Extracto
Para facilitar la formación de imágenes de cáncer de próstata utilizando moléculas específicas, se construyó nanoburbujas ultrasónicas junto con nanocuerpos (antígeno de membrana específico de la próstata) específicos anti-PSMA, y evaluamos su
in vitro
capacidad de unión y
in vivo
eficacia de imágenes. Los nanoburbujas "selectivos", que fueron construidos a través de un sistema de biotina-estreptavidina, tenían un diámetro medio de 487,60 ± 33,55 nm y llevan a la nanocuerpos anti-PSMA como se demostró por inmunofluorescencia. La microscopía reveló dirigido unión de nanoburbujas
in vitro a las células
PSMA-positivos. Además, se evaluaron los indicadores ecografía de imágenes nanobubble (incluyendo la hora de llegada, tiempo de pico, pico de intensidad y mayor duración) para la formación de imágenes por ultrasonido en tres tipos de animales (xenoinjertos LNCaP, C4-2 y MKN45), y demostraron que estos cuatro indicadores de nanoburbujas dirigidos mostraron diferencias significativas respecto a nanoburbujas en blanco. Por lo tanto, este estudio no sólo presenta un nuevo enfoque para orientar la ecografía cáncer de próstata, sino que también proporciona las bases y modalidades para la construcción de pequeñas dimensiones y de alta eficiencia nanoburbujas ultrasonidos focalizados
Visto:. Fan X, Wang L, Guo Y, Tu Z, Li L, Tong H, et al. (2015) ultrasónico nanoburbujas Llevar anti-PSMA nanocuerpo: construcción y aplicación en Imaging orientada por cáncer de próstata. PLoS ONE 10 (6): e0127419. doi: 10.1371 /journal.pone.0127419
Editor: Serge Muyldermans, Universidad Libre de Bruselas, Bélgica
Recibido: 5 de Noviembre, 2014; Aceptado: 14 de abril de 2015; Publicado: 25 Junio 2015
Derechos de Autor © 2015 Fan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo ha sido financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales (número de concesión: 30970830), la Fundación de Ciencias de Chongqing (número de concesión: cstc2012jjB0072) y la Fundación Juvenil de Ciencia Departamento de Jiangxi de Educación (número de concesión: GJJ12142).
Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La identificación específica de cáncer de próstata es una vista clínico. tarea urgente [1]. En este sentido, el desarrollo de la imagen molecular ecografía ha proporcionado una nueva vía para el diagnóstico precoz del cáncer de próstata. Esta técnica consiste en compuestos de imagen de etiquetado con anticuerpos o ligandos específicos para generar agentes de contraste de ultrasonidos focalizados capaz de unirse a tejidos o lesiones específicas. Después de la administración intravenosa, estas sondas moleculares agregan específicamente en los tejidos diana a través de la circulación de la sangre, permitiendo de este modo de formación de imágenes específico basado en la ecografía de cambios patógenos a un nivel molecular o celular. [2]. Sin embargo, los agentes de contraste de ultrasonido escala micrométrica (microburbujas) que actualmente se utilizan en los estudios de imagen más relevantes tienen un diámetro de 1-10 micras [3,4]. estructuras neovasculares tumorales son a menudo imperfecta porque los vasos sanguíneos del tumor disponen de membranas basales incompletas, carecen de capas de músculo liso y presentan una mala circulación linfática; en consecuencia, estos vasos presentan un aumento de la permeabilidad relativa a los vasos sanguíneos normales, un efecto que se ha denominado el efecto de permeabilidad y retención mejorada (EPR). A pesar de esta permeabilidad, el diámetro de poro vascular máxima varía de aproximadamente 380 a 780 nm, y, teóricamente, sólo las partículas & lt; 700 nm de diámetro puede pasar a través de la neovascularización tumoral; Por lo tanto, los agentes de contraste de ultrasonido regulares a menudo no pueden pasar a través de la vasculatura para investigar las células tumorales y facilitar la formación de imágenes específico de tumor [5,6]. A raíz de estos hallazgos EPR, algunos grupos han construido recientemente nanoburbujas y examinó su permeabilidad. Los nanoburbujas preparados por Yin
et al
. tenía un diámetro medio de 436,8 ± 5,7 nm y se muestran tumor pasiva de orientación [7]. En nuestros estudios preliminares, también desarrollamos nanoburbujas dirigidos con un diámetro medio de 644,30 ± 55,85 nm que lleva a anticuerpos monoclonales contra el antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) y se investigó el potencial de formación de imágenes de estos nanoburbujas en xenoinjertos de cáncer de próstata en ratones desnudos. Nuestros resultados revelaron que estas nanoburbujas dirigidos podrían aumentar los valores de tiempo y la intensidad del pico de xenoinjerto en comparación con nanoburbujas en blanco y eran, por tanto, propicio para la formación de imágenes dirigida específica de tumor [8].
