Extracto
En este estudio, se planteó la hipótesis de que la terapia de privación de andrógenos (ADT) en el cáncer de próstata, aunque en un principio eficiente, induce cambios en la kinome tumor, que posteriormente promuevan el desarrollo de la enfermedad resistente a la castración (CR). Reconociendo la correlación entre la hipoxia tumoral y mal pronóstico en el cáncer de próstata, la hipótesis, además, que tales cambios pueden estar influenciados por la hipoxia. Se aplicaron microarrays con sustratos peptídicos 144 quinasa para analizar muestras de carcinoma de próstata xenoinjertos CWR22 de ADT-ingenuo, andrógeno-privada (AD), a largo plazo AD (ADL), y estadios de la enfermedad CR. El impacto de la hipoxia se evaluó comparando los perfiles de actividad de xenoinjerto de quinasa con los adquiridos de hipóxico y cultivos de células de carcinoma de próstata de normoxia, mientras que la relevancia clínica se evaluó mediante el análisis de muestras de tumor de prostatectomía de pacientes con enfermedad localmente avanzada, ya sea en ADT-naïve o principios estadios de la enfermedad CR. Mediante el uso de este nuevo método de microarrays sustrato peptídico que reveló una alta actividad de quinasa mediada por el transductor de señales y activador de la transcripción 5A (STAT5A) en el cáncer de próstata CR. Además, hemos descubierto la actividad quinasa de alto STAT5A que ya están en la regresión de xenoinjertos de ADL, se puso de manifiesto antes de la reanudación del crecimiento CR. Por último, ya que la actividad quinasa aumentado STAT5A También se detectó después de la exposición de células de carcinoma de próstata a la hipoxia, proponemos ADT a largo plazo de inducir la hipoxia tumoral y estimular la actividad quinasa STAT5A, que posteriormente conducen al crecimiento del tumor CR renovado. Por lo tanto, el estudio detectó STAT5A como candidato a investigarse más a fondo por su potencial como marcador de cáncer de próstata avanzado y la posible proteína diana terapéutica
Visto:. Røe K, Bratland Å, Vlatkovic L, Ragnum HB, Saelen MG, Olsen DR, et al. (2013) hipóxico del tumor quinasa de señalización mediada por STAT5A en el desarrollo del cáncer de próstata resistente a la castración. PLoS ONE 8 (5): e63723. doi: 10.1371 /journal.pone.0063723
Editor: Jean-Marc A. Lobaccaro, Clermont Université, Francia |
Recibido: 27 Junio, 2012; Aceptado: April 11, 2013; Publicado: 10-may 2013
Derechos de Autor © 2013 Roe y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de la Autoridad de Salud regional de Noruega sudoriental otorga 2.009.070 y 2.012.002 (KR), subvenciones de la División de Medicina, hospital Universitario Akershus, y la concesión 7º Programa Marco de la Unión Europea 222741- METOXIA. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El crecimiento inicial de un tumor maligno de próstata es estimulada por los andrógenos [1], y el tratamiento estándar de primera línea de pacientes con cáncer de próstata avanzado incluye la terapia de privación de andrógenos (ADT) [2]. Aunque inicialmente efectiva, los tumores se repiten inevitablemente en un estado resistente a la castración (CR). Metastásico, cáncer de próstata CR está aún permanecen el aspecto más preocupado en el manejo del cáncer de próstata, desafiando a los efectos del tratamiento prolongados. Por lo tanto, una mejor comprensión de los impulsores de cáncer de próstata CR está garantizado para permitir el desarrollo de estrategias de tratamiento más eficaces para este grupo de pacientes.
La hipoxia es un factor microambientales común de tumores sólidos, promoviendo el crecimiento del tumor, así como angiogénesis, metástasis, y la terapia de la resistencia [3], [4]. En el cáncer de próstata, la hipoxia tumoral de hecho se ha correlacionado con mal pronóstico [5] - [7], aunque sigue siendo escepticismo en cuanto a su función y la importancia clínica de rutina.
