Extracto
Durante la quimioterapia, resistencia a los medicamentos causada por la autofagia sigue siendo un reto importante para el éxito del tratamiento de pacientes con cáncer. El propósito de este estudio es mostrar que ulinastatina (UTI), un inhibidor de tripsina, podría reducir la resistencia de las células de cáncer de hígado a la epirubicina agente quimioterapéutico (EPI). Hemos alcanzado esta conclusión analizando el efecto de PAI solo o infección del tracto urinario, más EPI en SMMC-7721 y las células de cáncer de hígado MHCC-LM3. También generó una línea celular de cáncer de hígado EPI-resistente (células MHCC-LM3er), y se encontró que IU podría sensibilizar a las células LM3er de EPI. La autofagia suele funcionar para proteger a las células de cáncer durante la quimioterapia. Nuestro estudio demostró que UTI inhibe la autofagia inducida por EPI en las células de cáncer de hígado, que promueven la apoptosis, y por lo tanto, reducen la resistencia de las células cancerosas a EPI. Otros estudios demostraron que la inhibición mediada por UTI en la autofagia se logró mediante la inhibición de la vía de señalización del factor de transcripción factor nuclear-kB (NF-kB). Para verificar los resultados in vivo, se inyectaron células de cáncer de hígado MHCC-LM3 o células LM3er EPI-resistentes en ratones, y encontramos que el PAI podría inhibir la única manera efectiva el crecimiento de tumores en ratones inyectados con células MHCC-LM3, pero no en las células LM3er ratones inyectadas. Sin embargo, cuando la UTI se administró también, el crecimiento de tumor se inhibió en los ratones inyectados con células MHCC-LM3er también. Nuestros resultados sugieren que la IU se puede utilizar en combinación con fármacos contra el cáncer, tales como PAI, para mejorar el resultado de la terapia del cáncer
Visto:. Canción B, Bian Q, Shao CH, Li G, Liu AA , Jing W, et al. (2015) ulinastatina reduce la resistencia de las células del cáncer de hígado de epirubicina por inhibición de la autofagia. PLoS ONE 10 (3): e0120694. doi: 10.1371 /journal.pone.0120694
Editor Académico: Ying-Jan Wang, de la Universidad Nacional Cheng Kung, Taiwán
Recibido: 27 de septiembre de 2014; Aceptado: 26 Enero 2015; Publicado: 27 Marzo 2015
Derechos de Autor © 2015 Song et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
financiación:.. los autores no recibieron ninguna financiación específica para este trabajo
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
autofagia es un proceso celular esencial responsable de la degradación de los orgánulos celulares dañadas y disfuncionales y agregados de proteínas. Este es un proceso conservado entre levaduras, de plantas, y células animales y es importante para proporcionar fuentes de energía en respuesta al estrés de nutrientes y en los momentos críticos en el desarrollo [1]. En general, la autofagia es un mecanismo de supresión de tumor en las células normales y durante la transformación oncogénica temprano, pero también puede actuar como un vía de supervivencia crítico para tumores establecidos. El desarrollo de tumores establecidos y tienen altas demandas metabólicas debido al aumento de la proliferación y apoptosis umbrales altos. En este caso, la autofagia sirve como un mecanismo de supervivencia en muchas células tumorales, lo que les permite escapar de la muerte apoptótica en respuesta a crisis metabólica. Muchos fármacos contra el cáncer se han diseñado para imitar químicamente privación de nutrientes y el hambre, pero la autofagia es a menudo hasta reguladas en respuesta al tratamiento mediante la eliminación de los orgánulos dañada para escapar de la muerte, y por lo tanto genera resistencia terapéutica [2-4]. Se ha demostrado que mediante el aumento de la producción de especies reactivas del oxígeno en las mitocondrias, agentes quimioterapéuticos tales como inhibidores de la histona deacetilasa [5] y cisplatino [6] inducen la autofagia, y en muchos casos, la respuesta autophagic a estos tratamientos es cito-protección [ ,,,0],5]. Recientemente, se ha sugerido que mediante la combinación con los agentes que interrumpen la autofagia, la eficacia del fármaco contra el cáncer se puede mejorar [5].