Sin embargo, nanoburbujas anticuerpos dirigidos monoclonales tienen dos aparente limitaciones. En primer lugar, los anticuerpos monoclonales murinos son inmunogénicos en seres humanos. En segundo lugar, los grandes pesos moleculares de los complejos de anticuerpo-partícula resultan en bajos números de dirigir complejos alcanzar los objetivos previstos [9], comprometiendo así los resultados de formación de imágenes. Por lo tanto, la identificación de un anticuerpo de tamaño pequeño que es conveniente, de alta eficiencia y penetrante es crucial para la formación de imágenes molecular específica de tumor. El descubrimiento de nanocuerpos [10] proporciona una estrategia prometedora para el desarrollo de un nuevo tipo de nanobubble ultrasonido orientada porque estos nanocuerpos son de menor tamaño. Específicamente, (anticuerpos de cadena pesada IgG2 e IgG3) de los animales de la familia de los camélidos carecen naturalmente cadenas ligera y el dominio CH1; estos son los fragmentos antigénicos conocidos actualmente funcionales más pequeñas de unión y se caracterizan por bajos pesos moleculares, la expresión conveniente, la estabilidad y baja inmunogenicidad
in vivo
. Por lo tanto, son nanocuerpos una perspectiva prometedora con respecto al diagnóstico preciso y terapias dirigidas [11-16]. Sin embargo, se han descrito muy pocos nanoburbujas ultrasonido focalizado tumorales junto con nanocuerpos específicos. En el presente trabajo, hemos desarrollado la formulación nanobubble objetivo de pequeño tamaño y de alta eficiencia, lo que lleva a la nanocuerpos anti-PSMA, para verificar la hipótesis de que nanoburbujas nanocuerpos recubierto de pueden mejorar el valor diagnóstico de la ecografía en el cáncer de próstata.
Materiales y Métodos
las células y los animales
LNCaP, que es el típico de células de cáncer de próstata dependiente de andrógenos humano, se adquirió de la American Type Culture Collection (ATCC). C4-2, que es un subtipo de la línea celular LNCaP y una línea celular de cáncer de próstata independiente de andrógenos humano, fue adquirido de ViroMed Laboratorios en Johns Hopkins, EE.UU.. MKN45, una línea celular de cáncer gástrico humano como el control, se obtuvo de la Academia China de Ciencias Médica Cancer Institute (Pekín, China). De cuatro a 5 semanas de edad macho BALB /c-nu ratones desnudos (Experimental Animal Center, Third Military Medical University) mantiene en un ambiente específico libre de patógenos se utilizaron como se describe a continuación. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Tercera Universidad Médica Militar.
Western Blot en tres líneas celulares
LNCaP, células C4-2 y MKN45 hicieron crecer hasta la fase logarítmica, se enjuagaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS), se colocó en hielo, y se suspenden en 400 l de ensayo de radioinmunoprecipitación tampón de lisis (RIPA) de proteínas. A continuación, todos los lisados de células tumorales se transfirieron a un tubo de 1,5 ml y se centrifugaron a 15.000 rpm y 4 ° C durante 15 min. El sobrenadante resultante se transfirió a un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 ml. a continuación, se utilizó un kit de ácido bicinconínico (BCA) para determinar la concentración de proteína. Además, las muestras se complementaron con tampón de carga dodecil electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 5X de sodio, se mezcla y se hierve durante 5 min para desnaturalizar completamente de las proteínas. Treinta microgramos de proteína total se separó a través de SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) mediante el método de transferencia semi-seco. La membrana se bloqueó con un tampón de leche descremada 5% a temperatura ambiente durante 2 h y luego se probaron sucesivamente con una 1: 400 dilución (2,5 g /ml) de un anticuerpo monoclonal anti-hPSMA a 4 ° C durante la noche y un 1: dilución 2000 de una peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado con anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 2 h; la membrana se lavó tres veces con PBST (PBS con 0,1% de Tween-20) después de cada incubación de anticuerpo.