In vitro
estudios han demostrado que la hipoxia incrementa la actividad y la sensibilidad del receptor de andrógenos [8], que en muchos tumores CR puede conducir a una selección de fenotipos adaptados [9].
durante muchos años ha sido bien conocido que la progresión de la enfermedad y el desarrollo de resistencia al tratamiento en el cáncer en general, se caracterizan por la expresión y la actividad de los mediadores clave en la transducción de señal celular alterada, procesos tales como la proliferación, la invasión y la angiogénesis [10] regulación. se están reconociendo cada vez más la importancia y el uso potencial de estos cambios para mejorar el tratamiento del cáncer, específicamente como proteínas quinasas aberrantes están jugando un papel importante en la progresión del tumor maligno [11] - [13]. De la kinome humana (todos quinasas), aproximadamente la mitad del complemento de tirosina quinasa está implicada en el cáncer [14]. Por lo tanto, la identificación de las tirosina quinasas aberrantes se ha convertido en un enfoque atractivo en la búsqueda de mejoras en la detección de la agresividad de la enfermedad y nuevas dianas terapéuticas.
La hipótesis de que ADT en cáncer de próstata, aunque en un principio eficiente, induce cambios en la actividad de kinome el tumor que posteriormente conducen a un renovado, el crecimiento del tumor CR. Para examinar esta hipótesis, microarrays con sustratos peptídicos quinasa, que representan principalmente residuos de tirosina, se aplicaron para analizar muestras de un
in vivo
preclínica modelo de cáncer de próstata que refleja las diferentes etapas de desarrollo de la enfermedad CR. El impacto de la hipoxia se evaluó mediante la búsqueda de perfiles de actividad quinasa de este modelo con los generados a partir de cultivos de células de carcinoma de próstata de hipoxia y normoxia. relevancia clínica se evaluó mediante el análisis de muestras de tumores prostatectomía de pacientes con enfermedad localmente avanzada, ya sea en estadios de la enfermedad CR-naïve ADT o temprano.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Cuidado de animales y el empleo en el Departamento de Medicina comparada, hospital Universitario de Oslo (Permiso Número: 32-1984), en cumplimiento de las directrices sobre el bienestar animal de la Comisión Nacional Noruego de experimentos con animales . El protocolo de estudio clínico fue aprobado por el Comité Regional de Ética de la Investigación Médica y Salud (REC Sureste, Número de permiso: S-08607b) y estaba en conformidad con la Declaración de Helsinki. Se requiere el consentimiento informado por escrito para la participación.
preclínicos modelo de tumor
Los fragmentos de tejido (~ 2 × 2 × 2 mm
3) de lo humano, sensible a andrógenos CWR22 carcinoma de próstata xenoinjerto [ ,,,0],15] fueron por vía subcutánea (sc) implantado en uno de los flancos del macho, /c ratones desnudos BALB (30-35 g, 6-8 semanas de edad), junto con un 12,5 mg de pellets de liberación sostenida de testosterona (Innovative Research of America, Sarasota, FL ).
el curso del desarrollo de la enfermedad CR siguiente ADT se ilustra en la Figura 1A, utilizando el modelo preclínico para obtener diferentes estadios de la enfermedad. En primer lugar, los xenoinjertos que representan las enfermedades ADT-naïve fueron reclutados cuando su diámetro más corto alcanzó 8 mm. En segundo lugar, se realizó ADT cuando el diámetro más corto de xenoinjerto alcanzó 12 mm, por la castración quirúrgica y la interrupción simultánea de la exposición al sedimento de testosterona. Andrógeno-privada (AD) xenoinjertos fueron reclutados cuando su diámetro se redujo a 8 mm (aproximadamente 1 mes después de la castración). En tercer lugar, AD largo plazo (ADL) xenoinjertos fueron reclutados cuando su diámetro se redujo a 4 mm (aproximadamente 4 meses después de la castración). Por último, se incluyeron xenoinjertos CR con un crecimiento renovado cuando su diámetro alcanza 8 mm, siendo 5,4 ± 0,4 meses después de la castración. diámetros de xenoinjertos se midieron mediante un calibre dos veces por semana desde la implantación hasta la castración y una vez por semana después de la castración hasta el final del experimento
(A) diámetros de xenoinjerto frente al tiempo en la transición de la terapia de privación de andrógenos (ADT). - ingenua, a través de andrógeno-privada (AD) y AD a largo plazo (ADL), a la enfermedad resistente a la castración (CR), después de ADT por la castración. El tiempo para desarrollar la enfermedad en los pacientes CR es ~ 2 a 5 años. En nuestro modelo de xenoinjerto de carcinoma de próstata, el tiempo correspondiente fue de 5,4 ± 0,4 meses. Los cuatro círculos representan los cuatro grupos experimentales en este estudio. Las muestras de sangre para las mediciones de antígeno (PSA) específico de la próstata se retiraron de todos los ratones antes de los tumores se extirparon y se congelaron para la actividad quinasa de perfiles. (B) Los niveles séricos de PSA reflejan el patrón clínico de la progresión de la enfermedad. PSA se redujo en los tumores de AD y ADL, antes de ser restaurada en los tumores de CR. Las diferencias significativas (p & lt; 0,05) en comparación con los tumores ADT-naïve se indican (*). Cada barra representa la media y S.E.M de 3-6 tumores.