ulinastatina (IU) es una glicoproteína que contiene glicosaminoglicanos y los glicanos N-ligados . Inhibe la actividad de una amplia gama de enzimas incluyendo la tripsina, quimotripsina, calicreína, plasmina, etc [7]. Clínicamente, la infección del tracto urinario se utiliza principalmente para el tratamiento de la pancreatitis aguda, pancreatitis recurrente crónica e insuficiencia circulatoria aguda [8, 9]. Estudios recientes han demostrado que la UTI inhibe el crecimiento de muchos tipos de cáncer incluyendo el cáncer gastrointestinal y cáncer de mama, y puede inducir la muerte celular si se utiliza junto con otros agentes terapéuticos [10-12]. En nuestros estudios preliminares, IU se encontró que tienen efecto inhibidor de la autofagia. Desde la autofagia juega un papel importante en la resistencia a los medicamentos en muchos tipos de células del cáncer [13, 14], por lo tanto, la hipótesis de que UTI podría reducir la resistencia a fármacos en células de cáncer mediante la inhibición de la autofagia.
epirubicina (EPI) es una antraciclina fármaco ampliamente utilizado en la quimioterapia del cáncer [15]. Se logra el tratamiento mediante la inducción de apoptosis en células de cáncer. Sin embargo, al menos en las células MCF-7 de cáncer de mama, EPI también induce la autofagia que protege las células de cáncer de causar resistencia a fármacos [15]. En este estudio, se investigó el efecto de la infección del tracto urinario en la autofagia inducida por EPI en las células de cáncer de hígado. Hemos generado un Epi-resistentes líneas celulares de cáncer de hígado (células MHCC-LM3er) y estudiamos la regulación de la autofagia en estas células. También se estudió el efecto de la infección del tracto urinario en la autofagia y la resistencia a los medicamentos en estas células cancerosas, y verificamos los resultados in vivo. Se ha encontrado que UTI suprime la autofagia inducida por EPI, que se logró mediante la inhibición de la vía de señalización del factor de transcripción factor nuclear-kB (NF-kB). Nuestros datos sugieren que la IU se puede utilizar como un agente terapéutico para ayudar el tratamiento del cáncer mediante la reducción de la resistencia a fármacos en células de cáncer.
Materiales y Métodos
Anticuerpo, líneas celulares, plásmidos y otros materiales
Mouse anti ACTB, conejo anti-p IKK, se utilizaron anticuerpos p-Nemo (Santa Cruz, EE.UU.) a una dilución 1: 200. Conejo anti LC3, ratón anti IKK, ratón anti Nemo, y de conejo anti PARP, ATG5, ATG7, SQSTM1, anticuerpos BECN1 (Señalización Celular, EE.UU.) se utilizaron a una dilución 1: 1.000. La lucha contra el sistema de etiquetado Envision ratón de conejo marcado con HRP era de Shanghai Changdao Biotech Inc.
líneas celulares de cáncer de hígado SMMC-7721 y MHCC-LM3, y las células normales del hígado fueron regalos de la Segunda Universidad Médica Militar, Shanghai. PcDNA3.1-GFP-LC3 se obtuvo de Cirugía Hepatobiliar del Este hospital, Segunda Universidad Médica Militar, China. Las líneas celulares de cáncer usados en el estudio fueron adquiridos de Banco de Células de Type Culture Collection de la Academia de Ciencias de China, Shanghai Instituto de Biología Celular de la Academia China de Ciencias, en el que se caracterizaron por la detección de la vitalidad celular, el ADN de huellas dactilares, la detección de isoenzimas y detección de micoplasma. Estas líneas celulares se expandieron y se congelaron inmediatamente para que pudieran ser renovadas cada 3 a 4 meses a partir de un vial congelado del mismo lote de células.
EPI (Cirugía del Hospital del Este hepatobiliar, Segunda Universidad Médica Militar, China) se utilizó a la concentración de 2,5 mM. Infección del tracto urinario (Techpool Bio-Pharma, Guangdong, China) se utilizó a una concentración de 1000 U /ml. Pirrolidina ditiocarbamato (PDTC) (Beyotime Inc., Shanghai, China) se utilizó a una concentración de 10 mM. La cloroquina (CQ, 10 mM) y 3-metiladenina (3-MA, 10 mM) (Sigma-Aldrich, EE.UU.) se utilizaron para la inhibición de la autofagia. Los ratones fueron mantenidos y cuidados de acuerdo con las pautas de la universidad y protocolos utilizan animales fueron aprobadas por las Juntas de Ética del Hospital de Cirugía Hepatobiliar oriental.