Generación de nanocuerpos específico y biotinilado
La región extracelular de PSMA se expresó primero en eucariotas de riñón embrionario humano (HEK) -293 células, después de lo cual se utilizó la proteína recombinante como material de recubrimiento para cribar una biblioteca de nanocuerpos naturales previamente establecido designado NA-PDL. Correspondientemente, se obtuvieron fagos nanocuerpos capaces de unirse específicamente a PSMA en los niveles molecular y celular [17]. Estos fagos se secuenciaron posteriormente, y los siguientes cebadores se diseñaron de acuerdo a los resultados de la secuenciación: cebador directo, CGCGGATCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTG (que contiene un
BamHI
sitio) y el cebador, CCCAAGCTTTTATTGTGGTTTTGGTGTCTTGGGTT (que contiene un
HindⅢ
sitio inversa ). a continuación, se realizó una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), usando el clon de fago positivo como plantilla para amplificar el gen diana; el producto de reacción fue clonado posteriormente en el
BamHI Opiniones y
HindIII
sitios del vector de expresión pET28a (Novagen /EMD Millipore, Billerica, MA, EE.UU.), que contiene una etiqueta de seis histidina. El vector recombinante se transformó en el
E
.
coli cepa DH5
. Los clones positivos resultantes se secuenciaron para identificar los que tienen la secuencia correcta; los clones correctos se transformaron en el
E
.
coli
Rosseta cepa de expresión (DE3; Novagen /Merck Millipore) para proporcionar un alto nivel de expresión. Ni-agarosa (Qiagen, Venlo, Países Bajos) fue utilizado posteriormente para purificar el nanocuerpos marcada con histidina. A continuación, hemos denominado la nanocuerpos con la solución de biotina. En detalle, las dos miligramos de sulfo-NHS-LC-Biotina (Pierce /Thermo Scientific, Rockford, IL, EE.UU.) se disolvieron completamente en 360 l de estéril ddH
2O. Esta solución se incubó con el nanocuerpos a 4 ° C durante 72 h, seguido por diálisis a 4 ° C durante la noche. espectroscopia de UV se utilizó para determinar la concentración de anticuerpo. Específicamente, el coeficiente de extinción teórico de la secuencia de la nanocuerpos era 21.555 M
-1 · cm
-1, y la absorbancia a 280 nm se midió para calcular la concentración de anticuerpo de acuerdo con la fórmula "= absorbancia ε ( coeficiente de extinción, H
-1 · cm
-1) X longitud de recorrido (cm) x concentración (M) ". Un kit de cuantificación biotina (Pierce /Thermo Scientific) se utilizó para calcular las concentraciones de biotina en las muestras y generar la relación de conjugación de biotina /anticuerpo
Validación de la afinidad nanocuerpos a través de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)
Para obtener la afinidad de la nanocuerpos biotinilado, se utilizó un ELISA competitivo estándar. Cada pocillo de una placa de microtitulación se revistió con antígeno PSMA 1 mM recombinante, se bloquearon con albúmina de suero bovino 3% -PBST (BSA) a temperatura ambiente durante 2 h y luego se enjuaga tres veces con PBST. A continuación, 1 nM nanocuerpos biotinilado se incubó con concentraciones crecientes de antígeno a concentraciones que varían de 0,1 nM a 100 mM en tubos Eppendorf paralelas. Después de 30 minutos de incubación, 90 l de las mezclas de reacción se aplicaron a los pocillos de la placa de microtitulación recubiertos de antígeno. Después de 10 min de incubación, las mezclas se desecharon, y los pocillos se lavaron con PBST. A continuación, 100 l de HRP-estreptavidina conjugada con biotina (Century Kangwei, Beijing, China) a una 1: Se añadió la dilución 2000 a cada pocillo, seguido de incubación a 37 ° C durante 1 h. Entonces, cada pocillo se enjuaga 5 veces con PBST antes de añadir 100 l /pocillo de una 3,3 ', 5,5'-tetrametilbencidina (TMB) solución de trabajo (Beyotime, Shanghai, China) e incubando la placa a temperatura ambiente durante 15 min . Las reacciones se terminaron mediante la adición de 50 l de una solución de ácido sulfúrico 2 M a cada pocillo. La absorbancia a 450 nm se determinó posteriormente para cada pocillo. Por lo tanto, la más alta densidad óptica (OD)
450 nm debería haber sido observado a bajas concentraciones de antígeno. La concentración de antígeno en que se detecta la señal de ELISA mitad de la máxima corresponde a la constante de disociación K
D.