La castración se realizó bajo anestesia, usando por vía subcutánea inyecciones de mezcla de Zoletil (2,4 mg /ml tiletamina, 2,4 mg /ml zolacepam (Zoletil veterinario, Virbac laboratorios, Carros, Francia), 3,8 mg /xilacina ml (Narcoxyl veterinario, Roche, Basilea, Suiza), y 0,1 mg /butorfanol ml (Torbugesic, Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA)), se diluyeron 1:05 en agua estéril, en una dosis de 7,5 l /g. La analgesia se da a los animales castrados como por vía subcutánea inyecciones de buprenorfina (Temgesic, Schering-Plough, Bruselas, Bélgica), en una dosis de 0,1 mg /kg.
Las muestras de sangre para el antígeno prostático específico (PSA) análisis fueron retiradas de las venas femorales todos los animales adecuados antes de la eutanasia. Las muestras se dejaron coagular antes de ser centrifugada y se almacena a -80 ° C hasta que todas las muestras se analizaron simultáneamente. los niveles libres y totales de PSA en suero se analizaron mediante el kit fluoroimmunonometric AutoDELFIA Prostatus ™ PSA libre /total (PerkinElmer Life Sciences y analítica, Wallac Oy, Turku, Finlandia). La eutanasia de los animales se realizó mediante luxaciones cervicales e inmediatamente seguida por la escisión de tejido tumoral, que fue directamente congelaron en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 ° C.
Los pacientes
Para el propósito de validar los datos preclínicos, cuatro pacientes con cáncer de próstata que se habían sometido a prostatectomía radical con márgenes de resección claras fueron incluidos en el estudio (Tabla 1). Los pacientes fueron reclutados en el Hospital Norwegian Radium Hospital de la Universidad de Oslo. histopatológica del tumor y el estado ganglionar (pTN), puntuación de Gleason del tumor, y los niveles séricos de PSA preoperatorio se registraron como parte de los procedimientos clínicos estándar. El paciente había recibido 4 prolongados (~ 2 años) por vía subcutánea tres veces al mes goserelina a una dosis de 10,8 mg hasta su nivel de PSA empezó a aumentar tras el nadir ADT, y fue remitido a la cirugía definitiva.
Preparación del tejido
Los xenoinjertos y biopsias quirúrgicas de la piezas de prostatectomía, fresco congelado inmediatamente después de la resección, fueron evaluados por primera vez para el contenido de las células tumorales, después de haber sido seccionado utilizando un micrótomo criostato y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Cualquier tejido normal presente en las muestras de tumor se eliminó más o menos por la disección guiado por las manchas. Todas las muestras tumorales utilizados tenían un contenido de células tumorales superior a 80%. Las muestras se cortaron posteriormente en 10 micras secciones, de forma continua mantuvo congelado e inmediatamente volver a almacenarse a -80 ° C. Un volumen de ~ 3 mm
3 fue cortada de todas las muestras de xenoinjerto, el número requerido de secciones para cortar calcula después de medir la anchura y la longitud de las muestras. Por procedimientos idénticos, ~ 5 mm
3 se seccionó de cada biopsia prostatectomía muestra (normal y tumoral).
Análisis de Datos de Perfiles de actividad de quinasa carcinoma de próstata xenoinjertos '
Los procedimientos para la preparación de lisados de proteínas y la generación de perfiles de actividad quinasa se describen en el texto S1. Proteína lisados de tres réplicas biológicas de cada uno de los cuatro grupos experimentales (ADT-ingenuo, AD, ADL, CR) se analizaron para generar los perfiles de actividad quinasa de xenoinjertos.
