha encontrado DCs diferenciadas a partir de monocitos en presencia de CCL2 tenía una capacidad reducida de secretar IL-12p70 después de la estimulación con el ligando CD40, un efecto no es sensible a la toxina pertussis. Estos autores no informaron efectos de CCL2 en la diferenciación o maduración de las CD. [34]. Por lo tanto, el mecanismo exacto por el cual CCL2 ejerce su efecto sobre los países en desarrollo aún no se ha aclarado completamente.
Mientras que el efecto de CXCL1 y CXCL5 en la maduración de DC y la secreción de citoquinas no se ha investigado previamente, su función conocida es atraer y activar los neutrófilos [14], [15], que a su vez han sido implicados en el crecimiento celular tumoral, la angiogénesis y la metástasis [35]. Desde DCs expresan CXCR2 [19], que es el receptor para CXCL1 y CXCL5, no es sorprendente que CXCL1 y CXCL5 podrían tener un efecto sobre la función DC. Las quimiocinas tales como CCL2, CXCL1 y CXCL5 señal a través de receptores acoplados a proteína G, que controlan los niveles de AMPc intracelular y el aumento de los niveles de cAMP se correlaciona con una disminución de IL-12 de producción [36]. Sin embargo, el mecanismo por el cual estas quimiocinas reducir la secreción de IL-12p70 de las CD no se conoce, y será objeto de nuestras investigaciones futuras.
Curiosamente CXCL1 y VEGF tienen un efecto inhibidor aditivo sobre la secreción de IL-12p70. Actúan sobre receptores diferentes que han sido previamente demostrado que estar presente en países en desarrollo [7], [19], por lo que podrían activar diferentes vías de señalización de forma simultánea, o podrían activar la misma vía más eficaz. VEGF se ha demostrado para mejorar fosfato ERK1 & amp; ERK2 en los países en desarrollo y esta vía regula negativamente derivadas de monocitos maduración DC [7], [37]. Qué vías de señalización son activados por CXCL1 a través de CXCR2 en células dendríticas es aún desconocido, sin embargo los estudios en diferentes tipos de células, como las células cancerosas, muestran que la señalización de CXCR2 puede activar NF-kappa B, STAT3 y las vías ERK [38], [39] , [40]. Por lo tanto, hay una gran variedad de mecanismos potenciales por los cuales ligandos CXCR2 pueden inhibir la secreción de IL-12p70 por países en desarrollo. Sin embargo, el ozono inmune cualquiera de estas citoquinas solas o en combinación con anticuerpos neutralizantes no revertir el efecto inhibidor de la TCM. Esto demuestra que es probablemente múltiples factores diferentes que actúan juntos que la inhibición de CC causa. Esto es consistente con investigaciones anteriores que muestran que el bloqueo de un solo factor, VEGF en los sobrenadantes de las células RCC-10 no tuvo un efecto significativo sobre la activación de DC [22].
Hemos observado que CCL2, CXCL1, CXCL5 y VEGF no bloquean la maduración de DC, ni afectan a la migración de CC o la proliferación de células T. A diferencia de las DC tratadas con la medicina tradicional china, los mediadores de la inflamación individuales no mejoran la IL-10, sin embargo todos ellos inhibió la secreción de IL-12p70; un efecto que no se muestra anteriormente para CCL2, CXCL1, CXCL5 y VEGF. Los tejidos tumorales secretan explante muchos factores solubles diferentes, y no es muy sorprendente que algunos de los factores aislados en su propia no tienen un efecto comparable a la medicina tradicional china. Es muy probable que los muchos factores diferentes secretan en el TCM por el acto tumor explante juntos en la inhibición de la maduración y la función DC. Sin embargo la capacidad de CCL2, CXCL1, CXCL5 y VEGF para reducir significativamente la producción de IL-12p70 por países en desarrollo es importante, ya que esto podría potencialmente resultar en una respuesta Th1 reducida antitumoral
in vivo
.