Preparación y validación de nanoburbujas dirigidos
Las mezclas que contienen proporciones específicas de fosfatidil dipalmitoil colina (DPPC; Genzyme Pharmaceuticals, Bromma, Suecia), biotina etanolamina diestearoılo fosfatidilcolina (Bio-DSPE; Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL, EE.UU.) y difenilfosforilazida (DPPA; lipoidea GmbH, Ludwigshafen, Alemania) y se pesaron liofilizado utilizando un secador por congelación (liofilización Shanghai Pudong Equipment Co., Shanghai, china). Las alícuotas de estas mezclas se colocaron en viales; octafluoropropano (C
3F
8) se inyectó lentamente gas para reemplazar las colchonetas de aire en los viales. Antes de usar, una solución mixta de 1 parte de glicerol: se añadió 9 partes de PBS al vial seguido por calentamiento a 37 ° C para facilitar la solubilización. Las preparaciones se mezclan horizontalmente de manera inversa usando un amalgamador serie ST (AT & amp; M Biomateriales Co., LTD, Pekín, China) con los siguientes parámetros de trabajo específicos: la frecuencia de vibración, ≥4500 /min; amplitud de la vibración, 15 ± 1 mm y la duración de la vibración, 60 s [8]. Estas preparaciones se dejaron posteriormente para descansar a 4 ° C para facilitar la separación de fases. La suspensión lechosa-fase inferior se centrifugó a 300 rpm durante 3 min para separar las nanoburbujas biotinilados en la parte inferior de las microburbujas en la parte superior. A continuación, se añadieron 3 g de avidina por 10
7 nanoburbujas, seguido de incubación a 4 ° C durante 1 h. Las preparaciones se dejaron en reposo para facilitar la separación de fases; la capa superior se recogió posteriormente y se centrifugó a 300 rpm durante 3 min. La muestra se enjuagó tres veces para eliminar la avidina excesiva. A continuación, se añadió 1 l de nanocuerpos biotinilado por 10
7 nanoburbujas, seguido de incubación, centrifugación y lavado para eliminar el exceso nanocuerpos biotinilado. Los nanoburbujas resultantes se designaron las NBS selectivas, mientras que nanoburbujas sin suplementación de anticuerpos fueron designados los RN en blanco. Los tamaños de partícula de los 2 productos se analizaron en un analizador de ZS90 nano Malvern Zetasizer (Malvern Instruments Ltd., Malvern, Reino Unido), y se utilizó una cámara de recuento para determinar las concentraciones de los 2 productos. su
in vitro
efectos de imagen en las diferentes concentraciones se investigaron con un modelo de agarosa bajo la condición de un índice mecanismo de 0,12 y una ganancia de 60%.
Para investigar si este método podría ser utilizado para fijar nanocuerpos biotinilado a las nanoburbujas, NBS en blanco o específicas, se incubaron con un anticuerpo anti-His de ratón durante 1 h, seguido de centrifugación, lavado y la incubación en la oscuridad con un isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado con anticuerpo anti-ratón de cabra durante 3 horas a 4 ° C. Las muestras se centrifugaron y se lavaron para eliminar el anticuerpo secundario no unido. Las muestras fueron observadas bajo un microscopio de fluorescencia (Olympus Corporation, Tokio, Japón) para evaluar la unión fluorescente.
nanoburbujas y el
in vitro de células
ensayo de unión
LNCaP en , se centrifugaron las células C4-2 y MKN45 crecido hasta la fase logarítmica y se sembraron en cubreobjetos en los pocillos de una placa de 24 pocillos a una densidad de 1,5 x 10
4 células /pocillo. Las células se cultivaron durante la noche, se fijaron con 4% de paraformaldehído y se enjuagaron tres veces con PBS. Se prepararon dos grupos de cubreobjetos según el tipo de célula; 1 grupo se complementó con 30 l de NBS específica (1,0 x10
8 /mL) y el otro con NBS en blanco, después de lo cual las mezclas se incubaron a 4 ° C durante 3 h. Posteriormente, los cubreobjetos se lavaron tres veces con PBS, se colocan boca abajo sobre portaobjetos y se observaron bajo un microscopio óptico (Olympus Corporation) para examinar los nanoburbujas. El porcentaje de adhesión, que se define como el porcentaje de células marcadas con ≥4 nanoburbujas específicas en un campo aleatorio dado, se calculó para indicar la unión. Este experimento se repitió 4 veces.