Cultivo celular, transfección, Determinación crecimiento celular y la generación de MHCC-LM3-resistente a los medicamentos Línea celular
Todas las células de cáncer de hígado se cultivaron en DMEM con 10% FBS a 37 ° C en un CO 7%
2 incubadora, y se transfectaron con Lipo2000 (Genechem Inc., Corea) en la confluencia de 60 a 70%. El crecimiento celular se determinó con un kit de MTS (Promega, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. línea celular MHCC-LM3 resistente a los medicamentos se generó como se describe anteriormente [15]. Brevemente, las células MHCC-LM3 se sembraron en matraces de cultivo y se les permitió alcanzar ~ 80% de confluencia en medio fresco antes de ser tratada con EPI. La dosis inicial de EPI fue de 0,05 m, y cada siguiente dosis fue de 25 a 50% mayor en la concentración de la dosis anterior hasta que las células se mantuvieron estables en la proliferación sin muerte celular significativa.
PCR en tiempo real
ARN total fue extraído con RNeasy Mini kit y QIAshredder (Qiagen), y la primera hebra de ADNc se sintetizó con First-Strand cDNA Synthesis kit (Abigen Biotecnología Co. Ltd.), siguiendo las instrucciones de los fabricantes. PCR en tiempo real se realizó con LightCycler 1.5 (Roche) siguiendo el protocolo del fabricante, y se utilizaron los siguientes cebadores: para Beclin1: 5'-GGCTGAGGGATGGAAGGGTCTAAG-3 'y 5'-GTTTCGCCTGGGCTGTGGTAAGTA-3'; para ATG5: 5'-ATGACAGATGACAAAGATG-3 'y 5'-CTCATAACCTTCTGAAAGTG-3'; En g7 para: 5'-ATGGGGGACCCTGGACTGG-3 'y 5'-GCAGAGTCACCATTGTAG-3'; para P62: 5'-ACTGATGGCTGTAACGGTCTA-3 'y 5'-GGAAGCAGATGGCACAGAGG-3'; y para GAPDH:. 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 'y 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'
Apoptosis Ensayo
Las células se lavaron con PBS frío se resuspendieron en tampón de unión (Beyotime Inc. , Shanghai, china) y luego se complementaron con 2 l de Anexina-V-FITC (20 mg /ml) antes de ser analizada por citometría de flujo.
autofagia Ensayos
Las células a 70-80% de confluencia fueron transfectadas con pcDNA3.1-GFP-LC3 con Lipo2000. a continuación, se observaron las células bajo microscopio de fluorescencia y las células con al menos 3 puntos de color verde se consideraron células autofágicas. El porcentaje de células autofagia = autofágicos /células totales x 100%. Para la observación bajo el microscopio de electrones, se sedimentaron las células se lavaron con PBS y el sedimento celular se fijó en 2,5% de dialdehído glutárico y ácido ósmico 1% durante 2 horas. Después del lavado, el sedimento se deshidrató y se embebieron en resina epoxi. Los cortes ultrafinos (45 nm) se tiñeron con acetato de plomo, y se observaron las secciones teñidas bajo microscopio electrónico JEM-2000EX [16]. Para controlar el flujo de autofagia, el tándem mRFP-GFP-LC3 construcción de adenovirus obtenido de Hanbio Inc (Shanghai, China) se utilizó en este estudio. La proteína fluorescente verde exhibido (GFP) y la proteína fluorescente roja (PVP) se basó en diferente sensibilidad del pH para controlar la progresión del flujo de autofagia. En breve, constructo mRFP-GFP-LC3 mayúscula en la diferencia de pH entre el ácido y el autolysosome autophagosome neutral para controlar la progresión de la autophagosome a autolysosome mediante el uso de microscopía confocal [17].