Después de la comprobación visual y la sustracción del fondo, intensidad de la señal de punto final (la intensidad media de la señal de los tres últimos ciclos cinética) para cada punto, es decir, para cada sustrato péptido quinasa por matriz, se calcula BioNavigator (PamGene International BV). Un pequeño número de intensidades de señal negativos fueron manejados restando el cuantil 1% de todos los datos y el establecimiento de las intensidades de señal restantes de menos de 1 a 1. A continuación, todas las intensidades de señal fueron log
2-transformado, antes de la media replicar intensidad de señal dentro de cada experimento se calculó para cada sustrato peptídico. Para corregir la posible variación-experimento a experimento, la media de las intensidades de señal de los cuatro grupos experimentales 'para cada sustrato peptídico se restó de intensidad de la señal sustrato peptídico de cada grupo. Los datos de microarrays se someten a ArrayExpress (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/); número E-1572-MTAB
El análisis estadístico se realizó posteriormente en SPSS 18.0 (IBM, Somers, NY), con p. & lt; 0,05 consideró como estadísticamente significativo. ANOVA se aplicó para identificar sustratos peptídicos con niveles significativamente diferentes de fosforilación entre los grupos experimentales (ADT-naïve, AD, ADL, y CR). prueba de muchos-a-uno (AD, ADL, y CR en comparación con ADT-naïve) post-hoc de Dunnett ajustado para comparaciones múltiples. proteínas y genes nombres de los péptidos sustratos ', incluyendo información sobre los procesos celulares que están involucrados, fueron recuperados utilizando UniProt (http://uniprot.org, 15 mayo de 2012) y el gen HUGO Nomenclatura Comité (HGNC) (http: //www.genenames.org; 15. mayo de 2012) [16]
Actividad quinasa de perfiles de prostatectomía especímenes de biopsia
Tres repeticiones técnica (tanto de muestras tumorales y normales) fueron analizados de cada paciente, en una placa de tirosina PamChip®96, en el lugar PamGene International BV en 's-Hertogenbosch, Países Bajos. Muestra de ejecución se llevó a cabo como se describe anteriormente [17]. A partir del conjunto de datos resultante, calculado después de la comprobación visual y la sustracción del fondo, los datos fueron log
2-transformado después de establecer unos puntos de datos con la intensidad de la señal de menos de 1 a 1.
exposición hipóxica de células de carcinoma de próstata
el 22Rv1, PC3, DU145 y líneas celulares de carcinoma de próstata humana se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Todas las líneas celulares fueron autenticadas por repetición corta en tándem de perfiles (STR) basado en 16 marcadores polimórficos en uso por la ATCC y paternidad de prueba, y se confirmó que (MycoAlert, BioNordika, Oslo, Noruega) libre de micoplasma. Todas las líneas celulares se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, Oslo, Noruega) suplementado con 10% de suero de ternero fetal, 1% de L-glutamina (Invitrogen, Oslo, Noruega), y 1% de penicilina /estreptomicina (Invitrogen). Las células fueron cultivadas en forma rutinaria como una monocapa en 75 cm
2 frascos a 37 ° C en el 95% de aire /5% de CO
2, y se subcultivaron dos veces por semana para mantener un crecimiento exponencial.
Para investigar los cambios en la actividad de la quinasa inducida por hipoxia, las células en crecimiento exponencial en ~ 60% de confluencia, con medio fresco, se transfirieron a una cámara de hipoxia durante 24 horas (Invivo2 200; Ruskinn Technologies, Leeds, Reino Unido). hipoxia moderada (1% O
2) se logró en un 5% de CO
2 y N residual
2. hipoxia severa (anoxia) se obtuvo por 5% de CO
2 y una mezcla de 10% H
2 y 90% N
2 en combinación con un catalizador que cataliza la conversión de H
2 con O cualquier
2 left a H
2O. Todos los experimentos normoxia e hipoxia se realizaron tres veces con el fin de generar tres réplicas biológicas de todas las condiciones experimentales.
quinasa Actividad de perfiles de células de la próstata Carcinoma
Preparación de lisados de proteínas se describe en el texto S1. La actividad quinasa de perfiles se realizó de forma idéntica como para los xenoinjertos, utilizando 10 g de proteína total a partir de todas las muestras. Proteína lisados de tres repeticiones biológica de cada uno de los tres grupos experimentales (normoxia, hipoxia moderada, hipoxia grave) se analizaron para generar los perfiles de actividad quinasa. En la prueba post-hoc de Dunnett, la condición de control fue representado por las células de normoxia. Una evaluación de la reproductibilidad técnica de las matrices (interchip y correlaciones intrachip siguientes análisis de la misma lisado de cultivo celular en todas las matrices) se presenta en el texto S2.