Nanobubble de formación de imágenes en diferentes xenoinjertos
células de cáncer de próstata LNCaP de la fase logarítmica y células C4-2 se usaron para preparar suspensiones de células a una densidad de 5 × 10
7 células /ml; Células MKN45 de cáncer gástrico en crecimiento en fase logarítmica se usaron para preparar suspensiones de células de 1 x 10
7 células /mL. Doscientos microlitros de cada suspensión de células se mezclaron a continuación con 200 l de Matrigel BD (BD Biosciences, EE.UU.); las mezclas resultantes se inocularon por vía subcutánea en ratones desnudos macho de 4-5 semanas de edad BALB /c-nu con un peso corporal de 18-20 g. Cinco animales fueron utilizados para cada tipo de tumor de xenoinjerto. Los xenoinjertos se controlaron diariamente con un calibrador vernier hasta que los tumores alcanzaron un diámetro aproximado de 1 cm.
Tumor-teniendo ratones desnudos se anestesiaron mediante pentobarbital de sodio 1% administrado por vía intraperitoneal. Para formación de imágenes, las superficies de ambos la sonda y el tumor se cubrieron con un agente de acoplamiento de espesor 5 mm. A 50 mm L12-5 banda ancha sonda de ultrasonido lineal conectado a un sistema de ultrasonido iU22 (Philips, Ámsterdam, Países Bajos) fue utilizado para realizar ultrasonido modo B de imágenes de los xenoinjertos. Una vez que la sección transversal de un xenotrasplante se revela plenamente, la sonda se inmovilizó para permitir configuración del modo de ecografía (índice mecánico, 0,12; ganancia, 90%). La ecografía se inició cuando el centro focal se coloca en el centro del tumor. Cada animal de ensayo recibió 200 l blanco o Targeted NBS (3 × 10
7) a través de la inyección de partículas vena de la cola, después de lo cual la tubería se barrió con 100 l de solución salina. Las imágenes dinámicas se recogieron hasta que el área del tumor fue completamente libre de NBS. Además, 200 l de una cantidad equivalente de otro tipo de nanoburbujas y 100 l de solución salina se administró de una manera similar para facilitar la ecografía en condiciones idénticas; los datos de las imágenes recogidas de los mismos ratones desnudos fueron analizados utilizando el software Qlab8.1 (Philips) para comparar los 4 parámetros de imagen (tiempo de llegada, tiempo de pico, pico de intensidad y mayor duración) en la zona de xenoinjertos con los 2 agentes de contraste. El tiempo de llegada se define como el intervalo de finalización de la inyección y el primer punto de tiempo en el que se alcanzó 10% de intensidad pico. duración mejorada se define como el intervalo entre los 2 puntos de tiempo en el que se alcanzó 10% de intensidad pico. tiempo de pico se define como el intervalo entre el tiempo de inyección y el momento de pico de intensidad [18].
Los análisis estadísticos
Paquete Estadístico para Ciencias Sociales (SPSS) de software 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.) se utilizó para realizar los análisis estadísticos. Todos los datos cuantitativos se expresan como media ± desviación estándar. La ecografía datos de los indicadores en blanco NB NB Targeted y en el
in vitro Opiniones y en
in vivo
imagings se obtuvieron y analizaron usando un ensayo T de muestras pareadas. Los indicadores de ultrasonido de nanoburbujas que dirigen los 3 tipos de xenoinjerto se analizaron mediante un análisis de varianza (ANOVA). Un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Histogramas y la curva con la regresión no lineal se representaron utilizando GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE.UU.).