xenoinjerto en ratones desnudos
Los ratones desnudos machos (4-6 semanas de edad y 15-20 g de peso, comprados a Instituto de material Médico de Shanghai, Academia china de Ciencias médicas) se mantuvieron a 25 ~ 27 ° C con 45 ~ 50% de humedad . Los ratones desnudos se mantuvieron y cuidaron de acuerdo con las pautas de la universidad y protocolos utilizan animales fueron aprobadas por las Juntas de Ética del Hospital de Cirugía Hepatobiliar oriental. células MHCC-LM3 y las células resistentes a los medicamentos MHCC-LM3er se recogieron y se resuspendieron en PBS a 5 × 10
6 células /0,2 ml PBS. Para cada ratón, se inyectaron 200 l de la suspensión de células debajo de la piel en el hombro derecho. EPI (5 mg /kg) y UTI (20.000 /ratón) se inyectaron en el tumor cada 3 días más tarde days.30 los ratones se sacrificaron para la investigación adicional. Los tamaños de los tumores se calcularon utilizando la fórmula V = ab
2/2 (a: diámetro mayor del tumor, b: diámetro más corto)
Resultados
UTI inhibe la autofagia inducida. por EPI
EPI se ha informado de inducir la autofagia en las células del cáncer de mama y causa resistencia a los medicamentos [15]. Verity si tiene el efecto similar en las células de cáncer de hígado, células tratadas SMMC-7721 con EPI a diversas concentraciones para determinar el rango que EPI podría inducir eficazmente la autofagia [15, 18]. Como se muestra en la figura 1A, la autofagia aumentó de una manera dependiente de la concentración EPI. Sobre la base de este resultado, se optó por una moderada concentración de 2,5 mM para estudios posteriores. A continuación, hemos comprobado que si EPI induce la autofagia en las otras células de cáncer de hígado. EPI podría mejorar significativamente la autofagia en SMMC-7721, Huh-7 y las células HCC-LM3 y ligeramente en las células 97h (figura 1B). Se ha demostrado que CQ podría inhibir la infusión de autofagosomas y lisosomas, lo que resulta en la acumulación de autofagosomas y expresión LC3-II. Mientras tanto, 3-MA inhibe la clase I, así como de clase III PtdIns3Ks, que es necesaria para la formación de autofagosomas [16]. Con los dos inhibidores de la autofagia, se validó que el PAI se podría mejorar todo el proceso de autofagia, incluyendo autofagosomas y autolisosomas formación (Figura 1C). A continuación, queríamos saber si la autofagia inducida por EPI puede ser inhibida por la ITU. Para este propósito, se trataron SMMC-7721 y MHCC-LM3 células con EPI o EPI + UTI, el aumento de LC3-II y disminución de SQSTM1 se inhibió significativamente por el tratamiento EPI + UTI, lo que sugiere que la autofagia inducida-EPI fue inhibida por la adición de UTI (Fig 1D). Este resultado fue apoyada además por la observación de que la ATG7, ATG5 y BECN1 expresiones disminuyó y la expresión SQSTM1 aumentó tanto en el nivel de mRNA (Fig 1E) y el nivel de proteína (Fig 1F) en las células que está siendo tratado con EPI + UTI comparación con ser las células tratado con EPI solo. En las células transfectadas con pcDNA3.1-GFP-LC3, la expresión de GFP-LC3 (puntos verdes) también se redujeron significativamente en las células que se está tratando con EPI + IU comparación con la de las células que están siendo tratados con EPI solo (figura 1G ). Además, en comparación con las células que están siendo tratados con EPI, la cantidad de vesículas autofágicas en las células que está siendo tratado con EPI + UTI también se redujo significativamente como se observa bajo microscopio electrónico (Fig 1H). Para confirmar aún más la función de la IU en el flujo de autofagia, comprobamos el número de autofagosomas y autolisosomas en células MHCC-LM3 tratados con PAI o PAI + IU, IU podría reducir significativamente el flujo autophgic (figura 1I). En conjunto, estos resultados sugieren fuertemente que UTI inhibe la autofagia inducida por EPI en células de cáncer de hígado.
(A) La expresión de LC3-II se detectó en lisados de células SMMC-7721 tratadas con diferentes dosis de EPI. (B) El nivel LC3 se detectó en diferentes células de cáncer de hígado tratados con EPI (2.5μM) o no durante 24 horas. (C) de transferencia de Western mostró el nivel de LC3-II en las células SMMC-7721 tratadas con EPI (2.5μM) con /sin CQ (10 mM) /3-MA (10 mM) en diferentes puntos temporales. (D) moléculas indicadas se detectaron con inmunotransferencias en SMMC-7721 y las células LM3-MHCC tratados con EPI /EPI + IU durante los tiempos indicados. (E) PCR en tiempo real muestra los niveles de mRNA de los genes relacionados con la autofagia en MHCC-LM3 y células SMMC-7721 tratados con PAI o PAI + IU. (F) de transferencia de Western muestra los niveles de proteína de los genes relacionados con la autofagia en MHCC-LM3 y células SMMC-7721 tratadas con EPI /EPI + UTI durante 24 hrs. (G) EPI /EPI + IU se añadieron a las células LM3-MHCC durante 24 horas después de la transfección de GFP-LC3. Panel superior, la tinción de GFP-LC3; panel inferior, el gráfico muestra la fracción de células autofágicos. micrografía (H) de electrones de vesículas en las células autofágicos MHCC-LM3 tratados con PAI PAI + + IU. Se muestran las imágenes de alta resolución ampliadas de las áreas cuadradas. (I) MHCC células LM3-infectados con adenovirus GFP-LC3-mRFP durante 24 h, después se trató withEPI /EPI + IU. Se muestran imágenes representativas y gráficos. El experimento se repitió 3 veces. (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01).