Cobalt tratamiento con cloruro de
Para simular hipóxica la exposición y la expresión del factor-1α inducible por hipoxia células (HIF-1a) fueron expuestas a 100 mM de cloruro de agente de cobalto hipoxia-mimético (CoCl
2) (Sigma Aldrich) durante 4 horas antes se hicieron los lisados de proteínas. El tratamiento con CoCl
2 induce la expresión de HIF-1α por unión al dominio PAS, que bloquea la unión del pVHL HIF-1α, dando de ese modo la estabilización de HIF-1α [18].
Western Blot Analysis
Las proteínas y fosfoproteína expresiones se midieron mediante inmunotransferencias occidentales. Los anticuerpos primarios fueron anti-HIF-1α (BD Biosciences, Trondheim, Noruega), anti-STAT5A (Sigma-Aldrich), y anti-fosfo STAT5A /B (Y694 /Y699) (Millipore, Temecula, CA). Ratón monoclonal anti-γ-tubulina (Sigma-Aldrich) se utilizó como control de carga. Los anticuerpos secundarios fueron conjugados con peroxidasa de cabra anti-conejo y de burro anti-ratón (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, MA). Las proteínas se visualizaron por quimioluminiscencia utilizando SuperSignal West Dura ampliada Duración Substrato (Thermo Scientific, Rockford, IL) o LumiGLO Substrato quimioluminiscente (KPL, Gaithersburg, MD).
Resultados
Validación del modelo preclínico
Los CWR22 xenoinjertos de carcinoma de próstata expuestos los patrones de respuesta de volumen después de la castración similares a los observados en los pacientes, y xenoinjertos CR desarrollados después de 5,4 ± 0,4 meses (Figura 1A). Para la contabilización de aproximadamente cinco veces más rápido metabolismo en ratones, lo que corresponde a alrededor de 2-3 años en los seres humanos. La progresión de la enfermedad clínicamente relevante de xenoinjerto se confirmó adicionalmente mediante cuantificaciones de PSA de suero de muestras de sangre de los animales (Figura 1B). La reducción de PSA de xenoinjertos ADT-naïve a AD y ADL xenoinjertos fueron significativas (p = 0,032 yp = 0,042, respectivamente). En xenoinjertos CR, se restauraron los pre-ADT niveles de PSA.
quinasa La actividad en xenoinjertos Siguiendo ADT
A partir del análisis de los perfiles de actividad quinasa generados por los xenoinjertos, la fosforilación de 35 de los sustratos peptídicos quinasa se encontró que se afectó significativamente (reducción o aumento) después de ADT por la castración (Tabla 2). Estos sustratos proteínas implicadas en varios procesos celulares, tales como la angiogénesis representados (por ejemplo, PDGFR, VEGFR, EPOR), la supervivencia, la proliferación y la progresión (por ejemplo, MAPK, RAF, STAT), y la adhesión, la migración y la invasión (por ejemplo, FER, FES, MET).
en comparación con xenoinjertos ADT-ingenuos, algunos niveles de fosforilación de sustrato generadas por los xenoinjertos de AD fueron débilmente disminuyeron, mientras que otros se incrementaron. En la figura 2A la media logarítmica
2 y relación s.e.m. 35 para todos los sustratos significativos se muestran para los tres grupos de tratamiento frente a xenoinjertos ADT-naïve, con color azul que indica relación negativa de registro
2 y el color rojo que indican registro positivo
2 ratio, respectivamente. En parcelas Volcán Figura 2B (-log
10 valores de p frente a log
2 ratios) están visualizando los sustratos peptídicos quinasa con los más significativos y /o registro más alto
2 ratios entre los tumores tratados y ADT-naïve 'niveles de fosforilación
(A) Disminución. (azul; logaritmo negativo
2 ratio) y una mayor (rojo; registro positivo
2 ratio) los niveles de fosforilación de sustratos peptídicos quinasa por andrógeno-privada (AD ), a largo plazo AD (ADL), y resistentes a la castración (CR) xenoinjertos de carcinoma de próstata en comparación con los tumores no tratados previamente (ADT media razón y por sem sustrato). Proteína lisados de tres repeticiones biológica de cada uno de los cuatro grupos experimentales (ADT-naïve, AD, ADL, CR) se analizaron para generar los perfiles de actividad de xenoinjerto de quinasa. Se muestran todas las correspondientes nombres de genes los sustratos ', con las posiciones de inicio y finalización de la secuencia del péptido dentro de la proteína entre paréntesis. (B) parcelas en Volcán (-log