En conclusión, se encontró que la medicina tradicional china inhibe la maduración de DC, e induce la IL-10, mientras que la inhibición de IL-12p70 secreciones de las CD. El TCM componentes CCL2, CXCL1, CXCL5 y VEGF parece desempeñar un papel en la modulación de la respuesta inflamatoria a través de la inhibición de la secreción de IL-12p70 por países en desarrollo, posiblemente para proteger el tumor de una respuesta inmunológica potente contra ella. Además, CXCL1 y VEGF actúan en conjunto en la inhibición de la secreción de IL-12p70 de las CD. A pesar de que CCL2, CXCL1, CXCL5 y VEGF están presentes en el TCM en niveles altos, no son los componentes principales de la medicina tradicional china que afectan a la maduración y la función DC. En conclusión, hemos demostrado la importancia de los medios del tumor acondicionado en la regulación de la función de células dendríticas en pacientes con cáncer colorrectal, sin embargo, los mecanismos subyacentes todavía necesitan ser aclarados.
Materiales y Métodos
Ex vivo de tumores el cultivo de explantes
se obtuvo Todo el tejido con el consentimiento informado por escrito del paciente, y el protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del hospital Universitario de San Vicente.
resecado quirúrgicamente el tejido tumoral de cáncer colorrectal ( n = 21) y el tejido normal (& gt; 10 cm desde el tumor; n = 5) se obtuvo de los pacientes del Centro para el tejido de explante bio-banco de la enfermedad de colon en el hospital Universitario de San Vicente, Dublín (12 hombres y 9 mujeres, la mediana 67 años, 1 Etapa II, III Etapa 5, 15 Etapa IV del cáncer colorrectal). El tejido explantado fue cortado en al menos 4 piezas de igual tamaño de aproximadamente 5 mm
3 y se cultivaron como se describe anteriormente [20]. En resumen, los tejidos tumorales explantados se cultivaron durante 72 h (en placas de 24 pocillos) en 2 ml de RPMI 1640 que contiene 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina, 4 mg /ml de Fungizone, 30 mg /ml de gentamicina (Invitrogen; Carlsbad , California) y suplementado con suero de 20% fetal bovino (Invitrogen). Después de 72 horas en cultivo, se recogieron y se almacenaron a -20 ° C tumor acondicionado Media (TCM) y medios acondicionados normales (NCM) hasta que se utilizaron para los análisis.
aislamiento de células dendríticas y la cultura
Las células humanas derivadas de monocitos inmaduras dendríticas (IDC) se generaron a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas a partir de preparaciones de leucocitos (Centro Nacional de sangre, hospital de St. James, Dublín). Los monocitos se aislaron por selección positiva utilizando perlas CD14-magnética (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) y se sembraron a una densidad de 1 x 10
6 células /ml en placas de 6 pocillos en 3 ml de RPMI 1640 que contiene 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina, 4 mg /ml de Fungizone y suplementado con 10% define Hyclone de suero bovino fetal (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos humanos (GM-CSF; 50 ng /ml, ImmunoTools, Friesoythe, Alemania), y la IL-4 humana (70 ng /mL; ImmunoTools). Las células se alimentaron en el día 3 mediante la sustitución de la mitad del medio y la adición de citoquinas frescas. En el día 6 a las células exhiben un fenotipo de DC inmaduras (CD14
-, CD11c
+, CD86
-, CD54
baja, CD83
-, CD80
-, y HLA DR
bajo).
La estimulación de los monocitos derivados DC
recién aislado iDC se sembraron por triplicado en placas de 96 pocillos a 1 x 10
5 células /200 l en RPMI 1640 medio suplementado con 10% definido Hyclone FBS (Thermo Fisher Scientific), y se estimularon con 1 en 2, 1 en 4 y 1 en 10 dilución de tumor acondicionado media (TCM) de 4 tejidos de explantes se cultivaron durante 4 horas antes de la adición de 1 mg /ml
Escherichia coli
lipopolisacárido (LPS; Alexis Biochemicals, Lausen, Suiza) para determinar la mejor dosis de la medicina tradicional china. Posteriormente DCs fueron tratados con un TCM 1 en 2 de dilución de los 21 tejidos de explantes de pacientes para 4 horas antes de la adición de 1 mg /ml LPS. Además, las CD se trataron con una dilución 1 en 2 de NCM de 5 tejidos de explantes de pacientes durante 4 horas antes de añadir 1 g /ml de LPS. En experimentos separados 1 × 10
5 IDC /200 medios de comunicación mu l fueron tratados con recombinante humano 50 ng /ml CCL2 (MCP-1), 100 ng /mL CXCL1 (GRO), 100 ng /mL CXCL5 (ENA-78)