IU promueve la apoptosis inducida por el EPI
Como un fármaco de quimioterapia, EPI elimina las células cancerosas mediante la inducción de la apoptosis [19]. Puesto que hemos mostrado que la UTI inhibe la autofagia inducida por EPI, sospechamos que UTI también podría promover la apoptosis cáncer en estas células. Para averiguar si IU tiene ningún efecto sobre la apoptosis inducida por el EPI, nos registramos por primera vez si la combinación de EPI y IU podría causar efectos tóxicos en las células del hígado normal. Como se muestra en la figura 2A, no había diferencia significativa en Sobrevivir a tasas de entre el grupo EPI y grupo EPI + UTI, lo que sugiere que el PAI + UTI no causaría más muerte celular en las células normales del hígado. A continuación, se analizó la cantidad de las células de cáncer de hígado SMMC-7721 y MHCC-LM3 tratados con PAI o PAI + IU, y encontramos que el número de células se redujo significativamente si ambos PAI y se añadieron UTI (figura 2B). La escisión de PARP, un indicador de la apoptosis, también se ha mejorado en las células tratadas con EPI + UTI comparación con la de las células tratadas con EPI solo (Fig 2C). Además, el tratamiento con EPI + UTI resultó en disminución del nivel de inhibidor de la apoptosis Bcl-2 y el aumento de escisión de caspasa-3 (Fig 2D). En apoyo de este resultado, Anexina V tinción mostró que el porcentaje de células se sometieron a apoptosis fue mayor en las células tratadas con EPI + UTI (Fig 2E). En conjunto, estos resultados sugieren fuertemente que UTI promueve la apoptosis cuando se utiliza en combinación con EPI, y potencialmente podría mejorar la eficacia de EPI en el tratamiento del cáncer.
(A) Porcentaje de sobrevivir L02 células tratadas con EPI /EPI + IU /IU. (B) Porcentaje de sobrevivir SMMC-7721 y las células de cáncer de hígado MHCC-LM3 en el marco del tratamiento de la EPI /EPI + IU /IU durante los tiempos indicados. (C, D) Western blot de las moléculas indicadas se muestran en la SMMC-7721 y MHCC- LM3 células de cáncer de hígado en el marco del tratamiento de la EPI /EPI + IU (tratamiento en D durante 24 horas). ACTB se transfirió como control de carga. (E) tinción de anexina V muestra el porcentaje de células se sometió a la apoptosis en el marco del tratamiento de EPI /EPI + UTI durante los tiempos indicados. Panel izquierdo fue resultado de la media de 3 experimentos; panel de la derecha era resultado representativo. Los resultados son la media de 3 experimentos independientes, (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01).