10 valores de p frente a ratios) visualización de sustratos peptídicos quinasa con más significativo y /o registro más alto
2 Relaciones entre los niveles de fosforilación tumores tratados 'y ADT-naïve. el etiquetado de los colores: amarillo: p & lt; 0,01 y la relación de & gt; 1,0; verde: p & lt; 0,01 y ratio = 0,5 a 1,0; rosa oscuro: p = 0,01-0,05 y la relación de & gt; 1,0; naranja: p = 0,01-,05 y ratio = 0,5 a 1,0; azul: p = 0,01-0,05 y la relación de & lt; 0,5; rosa claro:. p & gt; 0,05
De acuerdo con la inhibición del crecimiento tumoral significativa después de TPA a largo plazo el nivel de fosforilación del sustrato en xenoinjertos de ADL fue fuertemente disminuido de 32 de los 35 sustratos peptídicos quinasa, en comparación a los respectivos niveles de fosforilación procedentes de xenoinjertos de crecimiento exponencial ADT-naïve. Dos de los tres restantes sustratos peptídicos quinasa, que representa el transductor de señal y activador de transcripción 1 y 5A (STAT1 y STAT5A), demostró aumentado significativamente la fosforilación de xenoinjertos de ADL, con un registro de relación
2 frente a xenoinjertos ADT-naïve de 1,5 ± 0,3 para STAT1 (p = 0,004) y 1,5 ± 0,7 para STAT5A (p = 0,019). La fosforilación de xenoinjertos CR era para la mayoría de los sustratos restaurados en los mismos niveles que los de xenoinjertos de ADT-naïve. Sin embargo, también de los xenoinjertos de CR, la fosforilación de los sustratos de STAT1 y Stat5a era alta, por STAT5A siendo significativa en comparación con ADT-naïve xenoinjertos (p = 0,040; ingrese
2-ratio = 1,3 ± 0,8)
quinasa La actividad en ADT-naïve prostatectomías
Para evaluar la relevancia clínica, perfiles de actividad quinasa de prostatectomías de pacientes con cáncer de próstata fueron generados. Una firma actividad quinasa fue recuperado de los 100 péptidos sustratos quinasa con los más altos niveles de fosforilación, por xenoinjertos tumorales y muestras de los pacientes. Para xenoinjertos, la firma estuvo representada por la media de todos los xenoinjertos de ADT-naïve. Para las muestras clínicas, la firma se expresó por la media de las tres muestras de tumor de ADT-naïve (casos 1, 2, y 3 en la Tabla 1). La comparación de las dos firmas resultantes reveló 74 fosforilaciones sustrato compartidos (Figura 3 A y B), mientras que cada uno de ellos comprendía 26 sustratos exclusivamente fosforilados (Figura 3C). El solapamiento 74% indica que el modelo de xenoinjerto utilizado en el estudio actual es un modelo biológicamente relevantes de la situación clínica.
Una firma de la actividad quinasa de ADT-naïve se definió como los sustratos peptídicos 100 quinasa con más altos niveles de fosforilación. Para xenoinjertos de carcinoma de próstata, la firma fue representado por la media de todos los niveles de fosforilación de sustrato ADT-naïve. Para los pacientes de cáncer de próstata, un 100 firma la parte superior fue producido mediante el cálculo de la media de los tres ADT-naïve (caso 1, 2, y 3; Tabla 1) los niveles de fosforilación tumor. (A) El setenta y cuatro de los 100 sustratos fueron compartidos por el xenoinjerto y las firmas de ADT-naïve tumorales de los pacientes. (B) fosforilados sustratos peptídicos quinasa compartidos por xenoinjertos de carcinoma de próstata ADT-naïve (n = 3) y los tumores ADT-naïve de pacientes con cáncer de próstata (media de caso 1, 2, y 3). Se muestran todas las correspondientes nombres de genes los sustratos ', con las posiciones de inicio y finalización de la secuencia del péptido dentro de la proteína entre paréntesis. (C) Los sustratos peptídicos fosforilados exclusivamente quinasa (n = 26) en la firma de xenoinjertos (izquierda) y en la firma del tumor del paciente (a la derecha).