Resultados
PSMA expresión en diferentes líneas celulares y la preparación de la nanocuerpos PSMA específica
transferencia de Western se utilizó para examinar la expresión de PSMA en células LNCaP, C4-2 y MKN45. Los resultados mostraron que entre estas líneas celulares, las células LNCaP expresan el mayor nivel de PSMA, seguido de C4-2 células; células de cáncer gástrico MKN45 mostraron ninguna expresión de PSMA aparente (figura 1).
células LNCaP expresan un mayor nivel de PSMA que las células C4-2, mientras que MKN45 células no mostraban expresión.
el clon de fago seleccionado a través de panning procariota se utilizó para la expresión recombinante y facilitó la adquisición de Su-etiquetados nanocuerpos-PSMA específica (peso molecular, 18 kD). Después de biotinilación la nanocuerpos, espectrometría de UV se realizó para revelar que la concentración de anticuerpo fue de 0,59 mg /ml y la relación de conjugación de biotina /nanocuerpos era aproximadamente 3,6: 1 de acuerdo con un kit de biotina cuantificación. Con base en el principio de unión competitiva, la constante de disociación es igual a la concentración al valor mitad de la máxima en ELISA. Por lo tanto, la K
D de nanocuerpos biotinilado contra PSMA recombinante fue 519 nM, mientras que la regresión no lineal tenía un buen ajuste con R
2 = 0,978 (Fig 2).
La curva con regresión no lineal de la concentración de recombint PSMA que van desde 0,1 nM a 100 mM se obbtained.
Targeted Caracterización por microscopía de fluorescencia NB
los nanoburbujas y nanocuerpos biotinilado se conjugaron con estreptavidina biotina. Un microscopio óptico y un analizador ZS90 nano Malvern Zetasizer fueron utilizados para estudiar las morfologías y diámetros de las NBS selectivas y NBS en blanco y reveló que ambos exhibieron formas esféricas regulares, y la preparación NB Targeted tenía un diámetro promedio de 487.60 ± 33.55 nm, mientras que la preparación NB blanco tenía un diámetro medio de 445,30 ± 32,96 nm; su
in vitro
efectos de imagen, es decir, las señales de ultrasonido, no presentaron diferencias en la misma concentración (p = 0,06, Figura 3). La inmunofluorescencia reveló más tarde que el BNE dirigidos emiten señales de fluorescencia verde bajo el microscopio (Figura 4). En contraste, los nanoburbujas en blanco, que no se marcaron con nanocuerpos biotinilado, no muestran una señal de fluorescencia aparente, lo que indica que los nanoburbujas unido específicamente la nanocuerpos a través de interacciones de biotina-avidina.
A Zetasizer Malvern analizador se utilizó para examinar los tamaños de las partículas. NBS en blanco (sin nanocuerpos biotinilado) tenían un diámetro medio de 445,30 ± 32,96 nm (A), mientras que Targeted NBS (con nanocuerpos biotinilado) tenía un diámetro medio de 487,6 ± 33,55 nm (B). Y no hay ninguna diferencia en su
in vitro
imágenes in en la misma concentración (C).
La observación microscópica de la NBS específica (A y B). Las estructuras de anillo, con membranas gruesas son NBS (B). Los resultados demostraron que los RN precisa se podría incorporar específicamente nanocuerpos a través de interacciones biotina-avidina.
La unión de nanoburbujas dirigidos a células
unión se examinó mediante microscopía Cell-nanobubble (figura 5). Los nanoburbujas dirigidos adheridas mejor a las células LNCaP, cada uno de los cuales reclutaron un promedio de 7,27 ± 1,70 nanoburbujas para producir un porcentaje de adhesión de 98,00 ± 2,31%, seguido de C4-2 células, cada una de las cuales reclutados 5,67 ± 1,61 nanoburbujas para producir una porcentaje de adhesión de 92,00 ± 8,64%. En contraste, no se observó unión significativa entre las nanoburbujas y células MKN45, con una frecuencia de unión de 0,72 ± 0,87 nanoburbujas por célula. Por último, sin aparente unión fue identificado entre los RN en blanco y cada uno de los 3 tipos de células, como se evidencia por los correspondientes números de unión de 0,74 ± 0,92, 0,65 ± 0,95 y 0,68 ± 0,94 por célula, respectivamente.
bajo un microscopio de luz, tanto en células LNCaP y células C4-2 unidos de forma visible para los RN específica (a y B), mientras que las células MKN45 no se unieron a los RN específica (C). Ninguno de los 3 tipos de células representada prominente unión a RN en blanco (D, E y F). Escala, 5 micras.