IU Promueve EPI-apoptosis inducida en células del cáncer de hígado mediante la inhibición de la autofagia
La autofagia desempeña funciones de protección indispensables en la muerte celular inducida por el PAI en las células del cáncer [15, 20]. Sabiendo que IU promueve la apoptosis inducida por el EPI, queríamos saber si esto se logró mediante la inhibición de la autofagia, que también fue inducida por EPI. Con este fin, hemos generado una línea de células EPI-resistente LM3er mediante la aplicación de dosis bajas de EPI a la celda de medios de cultivo durante un período de tiempo (ver Materiales y Métodos). Para tanto las células MHCC-LM3er y las células de control no EPI-resistente (MHCC-LM3), agregamos EPI y encontramos que el número de células supervivientes MHCC-LM3er fue mayor que la de las células MHCC-LM3, y menos MHCC- células LM3er sometieron a apoptosis de las células de control (Fig 3A). Este resultado indica que las células PAI-resistentes (MHCC-LM3er) estaban mejor protegidos frente a la apoptosis inducida por el PAI. Para averiguar si la resistencia a la EPI fue debido al aumento de la actividad de autofagia en las células MHCC-LM3er, hemos examinado la expresión basal de varios marcadores de autofagia y encontramos que en las células MHCC-LM3er, los niveles de mRNA de ATG7, ATG5 y BECN1 fueron superiores a que las células de control (figura 3b). También se examinaron los niveles basales de varias proteínas relacionadas con la autofagia, y se encontró que los niveles de LC3-II, ATG7, ATG5 y BECN1 aumentaron en las células MHCC-LM3er así, mientras que el nivel de SQSTM1 disminuyó (Figura 3C). La microscopia de fluorescencia también mostró que en comparación con las células control, había más células autofágicos en grupo MHCC-LM3er (figura 3D). Por otra parte, bajo microscopio electrónico, encontramos más vesículas autofágicos en las células MHCC-LM3er (Figura 3E). Por lo tanto, estos resultados sugieren que las células MHCC-LM3er EPI-resistentes tienen una mayor actividad basal autophagic que la de las células control. Por otra parte, encontramos que las células MHCC-LM3er pudieron resistir a la muerte celular inducida por el PAI comparación con las células MHCC-LM3, y la inhibición de la autofagia con 3-MA podría bloquear completamente la resistencia de las células MHCC-LM3er de EPI. También se obtuvieron los resultados similares cuando se utilizó UTI (Fig 3F y 3G). Este resultado sugiere fuertemente que IU promueve la apoptosis inducida por el PAI en las células del cáncer de hígado mediante la inhibición de la autofagia
.
(A) Porcentaje de células supervivientes MHCC-LM3 y LM3er bajo el tratamiento de la EPI. El panel inferior muestra los porcentajes de células MHCC-LM3er Anexina V-positivo MHCC-LM3 o. (B) PCR en tiempo real mostró los niveles de mRNA de ATG5, ATG7 y BECN1 en células MHCC-LM3 y MHCC-LM3er. (C) Western blot de LC3-I, LC3-II, ATG7, ATG5, BECN1 y SQSTM1 en las células LM3 y LM3er. ACTB era un control de carga. (D) puntos GFP-LC3 en células MHCC-LM3 y LM3er. Panel superior, microscopía de inmunofluorescencia mostró la imagen representativa de puntos de GFP-LC3, y el panel inferior era fracción de células en células autofágicos MHCC-LM3 o MHCC-LM3er. micrografía (E) de electrones de vesículas en las células autofágicos MHCC-LM3 y LM3er. Se muestran las imágenes de alta resolución ampliadas de las áreas cuadradas. (F) Porcentaje de supervivencia (panel superior) y de anexina V-células positivas (panel inferior) en las células MHCC-LM3 y LM3er bajo el tratamiento de la EPI /EPI + 3-MA o EPI /EPI + IU. Los resultados son la media de 3 experimentos independientes (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01).
IU controlan la autofagia mediante la inhibición de NF-kB vía de señalización
vía de señalización
NF-kB regula positivamente la autofagia [14, 21, 22]. IU podría inhibir la activación de NF-kB vía de señalización [23, 24]. Por lo tanto, especuló que UTI podría inhibir la autofagia en las células de cáncer de hígado mediante la supresión de la vía de señalización NF-kB. Para probar esta hipótesis, se trataron las células LM3-MHCC SMMC-7721 y con EPI solo o EPI + IU, y se encontró que la actividad de NF-kB fue suprimida en UTI complementado células (Figura 4A). Este resultado fue apoyada por la inhibición de la fosforilación de IKK-α y Nemo (Fig 4B). Por otra parte, se encontró que la adición de PDTC, un inhibidor de la vía de señalización de NF-kappa B, a las células MHCC-LM3 inhibió la fosforilación de IKK-α y la expresión de LC3-II (Fig 4C). Estos resultados sugieren que UTI inhibe la autofagia mediante la supresión de la vía de señalización NF-kB. Para averiguar si la adición de las drogas, infección del tracto urinario o PDTC, promueve la apoptosis epirubicina inducida en las células de cáncer de hígado, añadimos EPI, EPI + IU, EPI + PDTC, o EPI + IU + PDTC a SMMC-7721 y MHCC -LM3 células de cáncer de hígado, y observaron porcentaje similar de células supervivientes en EPI + IU, EPI + PDTC o EPI + IU + PDTC células suplementadas. En particular, no hubo efecto añadido sobre la muerte celular si se añaden tanto UTI y PDTC, lo que sugiere que tanto la UTI y PDTC promover la apoptosis en un mismo mecanismo, que es para inhibir la NF-kB de señalización autofagia vía regulada (Fig 4D y 4E) .