STAT1 y STAT5A sustrato para fosforilación por prostatectomías
Después de descubrir aumento de la fosforilación de la STAT1 y sustratos Stat5a por ADL y xenoinjertos de CR en comparación con xenoinjertos por ADT-naïve, se investigaron los correspondientes niveles de fosforilación de sustrato a partir de muestras de prostatectomía. Para permitir comparaciones entre diferentes pacientes, las fosforilaciones de sustrato por cada uno de muestra de tumor del paciente tres ADT-naïve se normalizó a los respectivos fosforilaciones por la muestra de tejido normal lóbulo contralateral. Un paciente (caso 4, Tabla 1) había recibido TPA a largo plazo antes de los primeros signos de la enfermedad se detectaron CR (aumento del PSA sérico) y la remisión a la prostatectomía radical. Desde el tejido normal de este paciente también fue privado-andrógeno, se impide la normalización de la fosforilación del sustrato generado por la muestra de tumor a la de la muestra de tejido normal. Por lo tanto, para este paciente, fosforilaciones sustrato por la muestra de tumor se normalizaron a la media de las fosforilaciones normales de sustrato de tejido por parte de los tres pacientes ADT-ingenuo. La fosforilación del sustrato STAT1 fue baja y similar para todos los pacientes. Sin embargo, mientras que la fosforilación del sustrato STAT5A por el tumor en comparación con las muestras normales en todos los pacientes ADT-naïve fue baja; log
2 ratio = 0,7 ± 1,2 (n = 3), que era sustancialmente más alto en el paciente temprano CR; log
2-ratio = 2,6 (n = 1) (Figura 4A).
(A) Para la terapia de privación de andrógenos (ADT) pacientes con cáncer de próstata -naïve, el registro
2 Relaciones entre los niveles de fosforilación de sustrato generadas por la muestra de tumor de prostatectomía frente a la muestra de tejido normal lóbulo contralateral respectivo se calcularon. Para el paciente que recibió a largo plazo ADT antes de la prostatectomía radical, el registro
2 ratio entre los niveles de fosforilación de sustrato de la muestra de tumor en comparación con los niveles de fosforilación de sustrato media de muestras de tejidos normales los ADT-naïve de los pacientes fueron calculados (ya que esto el tejido normal del paciente también fue expuesto a ADT). (B) análisis de inmunotransferencia Western de lisados de las muestras de tumor de prostatectomía 'con un anticuerpo contra la hipoxia-inducible factor 1α (HIF-1α), la principal proteína conocida para ser activado y estabilizado en condiciones de hipoxia, revelando aumento de la expresión de HIF-1α en el lisado de tumor CR temprana (caso 4). Ninguna expresión de HIF-1α se observó en lisados de tumores ADT-naïve.
aumento inducido por la hipoxia en STAT5A sustrato para fosforilación por las células de carcinoma de próstata
A partir de los resultados obtenidos en los xenoinjertos y prostatectomías , en combinación con el reconocimiento de la función potencial de la hipoxia en el desarrollo de la enfermedad CR [5], se planteó la hipótesis de que la hipoxia puede estar involucrado en la actividad STAT5A quinasa alterada. Para evaluar si el estado hipóxico estaba presente en las muestras de prostatectomía, se realizó un análisis de inmunotransferencia Western de HIF-1α en los lisados tumorales prostatectomía. HIF-1α es el regulador maestro de la homeostasis de oxígeno, conocido para ser activado y estabilizado en condiciones de hipoxia. La figura 4B muestra que la expresión de HIF-1α se encontró en el lisado del paciente con enfermedad temprana CR, como se refleja en el aumento del PSA después de TPA a largo plazo (caso 4), mientras que ninguna expresión de HIF-1α se observó en los lisados de ADT tumores -naïve
para inspeccionar aún más esta hipótesis, los perfiles de actividad de la quinasa se generan a partir de células de carcinoma de próstata 22Rv1 normoxia, así como a partir de las células expuestas a moderado (1% O
2) y grave (& lt;. 0,02% de O