xenoinjerto de imágenes de ultrasonido
software Qlab8.1 se utilizó para analizar y comparar los indicadores de diagnóstico por imágenes (hora de llegada, tiempo de pico, pico de intensidad y mayor duración) de el BNE selectivas y NBS en blanco en los grupos de xenoinjertos 3 (figura 6 y en la Tabla 1). En los xenoinjertos de cáncer de próstata (LNCaP y C4-2), los resultados revelaron que los valores de intensidad de pico (valores de p, 0,003 y 0,002, respectivamente) y mejorar las duraciones (valores de p, 0,001 y 0,004, respectivamente) de las NBS selectivas fueron significativamente más alto y más largo, respectivamente, que en los RN en blanco. Sin embargo, los tiempos de llegada y los tiempos de pico fueron indistinguibles entre los 2 tipos de nanoburbujas. En el grupo de control de xenoinjertos de cáncer gástrico MKN45, el BNE apuntado en blanco y RN no mostraron diferencias claras con respecto a los 4 indicadores. Una comparación de los 3 tipos de xenoinjertos con respecto a las propiedades de formación de imágenes dirigidos nanobubble reveló que los xenoinjertos C4-2 mostraron significativamente diferentes valores de pico de intensidad, duración mejoradas, los tiempos de llegada y los tiempos de los picos en comparación los xenoinjertos MKN45, con respectivos valores de p de 0,024, 0.007, 0.000 y 0.050. Por otra parte, los xenoinjertos de LNCaP también muestran los tiempos de llegada y los valores de pico significativamente diferente en comparación con los de MKN45 xenoinjertos (valores de p de 0,000 para ambos), aunque los 2 indicadores restantes no fueron significativamente diferentes. Por lo tanto, el uso de ultrasonografía con NBS apuntado, tanto en las células de cáncer de próstata LNCaP dependientes de andrógenos y células C4-2 independientes de andrógenos que se manifiesta mayores valores de pico y tiempos de llegada más tarde que el control xenoinjertos de cáncer gástrico. Por otra parte, cuando se compararon los xenoinjertos de LNCaP y C4-2, el tiempo de llegada (P = 0,026), tiempo de pico (P = 0,005) y el valor pico (P = 0,008) difirió significativamente mayor que la duración no fue significativamente diferente (P = 0,261). Sin embargo, las pequeñas diferencias (sólo menos de un segundo) en la hora de llegada y el tiempo para alcanzar su punto máximo entre dos tumores o dos tipos de agentes de contraste no son fáciles de observar, por lo que la duración del valor de pico y la imagen debe ser el foco de mayor preocupación .
los paneles B, e y G muestran las clásicas secciones transversales de 3 tipos de xenoinjertos bajo la ecografía en modo B. Los paneles A, D y H muestran la unión de RN en blanco a los xenoinjertos en el momento de mayor intensidad. Los paneles C, F e I muestran la unión de RN dirigidas a los xenoinjertos en el momento de mayor intensidad. Las imágenes ecográficas, tanto en el xenoinjertos LNCaP y C4-2 revelaron que la intensidad de imagen era aparentemente mayor que la intensidad de imagen lograda con el BNE en blanco al nivel de pico nanobubble. En los xenoinjertos MKN45, los resultados de las imágenes de las NBS selectivas y NBS en blanco fueron comparables a nivel pico nanobubble. De todas, las áreas azules representan los exnografts, mientras que las áreas rojas y amarillas representan, respectivamente, las diferentes áreas de imagen en LNCaP y C4-2 exnografts.