(a) la actividad relativa NF-kB en SMMC-7721 y las células LM3-MHCC bajo el tratamiento de la EPI /EPI + IU durante 24 horas. (B) transferencias Western de p-IKK alfa y p-Nemo en comparación con los niveles de proteína total de IKK alfa y Nemo, respectivamente, en SMMC-7721 y MHCC-LM3 células de cáncer de hígado en el marco del tratamiento de EPI /EPI + UTI para 24 hora ACTB es un control de carga. (C) de transferencia Western de p-IKK alfa, alfa total de IKK, LC3-I y LC3-II en las células MHCC-LM3 bajo el tratamiento de EPI /EPI + UTI /EPI + PDTC por 24 hr (D, E) Porcentaje de sobrevivir (D) y las células V-anexina positivo (e) en SMMC-7721 y las células LM3-MHCC bajo el tratamiento de la EPI /EPI + IU /EPI + PDTC /EPI + IU + PDTC durante 24 horas. Los resultados son la media de 3 experimentos independientes (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01) guía empresas
IU también promueve la apoptosis inducida por la inhibición de Vías de señalización NF-kB autofagia en Vivo
Para demostrar nuestro resultado anterior in vivo, inyectamos células MHCC-LM3er EPI-resistentes MHCC-LM3 o debajo de la piel en ratones (n = 6), y encontramos que la administración de EPI podría inhibir el crecimiento de tumores en MHCC-LM3 ratones inyectados con células, pero en menor medida en los ratones inyectados con células MHCC-LM3er. Sin embargo, cuando se administró UTI, el crecimiento del tumor en los ratones inyectados con células MHCC-LM3er fue inhibida, y la tasa de crecimiento fue similar a la de los ratones inyectados con células MHCC-LM3 (Fig 5A y 5B). Para averiguar si IU inhibe la vía de señalización NF-kB in vivo, se administró solo o PAI PAI + IU a los ratones y se analizó la actividad de la vía de señalización NF-kB en los tumores. Se encontró que en comparación con los ratones de control, el nivel de LC3-II y las fosforilaciones de IKK y Nemo fueron reducidos en los tumores de ratones administrados con tanto EPI + UTI, indicando la inhibición de NF-kB vía de señalización (Fig 5C y 5D). Este resultado sugiere que UTI promueve la apoptosis mediante la inhibición de NF-kappa B de señalización de la autofagia vía regulada in vivo.
(A, B) tamaños de los tumores (A) y la curva de crecimiento del tumor (B) de los ratones xenoinjertados con MHCC-LM3 o células MHCC-LM3er (n = 6) tratados con EPI /EPI + IU. La curva de crecimiento se obtuvo a partir de múltiples mediciones de diferentes ratones en el mismo grupo. (C) Análisis de Histoimmunochemical muestra la expresión de p-IKK y p-Nemo en ratones de xenoinjerto en el marco del tratamiento de EPI /EPI + UTI. (D) Western blot de p-IKK y p-Nemo en muestras de ratones de xenoinjerto en el marco del tratamiento de la EPI /EPI + IU. ACTB es un control de carga. Los resultados son la media de 3 experimentos independientes (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01).
DISCUSIÓN
Independientemente del tipo de cáncer, la resistencia a los medicamentos sigue siendo un reto importante para el éxito tratamiento quimioterapéutico para pacientes con cáncer [25]. Está claro que es importante identificar y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para mejorar el resultado del tratamiento del cáncer. La autofagia es un arma de doble filo en el cáncer, funciona como ambos anti- y pro-cáncer mecanismos [26]. En el cáncer de hígado, la autofagia puede proteger el hígado mediante la supresión de la inflamación, daño tisular y la inestabilidad del genoma para inhibir la iniciación del cáncer; Por otra parte, se requiere para la supervivencia de células de cáncer y el desarrollo del cáncer [26]. Muchas terapias actuales contra el cáncer, incluyendo la quimioterapia y la radiación de la terapia, imponen estrés metabólico en las células cancerosas e inducen la autofagia, que a su vez, a proteger las células de la apoptosis y causa resistencia a los medicamentos. Por lo tanto, el uso de inhibidores autofágicas en combinación con agentes terapéuticos puede particularmente mejorar la eficacia terapéutica [25, 27].