2) la hipoxia durante 24 horas. La línea celular 22Rv1 es andrógeno-sensible y derivado originalmente de xenoinjerto CWR22 recaída [19], que expresa tanto el receptor de andrógenos y PSA, lo que representa un modelo de cáncer de próstata avanzado. Los niveles de fosforilación de sustratos peptídicos 22 quinasa se aumentaron o disminuyeron en lisados de células hipóxicas (hipoxia moderada o grave) en comparación con los lisados celulares por normoxia significativamente. Estos incluyen el sustrato STAT5A, que presentó un nivel de fosforilación aumenta con el aumento de la hipoxia (Figura 5A, barras azules), aunque el nivel de fosforilación media para todos los 22 sustratos peptídicos quinasa afectadas de manera significativa fue baja (Figura 5A, barras grises). La diferencia en el nivel medio fosforilación en moderada frente a la hipoxia severa no fue significativa. Para STAT5A, el registro
2 ratios comparación con las células normóxicas era 0,47 ± 0,27 (p & gt; 0,05) para las células moderadamente hipóxicas y 0,63 ± 0,31 (p = 0,020) para las células gravemente hipóxicas. Se proporciona una lista de los sustratos peptídicos 22 quinasa afectadas significativamente por la hipoxia en la figura 5B
Se expusieron células 22Rv1 (A) a moderada (1% O
2) y grave (. & lt; 0,02% O
2) la hipoxia durante 24 horas en una cámara de hipoxia. Proteína lisados de tres repeticiones biológica de cada uno de los tres grupos experimentales (normoxia, hipoxia moderada, hipoxia grave) se analizaron para generar los perfiles de actividad quinasa. Quinasa actividad de perfiles de hipoxia y normoxia celulares lisados detecte un aumento de la fosforilación del sustrato STAT5A con el aumento de la hipoxia (barras azules), mientras que el nivel de fosforilación media para todos los sustratos peptídicos 22 quinasa con cambios significativos fue baja (barras grises). * El aumento de normoxia a la hipoxia severa fue significativa (p = 0,020). La diferencia en el nivel medio fosforilación en moderada frente a la hipoxia severa no fue significativa. (B) La proporción de disminución en comparación con el aumento de la actividad de quinasa en lisados de células hipóxicas frente a normoxia 22Rv1. Se muestran todas las gen nombres de los sustratos peptídicos quinasa afectadas, con posiciones de inicio y finalización de la secuencia del péptido dentro de la proteína entre paréntesis. (C) de transferencia Western de anti-fosfo-STAT5A /B y anti-STAT5A expresión en normoxia (-) y severamente hipóxico (& lt; 0,02% O
2, 24 h) (+) de lisados de células de PC3, DU145 y 22Rv1 células. Anti-γ-tubulina sirvió como control de carga. (D) de transferencia Western de anti-HIF-1α, anti-fosfo-STAT5A /B y la expresión anti-STAT5A de lisados de PC3, las células DU145 y 22Rv1 con (+) o sin (-) 4 horas de exposición a 100 M de el cloruro de cobalto agente hipoxia-mimético (CoCl
2), un inductor químico de HIF-1α. Anti-γ-tubulina sirvió como control de carga.
Una inmunotransferencia Western correspondientemente confirmó un aumento del nivel de expresión de fosfo-STAT5A /B (Y694 /699) en severamente hipóxico 22Rv1 células, en comparación con las células de normoxia 22Rv1 (Figura 5C). La expresión de la proteína total STAT5A también se encontró para aumentar en condiciones de hipoxia, pero en un grado menor que el aumento de la fosfo-STAT5A /expresión B. Para excluir que el hallazgo de una mayor actividad STAT5A hipoxia inducida era específica de la línea celular se analizaron dos líneas celulares adicionales, las líneas celulares PC3 y DU145 de cáncer de próstata, revelando resultados similares a los de la línea celular 22Rv1 (Figura 5C).
Para dilucidar si la activación STAT5A fue inducida directamente por la activación de HIF-1α se trataron las células con CoCl
2, un inductor químico de HIF-1α. Como se ve en la figura 5D, CoCl
2 inducida por aumento de la expresión de HIF-1α tanto y fosfo-STAT5A /B en todas las líneas celulares. La expresión de la proteína STAT5A se incrementó en una línea celular y sin cambios en las otras dos líneas celulares. Desde HIF-1α inducida específicamente un aumento de la fosforilación STAT5 estos resultados apoya que la hipoxia es la causa de una mayor actividad STAT5, a través de un mecanismo mediado por HIF-1α.
Discusión
El actual estudio identificó aumento del nivel de fosforilación del sustrato peptídico STAT5A por ADL y CR próstata xenoinjertos de carcinoma, en comparación con por xenoinjertos de ADT-ingenuo.