Discusión
En la actualidad, la próstata el cáncer es común y compromete gravemente la salud de los hombres de edad avanzada, a menudo conduce a la muerte [19,20]. Aunque la ecografía transrectal se ha convertido en una herramienta de examen de rutina que juega un papel importante en la biopsia de la enfermedad, la vigilancia y el tratamiento, los estudios clínicos han puesto de manifiesto que este procedimiento está limitada por la insuficiente sensibilidad y especificidad [21-23]. El campo emergente de la ecografía molecular integra la ecografía, la biología molecular y otras disciplinas e introduce así una nueva vía por la que para diagnosticar y tratar tumores; También ofrece la posibilidad de formación de imágenes específico del cáncer de próstata en un nivel molecular y diagnósticos tempranos correspondientes [24]. En la actualidad, la construcción y el diseño de microburbujas de cáncer de próstata orientada han centrado principalmente en moléculas diana implicados en la angiogénesis, incluyendo microburbujas dirigidas que llevan 2 de anticuerpos factor de crecimiento vascular endotelial tipo de receptor (VEGFR2). Sin embargo, este diseño tiene 2 inconvenientes aparentes: i) los agentes de contraste sobre todo a escala micrométrica tienen poca permeabilidad y no pueden viajar a través de los vasos sanguíneos del tumor para entrar en los espacios intersticiales y, por tanto, las burbujas de segmentación no se adhieren directamente a las células del cáncer de próstata; ii) este método tiene una especificidad baja que conduce a una incapacidad para llevar a cabo formación de imágenes de tejido de cáncer prostático específico [25]. El esfuerzo de los tumores EPR hace teóricamente posible el uso de nanoburbujas en imágenes moleculares de las células de la matriz y del parénquima tumoral extravasculares tumorales. Anteriormente, utilizando microscopía óptica y electrónica, hemos demostrado que nanoburbujas con un diámetro promedio de 435.20 ± 60.53 nm podrían pasar a través de los huecos del endotelio vascular en xenoinjertos, proporcionando así una base experimental en la que para lograr la imagen específica de las estructuras tumorales extravascular [26]. Mientras tanto, este método también aprovecha al máximo algunos de los atributos de nanoburbujas, tales como el área superficial relativamente grande, fuerte capacidad de adhesión y la imagen de larga duración
in vivo
.
PSMA es una próstata biomarcadores de cáncer con una mayor especificidad y sensibilidad que otras moléculas similares. PSMA es particularmente altamente expresado en cánceres de próstata refractario a las hormonas y las metástasis del cáncer de próstata [27]. Además, la región extracelular de PSMA, que comprende 707 aminoácidos, tiene capacidad para múltiples epítopos antigénicos. Por lo tanto, PSMA se ha convertido en un foco de investigación con respecto a las terapias tumorales inmunes específicos y desde imágenes de tumores molecular [28,29]. Sanna
et al
. conjugado del inhibidor de PSMA a base de urea DCL al componente de envoltura de microburbujas poli (láctico-co-glicólico glicol ácido-polietileno (PLGA-PEG), generando de este modo un agente de contraste de ultrasonido específico que se utilizará para células de cáncer de próstata evaluaciones de unión
en vitro
[30]. en nuestro estudio anterior, el anticuerpo monoclonal aprobado era inmunogénica, que, en conjunción con los grandes pesos moleculares de los complejos de anticuerpo-paticle, condujo a la penetración del tejido pobre. en consecuencia, después de la administración venosa, la concentración en el área de orientación fue baja. Este problema limita severamente la mayor aplicación clínica de microburbujas de modalidades de diagnóstico y de formación de imágenes dirigidos. Alternativamente, los péptidos de molécula pequeña específicos se utilizan a menudo en los estudios de imagen molecular. Aunque estos compuestos se sintetizan fácilmente y tienen pesos moleculares bajos , altos niveles de infiltración de tejidos y baja inmunogenicidad, también exhiben problemas tales como vidas medias cortas (la propensión a la hidrólisis y el aclaramiento renal) y afinidades volátiles, que dañan significativamente la estabilidad de nanoburbujas dirigidos péptido corto-cojinete. Por el contrario, nanocuerpos son muy estables y exhiben afinidades altas de antígeno. Por otra parte, tienen muy baja inmunogenicidad, como se evidencia por los resultados experimentales de los animales en los que no se detectaron respuestas inmunitarias humorales o celulares después de la administración repetida [31]. Por lo tanto, las diversas propiedades de nanocuerpos han proporcionado pruebas convincentes en cuanto a la viabilidad de la orientación y la concentración nanoburbujas dentro de los tejidos diana
in vivo
. Aunque nanocuerpos informes, se ha aplicado en los estudios de imagen molecular, incluyendo algunas aplicaciones en medicina nuclear molecular [32-34], la aplicación de esta tecnología en el campo de la ecografía se ha limitado a microburbujas de ultrasonido [35]; a nuestro entender, se han reportado pocas investigaciones con respecto a nanoburbujas nanocuerpos marcado en este campo.
Por lo tanto, se utilizó un sistema de biotina-avidina para integrar las ventajas de nanoburbujas y nanocuerpos mediante la generación de nanoburbujas que albergaban PSMA nanocuerpos.