UTI es un inhibidor importante a la tripsina, y estudios recientes han demostrado que funciona con otros agentes quimioterapéuticos para promover la apoptosis, lo que resulta en la inhibición del crecimiento del tumor, al menos parcialmente debido a su efecto inhibidor en muchas vías de señalización implicadas en el crecimiento [10, 11, 28-30]. En nuestros estudios preliminares, se encontró que UTI era inhibidor para la autofagia, y por lo tanto, la hipótesis de que también podría mejorar la terapia del cáncer mediante la inhibición de la autofagia y reducir la resistencia a los fármacos quimioterapéuticos en las células cancerosas. De hecho, nuestros datos muestran que en las células de cáncer de hígado, infección del tracto urinario inhibe la elevación de la autofagia inducida por EPI, un fármaco quimioterapéutico contra el cáncer ampliamente utilizado. Cuando se utiliza en combinación con EPI, UTI promueve la apoptosis en las células. Este resultado sugiere que en las células de cáncer de hígado, UTI solo tuvo un efecto mínimo sobre la proliferación celular, pero cuando se aplicó junto con EPI, es mejorada la apoptosis inducida-EPI, muy probablemente por la inhibición de la autofagia (Fig 2B). Este resultado fue apoyado por la observación de que en las células PAI-resistente, ITU fue capaz de sensibilizar eficazmente las células a la inhibición de la autofagia IAA (figura 3).
Desde NF-kB se informó de regular positivamente la autofagia, hemos probado si IU inhibe la autofagia mediante la supresión de la vía de señalización NF-kB. Nuestros resultados muestran que la adición de ambos PAI y UTI a las células de cáncer de hígado, inhibió la actividad de la luciferasa NF-kappa B, y la reducción de la fosforilación de IKK-α y Nemo, un resultado también ha sido verificado por estudios in vivo. Estos resultados sugieren fuertemente que la vía de señalización de NF-kB se inhibe cuando se aplican tanto EPI y UTI. Para probar que la supresión de la vía de señalización de NF-kB podría conducir a la inhibición de la autofagia, que inhibió la NF-kB vía de señalización mediante la adición de PDTC, un conocido inhibidor de la vía de señalización de NF-kappa B, a las células junto con EPI, y observamos la inhibición de la autofagia como se esperaba. Este resultado apoya firmemente nuestra hipótesis de que al igual que el PDTC, IU podría inhibir la autofagia mediante la inhibición de la vía de señalización NF-kB. A fin de probar que tanto IU y PDTC actuaron en la misma vía de señalización, en lugar de trabajó de forma independiente para regular la apoptosis, hemos añadido tanto PDTC y IU junto con EPI a las células cancerosas, pero no observó ningún aumento adicional de la actividad de la apoptosis. Este resultado apoya firmemente nuestra conclusión de que IU y PDTC no actúan de forma sinérgica, y solo ITU fue tan eficaz como PDTC en la inhibición de la vía de señalización NF-kB para promover la apoptosis.
resistencia a los medicamentos autofagia inducida en células de cáncer tiene sido un reto para el tratamiento del cáncer [31]. Las estrategias contra la autofagia se han utilizado en muchos ensayos clínicos registrados en el Instituto Nacional del Cáncer de EE.UU. en una variedad de cánceres humanos [32]. Sin embargo, CQ o HCQ (hidroxicloroquina) se utilizaron para inhibir la infusión de las autofagosomas y lisosomas en la mayoría de los ensayos clínicos, no se ha informado del uso de otros inhibidores de la autofagia que podría frenar la formación de autofagosomas en los ensayos clínicos. UTI se ha utilizado para el tratamiento de otras enfermedades tales como la pancreatitis aguda, y nuestros resultados han demostrado que la UTI podría inhibir la autofagia inducida-EPI y promover la apoptosis durante la terapia del cáncer, muy probablemente por la inhibición de la vía de señalización de NF-kB. EPI es un agente de quimioterapia contra el cáncer ampliamente utilizado, pero también puede causar resistencia a fármacos mediante la inducción de la autofagia. Nuestro hallazgo implica que UTI se puede usar en combinación con fármacos contra el cáncer, tales como PAI para mejorar el resultado de la terapia del cáncer. Además, los resultados también pueden arrojar luz sobre la aplicación de UTI en otros campos clínicos.